專利名稱：中藥數(shù)字化色譜指紋譜相似度評價系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，特別屬于用計算機對中藥數(shù)字 化指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)。
技術(shù)背景隨著中國經(jīng)濟的發(fā)展，中藥及其各種產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化也越來越重要，中藥數(shù) 字化指紋圖是中藥標(biāo)準(zhǔn)化的重要組成部分，但不同產(chǎn)地的中藥其數(shù)字化指紋圖 譜都或多或少的存在著差別，這為不同地方的藥監(jiān)、藥檢部門如何快速的判斷 中藥的真?zhèn)卧斐闪死щy。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種能夠快速準(zhǔn)確的對中藥指紋圖譜 相似度評價的計算機系統(tǒng)。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案為中藥數(shù)字化色譜指紋譜相似度評價系 統(tǒng)，包括高效液相色譜儀對物質(zhì)進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果輸入存儲程序的數(shù)字計 算機，該存儲程序的數(shù)字計算機執(zhí)行如下步驟a) 輸入經(jīng)高效液相色譜儀檢測的正品及檢品原始數(shù)據(jù)庫，將樣品數(shù)據(jù)按照參照樣品的保留時間進(jìn)行一點或多點的校正后，形成待處理正品、檢品數(shù)據(jù)庫， 設(shè)定正品庫中的一個正品為標(biāo)準(zhǔn)樣品，以其數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，將其余正品、檢品數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配后，形成了正品指紋圖譜集及檢品指紋圖譜集；b) 在正品的指紋圖譜集中，選出含量較高的n個峰做為n強峰，以不同樣品 所具有保留時間相同的色譜峰為共有峰，共有峰占樣品總峰數(shù)的比率為共有率 P,統(tǒng)計所有樣品的共有率，設(shè)定共有率下限P^將所有樣品共有率P與共有率下限Pm進(jìn)行比較,若該樣品的共有率P大于共有率下限PK.則保留該樣品的數(shù)據(jù)，若該樣品的共有率P小于共有率下限Pm，則要設(shè)定n強峰出現(xiàn)的頻率Yps，判斷該 樣品n強峰出現(xiàn)頻率與YK的大小，若樣品n強峰的出現(xiàn)頻率大于標(biāo)準(zhǔn)頻率Ym，則 保留該樣品的數(shù)據(jù)，否則將判斷樣品的保留時間與已知成份的保留時間是否相 同，若保留時間相同，則保留該樣品的數(shù)據(jù)，否則，刪除此樣品的數(shù)據(jù)；將數(shù) 據(jù)按照保留時間重新排序，形成正品特征指紋圖譜庫；c) 將a步驟所生成的檢品指紋圖譜集與正品特征指紋圖譜庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行 峰匹配，形成檢品指紋圖譜庫，計算檢品與各正品之間的相似度，并計算相似 度均值J樣；d) 計算正品特征指紋圖譜庫中各個樣品的相似度及相似度均值J，以正品相 似度均值最小值J為閾值，判斷檢品相似度均值J #與特征指紋庫中的相似度均 值J，若檢品相似度均值J肖大于正品特征指紋庫中的相似度均值J，，則為合格 產(chǎn)品，并將其數(shù)據(jù)加入到正品原始數(shù)據(jù)庫中，以增加正品指紋圖譜庫的代表性， 若檢品相似度均值J肖小于正品特征指紋庫中的相似度均值J，則為不合格產(chǎn)品。所述的數(shù)據(jù)區(qū)配包括以下步驟在待處理正品數(shù)據(jù)庫中，設(shè)定基準(zhǔn)正品樣品，以基準(zhǔn)正品樣品的保留時間， 相對峰面積，n強峰，來設(shè)定設(shè)定相對保留時間a基準(zhǔn)，相對峰面積S基準(zhǔn)，n強峰 n基準(zhǔn)，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)窗口，標(biāo)準(zhǔn)窗口的步長為W，判斷待處理正品數(shù)據(jù)庫中的其它數(shù) 據(jù)的相對保留時間a樣與a基準(zhǔn)之差的絕對值是否小于等于步長W，若該樣品的相 對保留時間a #與a絲之差的絕對值小于等于步長W，則該樣品的相對峰面積S 值添加于a基準(zhǔn)所在行的相應(yīng)樣品號下，若該樣品的相對保留時間a樣與a基準(zhǔn)之差 的絕對值大于步長W，則在a基準(zhǔn)所在列中增加ct樣，該樣品的相對峰面積S值添 加于a肖所在行的相應(yīng)樣品號下，將數(shù)據(jù)庫中所有正品按照相對保留時間的大小進(jìn)行排序，形成了正品指紋圖譜集。