一種檢測小鵝瘟病毒的試紙條的制作方法
【專利摘要】一種快速檢測小鵝瘟病毒抗體的試紙條，包括支撐層，支撐層一端粘貼樣品吸附纖維層，另一端粘貼吸水層，在支撐層的吸附纖維層與吸水層之間的部分粘貼纖維素膜層與金標纖維層，吸附纖維層、金標纖維層、纖維素膜層、吸水層之間彼此拼接的交界處纖維互相交叉滲透。本實用新型至少包含如下有益效果：（1）本實用新型根據(jù)ELISA的基本原理，用免疫層析試紙檢測病毒，利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細管作用，將抗原?抗體反應由ELISA的傳統(tǒng)液相環(huán)境轉(zhuǎn)到固相濾膜上快速進行，并采用膠體金印跡代替酶印跡，憑肉眼直接觀察膠體金的顯色狀況，即時獲得檢測結(jié)果，因此該方法比ELISA等血清學方法更為簡便、快速。（2）檢測特異性強，敏感性高。
【專利說明】
一種檢測小鵝瘟病毒的試紙條
技術領域
[0001]本實用新型涉及一種檢測小鵝瘟病毒的器具，特別是涉及一種檢測小鵝瘟病毒的試紙條。
【背景技術】
[0002]小鸛痕病毒(gosling plague virus，GPV)，又稱鸛細小病毒，可引起雛鸛的一種急性或亞急性敗血癥小鸛痕(gosling plague，GP)，以發(fā)生滲出性腸炎為主要病理變化。本病主要侵害4-20日齡雛鵝，傳染快、病死率高。本病最早由我國學者方定一于1956年在我國揚州地區(qū)發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)大多數(shù)養(yǎng)鵝省區(qū)均有發(fā)生，給養(yǎng)鵝業(yè)造成重要經(jīng)濟損失。
[0003]及時、快速診斷GP，是有效控制GP的前提。目前GP的診斷主要有常規(guī)實驗室檢測和分子生物學兩大類方法。常規(guī)方法主要有病毒分離鑒定和GPV抗體的血清學檢測，包括瓊脂免疫擴散試驗(AGP)、間接免疫熒光抗體試驗(IFA)、ELISA等方法。分子生物學方法主要有PCR和核酸探針技術等。但GPV的病毒分離培養(yǎng)、AGP、IFA、ELISA、PCR和核酸探針等檢測技術操作復雜，需要昂貴的儀器設備、過程較長、耗時費力，需要特定儀器設備和專業(yè)技術人員操作，很難在基層普及，不能滿足生產(chǎn)一線或疫病現(xiàn)場的快速診斷需要。因此，研究一種快速檢測小鵝瘟病毒感染的檢測技術非常重要而迫切。
【實用新型內(nèi)容】
[0004]本實用新型的一個目的是解決至少上述問題或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
[0005]本實用新型還有一個目的是提供了一種結(jié)果顯示直觀、準確、快速檢測腦脊髓炎的試紙條，與其他檢測方法相比，該試紙條特異性強、靈敏度高、操作簡便、結(jié)果顯示快速，檢測成本低廉。
[0006]為了實現(xiàn)根據(jù)本實用新型的這些目的和其它優(yōu)點，本實用新型提供的技術方案為:
[0007]—種快速檢測小鵝瘟病毒抗體的試紙條，包括支撐層，支撐層一端粘貼吸附纖維層，另一端粘貼吸水層，在支撐層的吸附纖維層與吸水層之間的部分粘貼纖維素膜層與金標纖維層，吸附纖維層、金標纖維層、纖維素膜層、吸水層之間彼此拼接的交界處纖維互相交叉滲透，纖維素膜層上標記以純化的小鵝瘟病毒的第二抗體的檢測印跡與包含羊/兔抗小鼠免疫球蛋白G的對照印跡，檢測印跡與對照印跡并列排列在纖維素膜層上，檢測印跡的位置靠近吸附纖維層;金標纖維層為附著有膠體金標記的小鵝瘟病毒的第一抗體的玻璃棉制成;本試紙條設有吸附纖維層的一端為入水端，設有吸水層的一端為握持端，入水端外側(cè)覆蓋有白色的第一保護膜，握持端覆蓋有黃色的第二保護膜;在吸附纖維層和金標纖維層交界處對應的保護膜上偏向于吸附纖維層一側(cè)0.40cm處印有印跡線，印跡線的右端印有箭頭及MAX字樣;握持端設有便于握持的凹槽，凹槽標記有大拇指形狀，凹槽83向內(nèi)延伸到吸水層;所述纖維素膜層采用硝酸纖維素膜、纖維素膜、羧化纖維素膜和聚偏二氟乙烯膜中的任意一種制成。
[0008]支撐層在入水端設為網(wǎng)格狀，其網(wǎng)孔的形狀為圓形、正方形、三角形、菱形、六邊形。
[0009]支撐層由不吸水的硬質(zhì)塑膠片或硬紙條制成。
[0010]本實用新型至少包含如下有益效果:
