一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法，本發(fā)明對固相萃取條件進行了優(yōu)化，使得固相萃取的時間縮短、效率變高，而高效液相色譜方法分析司帕沙星對映體的濃度精度高，速度快，操作簡單、成本較低；檢測方法對目標化合物的線性關(guān)系好，回收率高，相對偏差小，使用的試劑低毒，使用量少，對環(huán)境友好。
【專利說明】
一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種快速高效檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]司帕沙星對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、支原體、衣原體和軍團桿菌等都有很好的抑制作用，此外，司帕沙星還具有吸收良好、抑菌濃度低、抗菌活性高、不易產(chǎn)生耐藥菌、 低毒等優(yōu)點，目前已在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用。
[0003]目前手性藥物對映體的常用分離方法有結(jié)晶法、動力學方法、酶拆分法和色譜法等，這些方法應(yīng)用廣泛，促進了手性藥物的研究和發(fā)展。然而，這些方法也存在一些不足之處，如結(jié)晶法操作繁瑣、分離時間長、適用性窄，酶拆分法對酶的專一性有較高要求，分離成本較高，而色譜拆分法是目前應(yīng)用最廣泛的一種方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于為了解決現(xiàn)有結(jié)晶法檢測司帕沙星對映體成本高、分離時間長，適用性窄，操作復(fù)雜，精度不高的缺陷而提供一種快速、精度高，操作簡單、成本較低的檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法，包括以下步驟:1)用體積比90%:10%的異丙醇與正庚烷的混合物作為流動相將司帕沙星溶解并稀釋配置成40-50iig/mL的溶液，并用微孔濾膜過濾；2)取勻漿后的水產(chǎn)品置于離心管中，加入步驟1)配置的司帕沙星溶液，料液比為lg: 120-150mL，振蕩后加入無水硫酸銅及單乙醇胺，8000-12000rpm離心處理l〇-15min，取上清液，殘渣用單乙醇胺溶解并離心處理，合并上清液備用；3)在步驟2)的上清液中加入上清液體積2-3倍的正己烷溶液，靜置分層后棄正己烷層， 將剩余溶液過柱萃取，萃取完成后用去離子水淋洗，負壓抽干，分2-5次洗脫，洗脫后的溶液在氮吹儀內(nèi)于30_35°C水浴中，氮氣吹干，殘余物用乙醇復(fù)溶，微孔納濾，濾液備用；4)采用高效液相色譜儀對步驟3)得到的濾液進行檢測;檢測時選用CHIRALCEL 0D-H手性柱，該手性柱的填料為5y硅膠表面涂布纖維素-L-異亮氨酸。在本技術(shù)方案中，本發(fā)明所用的萃取方法效果好，時間短，降低了試劑的消耗量。
[0006]作為優(yōu)選，步驟3)中，依次用甲醇、二對甲苯甲酰-1-酒石酸，含檸檬酸鐵銨的水楊酸水溶液活化HLB固相萃取柱。
[0007]作為優(yōu)選，水楊酸水溶液中水楊酸的質(zhì)量分數(shù)為5-6.5%，檸檬酸鐵銨的質(zhì)量分數(shù)為0.4-0.7%。
[0008]作為優(yōu)選，步驟3)洗脫液為含體積分數(shù)15%的甲醇溶液，過柱的流速為6-9mL/ min，洗脫液流速為1.2-1.5mL/min。
[0009]作為優(yōu)選，纖維素-L-異亮氨酸的制備方法為:將纖維素纖維放入45_55°C的質(zhì)量分數(shù)為25-30%的氫氧化鉀溶液中，然后加入纖維素纖維質(zhì)量2倍的環(huán)氧季銨鹽化合物和纖維素纖維質(zhì)量5倍陽離子聚丙烯酰胺類化合物，55-85kw的功率下超聲處理20-30min，然后升溫至150°C，加入纖維素纖維質(zhì)量10倍的L-異亮氨酸，反應(yīng)2-4h，冷卻后水洗，用醋酸中和至中性。
[0010]作為優(yōu)選，纖維素纖維為粘膠纖維或棉纖維。