將待處理的檢品數(shù)據(jù)庫中的樣品數(shù)據(jù)，與基準(zhǔn)正品樣品進(jìn)行比較，以相同 的方法，形成了檢品指紋圖譜集。所述的峰匹配子程序包括以下步驟在待處理正品數(shù)據(jù)庫中，選擇正品特征指紋圖譜集中的a值，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)窗口，標(biāo) 準(zhǔn)窗口的步長為W，判斷待處理檢品數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)的相對保留時間a #與a之差 的絕對值是否小于等于步長W，若該樣品的相對保留時間a #與a之差的絕對值 小于等于步長W，則該樣品的相對峰面積S值添加于a所在行的相應(yīng)樣品號下， 若該樣品的相對保留時間a #與a之差的絕對值大于步長W，則刪除該樣品數(shù) 據(jù)，將數(shù)據(jù)庫中所有檢品按照相對保留時間的大小進(jìn)行排序，形成了檢品指紋 圖譜庫。d)步驟也可以為計算正品特征指紋圖譜庫中各個樣品的差異率R，以正品 差異率最大值R為閾值，計算檢品與正品的差異率為檢品差異率R肖，判斷檢品 差異度均值R樣與特征指紋庫中的差異度均值R，若檢品差異率R樣小于正品特 征指紋庫中的差異率R，，則為合格產(chǎn)品，并將其數(shù)據(jù)加入到正品原始數(shù)據(jù)庫中， 以增加品指紋圖譜庫的代表性，若檢品差異率R樣大于正品特征指紋庫中的相似 度均值J，則為不合格產(chǎn)品。為了使特征指紋圖譜庫更有代表性，所述的正品原始數(shù)據(jù)庫的正品原始數(shù) 據(jù)為不小于10個。在分析峰數(shù)較多的樣品時，雖可選擇一峰位居中的峰作內(nèi)標(biāo)峰，但它與兩 端的色譜峰保留值相差較大，此時對兩端色譜峰的相對保留值的精度會產(chǎn)生一 定的影響，從而導(dǎo)致定位的偏差。為此可采用多點校正，形成多個相對保留值 系列，以此作為比較依據(jù)。在數(shù)據(jù)匹配過程中，窗口 W其大小根據(jù)情況選定錄入，將各樣品的a(相對 保留時間)值和選為基準(zhǔn)樣品的a值逐一進(jìn)行比較，符合條件者，該樣品的a值 以標(biāo)準(zhǔn)a值為準(zhǔn)(其自身的a值去掉)，s(歸一化面積值)值追加到標(biāo)準(zhǔn)a值后的 該樣品列上。不符合條件者，將其a值追加到標(biāo)準(zhǔn)a值列中，s值隨后追加到該 樣品上。處理完第一個樣品后，第二個樣品再和基準(zhǔn)樣品與第一個樣品形成的 "標(biāo)準(zhǔn)a值"比較，以此類推。當(dāng)遇到同時有兩個或兩個以上的a值落于同一a 值的窗口范圍內(nèi)時，取接近標(biāo)準(zhǔn)a值的那個數(shù)值。本發(fā)明通過設(shè)定共有率，能夠有效的去掉那些眾多樣品中出峰數(shù)較少的峰; 設(shè)定n強峰的出現(xiàn)頻次限度，可以保證那些在眾多樣品中出現(xiàn)頻次較多的強峰 不因共有率的限度而丟失，而在限度以下的強峰則被去掉。通過錄入已確定成分的a值，保證樣品中已確定的成分不受其它參數(shù)設(shè)置 的影響，而將始終保留在指紋譜中。為了充分利用雖為正品但因所含個別成分含量過高或過低而被系統(tǒng)判為不 合格品的樣品，還可將正品與不合格或不合格品與不合格按一定比例混合勾兌， 從而調(diào)整個別成分的含量，使外交部勾兌后的樣品成為合格品。本發(fā)明所述的相似度的按照下列公式計算-S — 2m___2f卜"('.)~ (,')1 (i)S為兩指紋圖譜相似程度， 一張指紋圖譜色譜峰總數(shù)為np共有峰面積或峰 高為hu，另一張指紋圖譜色譜峰數(shù)為n2，共有峰面積或峰高為h2t，兩張指紋圖 譜的共有峰數(shù)為n。