[0011 ] (I)本實用新型根據(jù)ELISA的基本原理，用免疫層析試紙檢測病毒，利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細管作用，將抗原-抗體反應由ELISA的傳統(tǒng)液相環(huán)境轉(zhuǎn)到固相濾膜上快速進行，并采用膠體金印跡代替酶印跡，憑肉眼直接觀察膠體金的顯色狀況，即時獲得檢測結(jié)果，因此該方法比ELISA等血清學方法更為簡便、快速。
[0012](2)檢測特異性強，敏感性高。該試紙條以膠體金印跡高親和力的特異性單抗/多抗為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標對單抗/多抗的特異性和親和力(結(jié)合力)影響很小，且具有較高的印跡率。因此，該試紙條具有較高的特異性和敏感性，可檢測到2納克的相應病毒的蛋白O
[0013](3)操作簡便，快速。使用本實用新型試紙條時無需附加任何其它儀器和試劑，只要將其測試端插入待檢樣品液中30秒左右，然后在5分鐘左右即可判定檢測結(jié)果。
[0014](4)結(jié)果顯示直觀、準確。該試紙條以顯示棕紅色的檢測印跡和對照印跡作為檢測的陽性和陰性印跡，即在纖維素膜上顯示兩條棕紅色印跡，表示在被檢測樣品中有病毒檢出，結(jié)果為陽性;在纖維素膜上只顯示一條棕紅色對照印跡C，表示在被檢測樣品液中未檢出病毒，結(jié)果為陰性。結(jié)果判定直觀、準確，簡單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽性誤判。
[0015](5)減少投資和檢測成本。使用該試紙條，不需另配其它儀器、設備和試劑，節(jié)省大量儀器、設備和附加試劑費用;專業(yè)和非專業(yè)人士均可隨時隨地進行現(xiàn)場檢測，無需支付專家診斷檢查費或送樣品去診斷室的路費，節(jié)省檢測成本，檢測費用低。
[0016](6)應用范圍廣，便于普遍推廣應用。本實用新型操作簡單，成“一步式”或“傻瓜式”，而且方便攜帶和保存，能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗、海關檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測、畜產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖到個體養(yǎng)殖等，具有廣闊的市場前景和較好的經(jīng)濟、社會效益。
【附圖說明】
[0017]圖1為本實用新型試紙條的俯視結(jié)構示意圖；
[0018]圖2為本實用新型的俯視不意圖；
[0019]圖3為支撐層的示意圖。
【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合附圖對本實用新型做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。
[0021]如圖1與圖2，一種快速檢測小鵝瘟病毒抗體的試紙條，包括支撐層1，支撐層I一端粘貼吸附纖維層2，另一端粘貼吸水層5，在支撐層I的吸附纖維層2與吸水層5之間的部分粘貼纖維素膜層4與金標纖維層3，吸附纖維層2、金標纖維層3、纖維素膜層4、吸水層5之間彼此拼接的交界處纖維互相交叉滲透，在纖維素膜層4上標記以純化的小鵝瘟病毒的第二抗體的檢測印跡6與包含羊/兔抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)的對照印跡7，檢測印跡6與對照印跡7并列排列在纖維素膜層上，檢測印跡6的位置靠近吸附纖維層，檢測印跡6的代號為T;對照印跡7的代號為C。
[0022]金標纖維層3為附著有膠體金標記的小鵝瘟病毒的第一抗體的玻璃棉制成。
[0023]本試紙條設有吸附纖維層2的一端為入水端(也稱為測試端)，設有吸水層5的一端為握持端，入水端外側(cè)覆蓋有白色的第一保護膜81，握持端覆蓋有黃色的第二保護膜82。在吸附纖維層2和金標纖維層3交界處對應的保護膜上偏向于吸附纖維層2—側(cè)0.40cm處印有印跡線9，印跡線的右端印有箭頭及MAX字樣。