[0011]作為優(yōu)選，無水硫酸銅的加入量為水產(chǎn)品的質(zhì)量的3倍，單乙醇胺的加入量為lg水產(chǎn)品加入20mL。[〇〇12]作為優(yōu)選，高效液相色譜的條件為:色譜柱:CHIRALCEL 0D-H;流動相:正己烷-乙醇(20:80，v/v，乙醇中含有體積比為0.4 %的冰乙酸和0.5 %的三乙胺)；流速:0.7mL/min; 檢測波長:294nm;進樣量:20yL;柱溫:25 °C 〇
[0013]本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明對固相萃取條件進行了優(yōu)化，使得固相萃取的時間縮短、效率變高，而高效液相色譜方法分析司帕沙星對映體的濃度精度高，速度快，操作簡單、 成本較低;檢測方法對目標化合物的線性關(guān)系好，回收率高，相對偏差小，使用的試劑低毒， 使用量少，對環(huán)境友好?！靖綀D說明】
[0014]圖1為實施例1的色譜圖。[0〇15]圖中，1為左司帕沙星;2為右司帕沙星。【具體實施方式】
[0016]下面通過【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步的描述。
[0017]在本發(fā)明中，若非特指，所有設(shè)備和原料均可從市場購得或是本行業(yè)常用的，下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。
[0018]高效液相色譜儀Agilent 1200購自安捷倫(中國)科技有限公司；水浴氮吹儀WD-12購自河南天馳儀器設(shè)備有限公司；固相萃取儀HSE-12B購自天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；固相萃取柱Waters Oasis HLB購自杭州伽鈦科學儀器有限公司；冰乙酸(分析純)、三乙胺(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司；司帕沙星購自大賽璐藥物手性技術(shù)(上海)有限公司。[〇〇19] 高效液相色譜的條件為:色譜柱:CHIRALCEL 0D-H;流動相:正己烷-乙醇(20:80， v/v，乙醇中含有體積比為0.4%的冰乙酸和0.5%的三乙胺)；流速:0.7mL/min;檢測波長: 294nm;進樣量:20yL;柱溫:25 °C 〇
[0020] 實施例1一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法，包括以下步驟:1)用體積比90%:10%的異丙醇與正庚烷的混合物作為流動相將司帕沙星溶解并稀釋配置成50yg/mL的溶液，并用微孔濾膜過濾；2)取勻漿后的水產(chǎn)品置于離心管中，加入步驟1)配置的司帕沙星溶液，料液比為lg: 150mL，振蕩后加入無水硫酸銅及單乙醇胺，12000rpm離心處理15min，取上清液，殘渣用單乙醇胺溶解并離心處理，合并上清液備用;無水硫酸銅的加入量為水產(chǎn)品的質(zhì)量的3倍，單乙醇胺的加入量為lg水產(chǎn)品加入20mL;3)在步驟2)的上清液中加入上清液體積3倍的正己烷溶液，靜置分層后棄正己烷層，將剩余溶液過柱萃取，萃取完成后用去離子水淋洗，負壓抽干，分5次洗脫，洗脫液為含體積分數(shù)15%的甲醇溶液，洗脫液流速為1.5mL/min，洗脫后的溶液在氮吹儀內(nèi)于35°C水浴中，氮氣吹干，殘余物用乙醇復(fù)溶，微孔納濾，濾液備用；依次用甲醇、二對甲苯甲酰-L-酒石酸，含檸檬酸鐵銨的水楊酸水溶液活化HLB固相萃取柱；水楊酸水溶液中水楊酸的質(zhì)量分數(shù)為 6.5%，檸檬酸鐵銨的質(zhì)量分數(shù)為0.7% ;過柱的流速為9mL/min;4)采用高效液相色譜儀對步驟3)得到的濾液進行檢測;檢測時選用CHIRALCEL OD-H手性柱，該手性柱的填料為5y硅膠表面涂布纖維素-L-異亮氨酸。
[0021]纖維素-L-異亮氨酸的制備方法為:將粘膠纖維或棉纖維放入55°C的質(zhì)量分數(shù)為 30%的氫氧化鉀溶液中，然后加入纖維素纖維質(zhì)量2倍的環(huán)氧季銨鹽化合物和纖維素纖維質(zhì)量5倍陽離子聚丙烯酰胺類化合物，85kw的功率下超聲處理30min，然后升溫至150°C，加入纖維素纖維質(zhì)量10倍的L-異亮氨酸，反應(yīng)4h，冷卻后水洗，用醋酸中和至中性。