相似度均值按照下列公式計算S均"lX (z、l,2,3'A,") (2)差異率值按照下列公式計算X,—每個特征指紋峰的面積歸一化值或相對面積值的平均值； X, —各樣品中相應(yīng)特征峰的面積歸一化值或相對面積值；n—特征指紋數(shù)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，針對中藥復(fù)雜組分的分析、鑒定，建立相似度評 價系統(tǒng)，提高了峰間可比性，做到了整體性與模糊性的科學(xué)處理，實現(xiàn)了圖譜 的數(shù)據(jù)化。將色譜圖轉(zhuǎn)換成穩(wěn)定而易于比較的數(shù)據(jù)表并將重疊率、檢出率、差異率、特征指紋峰、歸一化面積值、n強峰等一系列參數(shù)及其計算統(tǒng)計引入到該系統(tǒng)中，這些參數(shù)的引入使中藥的比較鑒定更具有客觀的量化數(shù)據(jù)，使該相似度評價系統(tǒng)能夠在中藥質(zhì)控和質(zhì)標(biāo)中發(fā)揮更大的作用。


圖l為本發(fā)明的流程圖。圖2為本發(fā)明數(shù)據(jù)匹配子程序的流程圖。圖3為本發(fā)明峰匹配子程序的流程圖。圖4為本發(fā)明C步驟為差異度判斷的流程圖。圖5為決明子空白溶液的指紋圖譜。圖6為大決明子生品的HPLC指紋圖譜。圖7為小決明子生品的HPLC指紋圖譜。圖8為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的HPLC指紋圖譜。圖9為望江南生品的HPLC指紋圖譜。圖10為15批大決明子的HPLC指紋圖譜。圖11為22批小決明子的HPLC指紋圖譜。 圖12為5批小決明子清炒品的指紋圖譜。 圖13為IO批望江南正品的指紋圖譜。在圖6—9中，A1—A16大決明子生品中各種成份的吸收峰，B1—B16小決 明子生品中各種成份的吸收峰，Cl為蘆薈大黃素，C2為大黃酸，C3為大黃素， C4為大黃酚，C5為大黃素甲醚，D1—D9為望江南生品中各種成份的吸收峰。在圖10中El—E13為大決明子正品的指紋圖譜，E14—E15為大決明子待 檢品中指紋圖譜。在圖11中，F(xiàn)1—F19為小決明子正品的指紋圖譜，F(xiàn)20—F22為小決明子待 檢品的指紋圖譜。在圖12中G1—G5為5批小決明子清炒品的指紋圖譜。在圖13中H1-H10為10批望江南正品的指紋圖譜。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做詳細(xì)的說明。實施例1: 如圖l所示在步驟101 — 106中，輸入經(jīng)高效液相色譜儀檢測的正品及檢品原始數(shù)據(jù)庫， 將樣品數(shù)據(jù)按照參照樣品的保留時間進(jìn)行一點或多點的校正后，形成正品、檢 品待處理數(shù)據(jù)庫，設(shè)定正品庫中的一個正品為標(biāo)準(zhǔn)樣品，以其數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)， 將其余正品、檢品數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配后，形成了正品指紋圖譜集及 檢品指紋圖譜集；在步驟107 —IIO中，在正品的指紋圖譜集中，選出含量較高的n個峰做為n 強峰，以不同樣品所具有保留時間相同的色譜峰為共有峰，共有峰占樣品總峰數(shù)的比率為共有率P，統(tǒng)計所有樣品的共有率，設(shè)定共有率下限Pw，將所有樣品 共有率P與共有率下限PPS進(jìn)行比較，若該樣品的共有率P大于共有率下限P^則保留該樣品的數(shù)據(jù)，若該樣品的共有率P小于共有率下限PB,則轉(zhuǎn)到步驟130—133， 設(shè)定n強峰出現(xiàn)的頻率Y^判斷該樣品n強峰出現(xiàn)頻率與YK的大小，若樣品n強 峰的出現(xiàn)頻率大于標(biāo)準(zhǔn)頻率Yw則轉(zhuǎn)到步驟IIO，否則將判斷樣品的保留時間與 已知成份的保留時間是否相同，若保留時間相同，則轉(zhuǎn)到步驟IIO，否則，刪除 此樣品的數(shù)據(jù)；在步驟111一112中，將數(shù)據(jù)按照保留時間重新排序，形成正品特 征指紋圖譜庫。