[0024]事實上，即使設有不同顏色的保護膜，也可能會使檢測人員將入水端與握持端混淆，造成檢測事故。所以，在握持端設有便于握持的凹槽83或者凸起(圖中只畫了凹槽)，凹槽83或者凸起標記有大拇指形狀，這樣設置，既能方便檢測人員區(qū)分水端與握持端，也方便了握持，更符合人體工學。
[0025]如果為凹槽83，凹槽83向內(nèi)延伸到吸水層5或者支撐層I，方便握持。
[0026]如果為凸起，凸起可以為彈性材料，方便握持。
[0027]支撐層I可由不吸水的硬質(zhì)塑膠片或硬紙條制成。
[0028]如圖3，支撐層I在入水端設為網(wǎng)格狀，其網(wǎng)孔11的形狀為圓形、正方形、三角形、菱形、六邊形。正常的試紙條檢測時，吸水層5只有支撐層I的相對側(cè)可以吸水(溶液)，而本實用新型的支撐層I的入水端為網(wǎng)格狀，可以使吸水層5在支撐層I的一側(cè)通過網(wǎng)孔11也能吸水，這樣以來，吸水層5可以兩面吸水，加快了吸水的速度，縮短了檢測所用的時間，提高了工作效率。
[0029]吸附纖維層2為以玻璃棉制成。
[0030]所述結(jié)合層3可由例如玻璃棉、尼龍纖維和聚酯纖維中的任意一種制成。
[0031]所述纖維素膜層4采用硝酸纖維素膜、纖維素膜、羧化纖維素膜和聚偏二氟乙烯膜中的任意一種制成。
[0032]所述第一抗體和所述第二抗體與所述小鵝瘟病毒結(jié)合的位點不同，且第抗體與病毒結(jié)合不干擾第二抗體與病毒結(jié)合;作為優(yōu)選，所述第一抗體采用小鵝瘟病毒的單克隆抗體時，第二抗體采用小鵝瘟病毒的多克隆抗體，所述第一抗體采用小鵝瘟病毒的多克隆抗體時，所述第二抗體為小鵝瘟病毒的單克隆抗體。這樣，第一抗體和第二抗體可分別與小鵝瘟病毒的不同位點結(jié)合。即使第一抗體和小鵝瘟病毒特異性結(jié)合后，由于結(jié)合位點不同，也不影響第二抗體與小鵝瘟病毒的特異性結(jié)合。
[0033]檢測樣品時，取待檢的組織，磨碎后重懸，將該試紙條的入水端即吸附纖維層2插入到重懸后的樣品溶液中，約30秒后取出該試紙條，水平放置約1-5分鐘。當試紙條的入水端(吸附纖維層)插入待檢測樣品溶液后，由于層析作用待檢樣品溶液帶動待檢小鵝瘟病毒(GPV)和結(jié)合層3中的膠體金標記的小鸛痕病毒的第一抗體一起向纖維素膜層4擴散，并最終滲入握持端的吸水層5中。擴散過程中，若待檢樣品溶液中含有小鵝瘟病毒，則該病毒可與該病毒膠體金標記的第一抗體特異性結(jié)合，繼續(xù)擴散，該小鵝瘟病毒與纖維素膜層4上檢測線6中的第二抗體結(jié)合，從而檢測線6處顯示出棕紅色的印跡;而對照線7中的羊抗或兔抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)與膠體金標記的第一抗體結(jié)合，也形成棕紅色的印跡。如果待檢樣品液中沒有GPV，該試紙條只在對照線7處顯示出一條棕紅色印跡;如果纖維素膜層4上沒有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作失誤。
[0034]本實用新型制備及檢查方法如下:
[0035](I)羊(兔)抗小鼠IgG和羊(兔)抗兔羊IgG的制備
[0036]以飽和硫酸銨法提取小鼠血清中的IgG:取I份血清加2份PBS液(pH7.2)混勻，加等體積飽和硫酸銨液混勻，置4°C冰箱內(nèi)2小時，在4 °C、10000 r/min離心15 min，棄上清液；以適量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨液至其最終濃度為33%，置4 °C冰箱內(nèi)2小時，在40CaOOOO r/min條件下離心15 min，棄上清液，以少量I3BS液(pH7.2)溶解沉淀，置4°C冰箱內(nèi)用PBS液(pH7.2)過夜透析，換液2-3次，在4°C、10000 r/min條件下離心15 min，收集上清液，以紫外分光光度計測定其蛋白濃度。以50 yg?100 yg(IgG)/kg體重經(jīng)皮下或肌肉注射抗體陰性健康羊或家兔3-4次，末次免疫20天后，靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在1: 2000以上，心臟采血或頸動脈放血，收集其高免血清，以飽和硫酸銨法提取羊(兔)抗小鼠/鵝的IgG(其提取方法與上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，同理制備羊/兔抗兔/羊IgG，用于標記本實用新型試紙條的對照印跡。