[〇〇22] 實施例2一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法，包括以下步驟:1)用體積比90%:10%的異丙醇與正庚烷的混合物作為流動相將司帕沙星溶解并稀釋配置成40yg/mL的溶液，并用微孔濾膜過濾；2)取勻漿后的水產(chǎn)品置于離心管中，加入步驟1)配置的司帕沙星溶液，料液比為lg: 120mL，振蕩后加入無水硫酸銅及單乙醇胺，8000rpm離心處理lOmin，取上清液，殘渣用單乙醇胺溶解并離心處理，合并上清液備用;無水硫酸銅的加入量為水產(chǎn)品的質(zhì)量的3倍，單乙醇胺的加入量為lg水產(chǎn)品加入20mL;3)在步驟2)的上清液中加入上清液體積2倍的正己烷溶液，靜置分層后棄正己烷層，將剩余溶液過柱萃取，萃取完成后用去離子水淋洗，負壓抽干，分2次洗脫，洗脫液為含體積分數(shù)15%的甲醇溶液，洗脫液流速為1.2mL/min，洗脫后的溶液在氮吹儀內(nèi)于30°C水浴中，氮氣吹干，殘余物用乙醇復(fù)溶，微孔納濾，濾液備用；依次用甲醇、二對甲苯甲酰-L-酒石酸，含檸檬酸鐵銨的水楊酸水溶液活化HLB固相萃取柱；水楊酸水溶液中水楊酸的質(zhì)量分數(shù)為 5%，檸檬酸鐵銨的質(zhì)量分數(shù)為0.4% ;過柱的流速為6mL/min;4)采用高效液相色譜儀對步驟3)得到的濾液進行檢測;檢測時選用CHIRALCEL OD-H手性柱，該手性柱的填料為5y硅膠表面涂布纖維素-L-異亮氨酸。[〇〇23]纖維素-L-異亮氨酸的制備方法為:將粘膠纖維或棉纖維放入45°C的質(zhì)量分數(shù)為 25%的氫氧化鉀溶液中，然后加入纖維素纖維質(zhì)量2倍的環(huán)氧季銨鹽化合物和纖維素纖維質(zhì)量5倍陽離子聚丙烯酰胺類化合物，55kw的功率下超聲處理20min，然后升溫至150°C，加入纖維素纖維質(zhì)量10倍的L-異亮氨酸，反應(yīng)2h，冷卻后水洗，用醋酸中和至中性。[〇〇24] 實施例3一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法，包括以下步驟:1)用體積比90%:10%的異丙醇與正庚烷的混合物作為流動相將司帕沙星溶解并稀釋配置成45iig/mL的溶液，并用微孔濾膜過濾；2)取勻漿后的水產(chǎn)品置于離心管中，加入步驟1)配置的司帕沙星溶液，料液比為lg: 130mL，振蕩后加入無水硫酸銅及單乙醇胺，9000rpm離心處理12min，取上清液，殘渣用單乙醇胺溶解并離心處理，合并上清液備用;無水硫酸銅的加入量為水產(chǎn)品的質(zhì)量的3倍，單乙醇胺的加入量為lg水產(chǎn)品加入20mL;3)在步驟2)的上清液中加入上清液體積3倍的正己烷溶液，靜置分層后棄正己烷層，將剩余溶液過柱萃取，萃取完成后用去離子水淋洗，負壓抽干，分3次洗脫，洗脫液為含體積分數(shù)15%的甲醇溶液，洗脫液流速為1.3mL/min，洗脫后的溶液在氮吹儀內(nèi)于33°C水浴中，氮氣吹干，殘余物用乙醇復(fù)溶，微孔納濾，濾液備用；依次用甲醇、二對甲苯甲酰-L-酒石酸，含檸檬酸鐵銨的水楊酸水溶液活化HLB固相萃取柱；水楊酸水溶液中水楊酸的質(zhì)量分數(shù)為 5.4%，檸檬酸鐵銨的質(zhì)量分數(shù)為0.5% ;過柱的流速為7mL/min;4)采用高效液相色譜儀對步驟3)得到的濾液進行檢測;檢測時選用CHIRALCEL OD-H手性柱，該手性柱的填料為5y硅膠表面涂布纖維素-L-異亮氨酸。[〇〇25]纖維素-L-異亮氨酸的制備方法為:將粘膠纖維或棉纖維放入50°C的質(zhì)量分數(shù)為 28%的氫氧化鉀溶液中，然后加入纖維素纖維質(zhì)量2倍的環(huán)氧季銨鹽化合物和纖維素纖維質(zhì)量5倍陽離子聚丙烯酰胺類化合物，65kw的功率下超聲處理24min，然后升溫至150°C，加入纖維素纖維質(zhì)量10倍的L-異亮氨酸，反應(yīng)3h，冷卻后水洗，用醋酸中和至中性。[〇〇26] 分別稱取lmg左司帕沙星、右司帕沙星，置于100mL容量瓶中，用空白海水定容，超聲搖勻后，實施例1的步驟經(jīng)高效液相色譜儀檢測后，所得色譜圖示于圖1。[〇〇27]司帕沙星對映體濃度在0.04mg/L-10mg/L范圍內(nèi)與其響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系。 以X表示濃度，Y表示司帕沙星對映體峰面積，左司帕沙星和右司帕沙星的回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為7=113.93叉-7.2217、1?2 = 0.9994及7 = 117.71叉-9.9342、1?2 = 0.9998。在空白海水中添加0.lmg/L、5mg/L和15mg/L這3個濃度的司帕沙星標準溶液，按本方法進行回收率實驗。每個添加濃度平行操作3次，計算回收率和精密度，左司帕沙星及右司帕沙星的樣品平均回收率分別為88.53 %和89.26%，日間精密度分別為分別為5.71 %和4.25%，定量限均為0?04mg/L。