[0037](2)抗GPV單克隆抗體的制備
[0038]差速離心、蔗糖密度梯度離心對GPV鵝胚毒進行濃縮、純化，甲醛滅活后用福氏佐劑乳化制備免疫原。
[0039]以50-100yg/只劑量的免疫原免疫Balb/c系小鼠三次，每次間隔15-30天;第三次加強免疫后3-4天，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，于75%酒精浸泡5-10 min，無菌取其脾細胞;剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過濾，用GNK洗液混懸脾細胞，1000 r/min離心10 min，收集脾細胞;將I X 108個的脾細胞與2 X 107-5 X 107個的NSO骨髓瘤細胞混合，再用GNK洗液混懸后，1000 r/min離心10 min棄上清，細胞沉淀于37°C的水浴中在I min內(nèi)緩緩加入0.7_1.0mL的PEG-1500(pH8.5-pH9.0)邊加邊搖，然后緩慢加入GNK洗液15 ml，以終止PEG的作用；37°C水浴5 min, 1000 r/min離心10 min棄上清，將細胞沉淀重懸于1640/HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入96孔培養(yǎng)板(200 uL/孔)，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天后，以5-10 yg/mL的純化GPV VP3蛋白包被96孔酶標板，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測雜交瘤的培養(yǎng)上清，挑取強陽性細胞克隆(0D450 2 0.5)，連續(xù)三次的有限稀釋法進行亞克隆，最后篩選得到特異性抗GPV的單克隆細胞。
[0040]該雜交瘤細胞染色體數(shù)為92-98，其分泌的抗GPV的單克隆抗體特異地與GPV反應，親和力常數(shù)達109-10，輕鏈亞型為K或λ，重鏈亞型為IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3，用于制備金標單克隆抗體。
[0041 ] (3)抗GPV金標單克隆抗體和金標單克隆抗體纖維膜的制備
[0042]將篩選到的特異性抗GPV的單克隆細胞擴大培養(yǎng)，PBS洗后1000r/min離心10min，收集細胞，以I X 106-2 X 106個/只對經(jīng)產(chǎn)母鼠進行腹腔注射，10-20天后采集小鼠腹水，4000 r/min離心10 min后的上清即為所需的單克隆抗體腹水。
[0043]以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠:在50-100mL沸騰的0.01-0.05%氯金酸水溶液中加入2-4 mL的0.5-2%檸檬酸三鈉溶液，反應后獲得直徑15 nm左右的膠體金。以0.1 mo I/L的K2C03調(diào)膠體金pH值至8.5-9.5，以1:1000-1300的印跡比將待印跡的抗GPV單克隆抗體腹水加入pH8.5-9.5的金溶膠中，印跡10 min后，加20wt°/c^PEG-10000至PEG-10000終濃度達至IJ0.05%，4°C下、1500-3000 r/min離心20 min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C下、15000 r/min離心I小時，棄上清液，獲得初步純化的金標抗體蛋白混合物后，用丙稀葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標蛋白，獲得膠體金印跡的抗GPV單克隆抗體。
[0044]將I: 100-1: 500稀釋的膠體金印跡的上述單克隆抗體吸附于精制玻璃棉(尼龍纖維或聚酯纖維)中，4°C下低溫真空干燥，即制得抗GPV金標單克隆抗體纖維膜，即結(jié)合層3。
[0045](4)抗GPV多克隆抗體的制備
[0046]同上使用滅活的GPV鵝胚毒，單獨多次免疫接種抗體陰性健康羊或兔。末次免疫20天后靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在1:1024以上，心臟采血或頸動脈放血，收集其高免血清，以飽和硫酸銨法提取血清中的IgG抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不重述)。
[0047](5)上述試紙條的檢測操作方法
[0048]a檢測樣品液的制備:取病雛鵝的組織如脾、胰或肝等，將其剪碎、研磨，以生理鹽水制成1:2-1:5倍的待檢測樣品懸液，置4°C室溫澄清或離心；
[0049]b檢測操作:將該試紙條入水端插入待檢測樣品中，插入深度不超過印跡線，約30秒后取出試紙條，水平放置約1-5分鐘，同時觀察結(jié)果。
[0050]c結(jié)果判斷:如果在試紙條的纖維素膜層上只顯示出一條棕紅色對照線印跡C，表示測檢結(jié)果呈陰性，說明在被檢樣品液中未檢測出GPV;如果試紙條上的纖維素膜層出現(xiàn)棕紅色的對照線印跡C和檢測線印跡T，表示檢測結(jié)果呈陽性，即在待檢樣品中檢出GPV;如果纖維素膜層上沒有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作有誤。
[0051 ] (6)上述試紙條的檢測原理:
[0052]當試紙條測入水端(吸附纖維層2)插入待檢測樣品溶液后，待檢溶液通過層析作用帶動待檢病鵝小鵝瘟病毒及結(jié)合層中的金標抗體一起向纖維素膜層擴散，并最終滲入握持端的吸水層中，擴散過程中待檢病毒可與該病毒相對應的金標單抗相結(jié)合，進而與纖維素膜層上檢測線中的抗該病毒的多抗IgG結(jié)合，從而顯示出棕紅色的檢測印跡T;而對照線印跡中的羊抗或兔抗小鼠IgG則可與金標單抗結(jié)合，形成棕紅色對照印跡C。如果待檢樣品液中沒有GPV，試紙條只顯示出一條棕紅色對照印跡C;如果纖維素膜上沒有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作失誤。
[0053]本實用新型的試紙條所依據(jù)的測試原理是:待檢樣品溶液中的小鵝瘟病毒(GPV)與結(jié)合墊上的膠體金標記的GPV第一抗體特異性結(jié)合，GPV與膠體金標記的抗體復合物在層析作用的推動下向試紙條握持端移動，當移動至包被GPV第二抗體的測試線時，形成雙抗體夾心復合物并聚集顯色，而游離的膠體金標記的第一抗體在移動到對照線時與被抗第一抗體的抗體捕獲并顯色以表明試紙條的有效性。
【主權項】
1.一種檢測小鵝瘟病毒的試紙條，包括支撐層(I)，支撐層(I)一端粘貼吸附纖維層(2)，另一端粘貼吸水層(5)，在支撐層(I)的吸附纖維層(2)與吸水層(5)之間的部分粘貼纖維素膜層(4)與金標纖維層(3)，吸附纖維層(2)、金標纖維層(3)、纖維素膜層(4)、吸水層(5)之間彼此拼接的交界處纖維互相交叉滲透，其特征在于:所述纖維素膜層(4)上標記以純化的小鵝瘟病毒的第二抗體的檢測印跡(6)與包含羊/兔抗小鼠免疫球蛋白G的對照印跡(7)，檢測印跡(6)與對照印跡(7)并列排列在纖維素膜層上，檢測印跡(6)的位置靠近吸附纖維層;金標纖維層(3)為附著有膠體金標記的小鵝瘟病毒的第一抗體的玻璃棉制成； 本試紙條設有吸附纖維層(2)的一端為入水端，設有吸水層(5)的一端為握持端，入水端外側(cè)覆蓋有白色的第一保護膜(81)，握持端覆蓋有黃色的第二保護膜(82); 在吸附纖維層(2)和金標纖維層(3)交界處對應的保護膜上偏向于吸附纖維層(2)—側(cè)0.40cm處印有印跡線(9)，印跡線的右端印有箭頭及MAX字樣； 握持端設有便于握持的凹槽(83)，凹槽(83)標記有大拇指形狀，凹槽(83)向內(nèi)延伸到吸水層(5)； 所述纖維素膜層(4)采用硝酸纖維素膜、纖維素膜、羧化纖維素膜和聚偏二氟乙烯膜中的任意一種制成； 支撐層(I)在入水端設為網(wǎng)格狀，其網(wǎng)孔(11)的形狀為三角形。2.如權利要求1所述的檢測小鵝瘟病毒的試紙條，其特征在于:所述支撐層(I)由不吸水的硬質(zhì)塑膠片或硬紙條制成。
【文檔編號】G01N33/577GK205538991SQ201620159010
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年3月2日
【發(fā)明人】趙樸, 劉川川, 張吉昌, 何雷堂, 王雪玲, 劉娟, 張云征, 卓志敏, 慎同燁, 陳金山, 崔光輝, 徐力, 袁松山, 鄭玉姝, 王藝偉
【申請人】河南科技學院