【主權(quán)項】
1.一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法，其特征在于，包括以下步驟:1)用體積比90%:10%的異丙醇與正庚烷的混合物作為流動相將司帕沙星溶解并稀釋 配置成40-50iig/mL的溶液，并用微孔濾膜過濾；2)取勻漿后的水產(chǎn)品置于離心管中，加入步驟1)配置的司帕沙星溶液，料液比為lg: 120-150mL，振蕩后加入無水硫酸銅及單乙醇胺，8000-12000rpm離心處理l〇-15min，取上清 液，殘渣用單乙醇胺溶解并離心處理，合并上清液備用；3)在步驟2)的上清液中加入上清液體積2-3倍的正己烷溶液，靜置分層后棄正己烷層， 將剩余溶液過柱萃取，萃取完成后用去離子水淋洗，負壓抽干，分2-5次洗脫，洗脫后的溶液 在氮吹儀內(nèi)于30_35°C水浴中，氮氣吹干，殘余物用乙醇復(fù)溶，微孔納濾，濾液備用；4)采用高效液相色譜儀對步驟3)得到的濾液進行檢測;檢測時選用CHIRALCEL OD-H手 性柱，該手性柱的填料為5y硅膠表面涂布纖維素-L-異亮氨酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法，其特征在于，步驟 3)中，依次用甲醇、二對甲苯甲酰-1-酒石酸，含檸檬酸鐵銨的水楊酸水溶液活化HLB固相萃 取柱。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法，其特征在于，水楊 酸水溶液中水楊酸的質(zhì)量分數(shù)為5-6.5%，檸檬酸鐵銨的質(zhì)量分數(shù)為0.4-0.7%。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法，其特征在于， 步驟3)洗脫液為含體積分數(shù)15 %的甲醇溶液，過柱的流速為6-9mL/min，洗脫液流速為1.2-1?5mL/min〇5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法，其特征在 于，纖維素-L-異亮氨酸的制備方法為:將纖維素纖維放入45-55 °C的質(zhì)量分數(shù)為25-30 %的 氫氧化鉀溶液中，然后加入纖維素纖維質(zhì)量2倍的環(huán)氧季銨鹽化合物和纖維素纖維質(zhì)量5倍 陽離子聚丙烯酰胺類化合物，55-85kw的功率下超聲處理20-30min，然后升溫至150°C，加入 纖維素纖維質(zhì)量10倍的L-異亮氨酸，反應(yīng)2-4h，冷卻后水洗，用醋酸中和至中性。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法，其特征在于，纖維 素纖維為粘膠纖維或棉纖維。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法，其特征在 于，無水硫酸銅的加入量為水產(chǎn)品的質(zhì)量的3倍，單乙醇胺的加入量為1 g水產(chǎn)品加入20mL。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種檢測水產(chǎn)品中司帕沙星對映體的方法，其特征在 于，高效液相色譜的條件為:色譜柱:CHIRALCEL OD-H;流動相:正己烷-乙醇(20:80，v/v，乙 醇中含有體積比為〇.4%的冰乙酸和0.5%的三乙胺)；流速:0.7mL/min;檢測波長:294nm; 進樣量:20yL;柱溫:25°C。
【文檔編號】G01N30/02GK106053647SQ201610394920
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月5日
【發(fā)明人】歐陽小琨, 金如娜, 楊立業(yè), 王陽光, 王艷飛, 盧嬌
【申請人】浙江海洋大學