；在步驟120—123中，將步驟105所生成的檢品指紋圖譜集與正品特征指紋 圖譜庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行峰匹配，形成檢品指紋圖譜庫，計算檢品與各正品之間的 相似度，并計算相似度均值J^在步驟113 — 117中，計算正品特征指紋圖譜庫中各個樣品的相似度及相似 度均值J，以正品相似度均值最小值J為閾值，判斷檢品相似度均值Jff與特征指 紋庫中的相似度均值J，若檢品相似度均值J #大于正品特征指紋庫中的相似度 均值J，，則為合格產(chǎn)品，并將其數(shù)據(jù)加入到正品原始數(shù)據(jù)庫中，以增加品指紋 圖譜庫的代表性，若或檢品相似度均值J ff小于正品特征指紋庫中的相似度均值 J，則為不合格產(chǎn)品。如圖2所示，在步驟201—209中，在待處理正品數(shù)據(jù)庫中，設(shè)定基準(zhǔn)正品 樣品，以基準(zhǔn)正品樣品的保留時間，相對峰面積，n強峰，來設(shè)定設(shè)定相對保 留時間a基準(zhǔn)，相對峰面積S基準(zhǔn)，n強峰n基準(zhǔn)，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)窗口，標(biāo)準(zhǔn)窗口的步長 為W，判斷待處理正品數(shù)據(jù)庫中的其它數(shù)據(jù)的相對保留時間a樣與a基準(zhǔn)之差的絕 對值是否小于等于步長W，若該樣品的相對保留時間a樣與a基準(zhǔn)之差的絕對值小 于等于步長W，則該樣品的相對峰面積S值添加于a基準(zhǔn)所在行的相應(yīng)樣品號下，若該樣品的相對保留時間a #與a ^之差的絕對值大于步長W,則在a目所在列 中增加o^，該樣品的相對峰面積S值添加于a肖所在行的相應(yīng)樣品號下，將數(shù) 據(jù)庫中所有正品按照相對保留時間的大小進(jìn)行排序，形成了正品指紋圖譜集。在步驟201 —210中，將待處理的檢品數(shù)據(jù)庫中的樣品數(shù)據(jù)，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)窗口 ， 標(biāo)準(zhǔn)窗口的步長為W，判斷待處理檢品數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)的相對保留時間a樣與a基 準(zhǔn)之差的絕對值是否小于等于步長W，若該樣品的相對保留時間ci樣與ct基準(zhǔn)之差 的絕對值小于等于步長W，則該樣品的相對峰面積S值添加于a基準(zhǔn)所在行的相 應(yīng)樣品號下，若該樣品的相對保留時間a樣與ci基準(zhǔn)之差的絕對值大于步長W，則 在a目所在列中增加a #，該樣品的相對峰面積S值添加于a #所在行的相應(yīng)樣 品號下，將數(shù)據(jù)庫中所有檢品按照相對保留時間的大小進(jìn)行排序，形成檢品指 紋圖譜集。如圖3所示，在步驟301 — 308中，在待處理正品數(shù)據(jù)庫中，選擇正品特征指紋 圖譜集中的a值，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)窗口，標(biāo)準(zhǔn)窗口的步長為W，判斷待處理檢品數(shù)據(jù)庫中 數(shù)據(jù)的相對保留時間a #與ct之差的絕對值是否小于等于步長W，若該樣品的相 對保留時間a #與cl之差的絕對值小于等于步長W，則該樣品的相對峰面積S值 添加于a所在行的相應(yīng)樣品號下，若該樣品的相對保留時間a #與a之差的絕對 值大于步長W，則刪除該樣品數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)庫中所有檢品按照相對保留時間的 大小進(jìn)行排序，形成了檢品指紋圖譜庫。實施例2:除步驟113 — 117變?yōu)椴襟E401—406外，其余與實施例l相同。 在步驟401—406中，計算正品特征指紋圖譜庫中各個樣品的差異率R，以 正品差異率最大值R為閾值，計算檢品與正品的差異率為檢品差異率Rff，判斷 檢品差異度均值R #與特征指紋庫中的差異度均值R，若檢品差異率R #小于正品特征指紋庫中的差異率R，，則為合格產(chǎn)品，并將其數(shù)據(jù)加入到正品原始數(shù)據(jù) 庫中，以增加正品指紋圖譜庫的代表性，若檢品差異率Rff大于正品特征指紋庫 中的相似度均值J，則為不合格產(chǎn)品。將本發(fā)明實施例1用于決明子及其炮制品、代用品望江南的HPLC指紋相 似度評價。決明子為豆科植物決明Om/a o&M /o//a L.或小決明Cosw'a L. 的干燥成熟種子。秋季采收成熟果實，曬干，打下種子，除去雜質(zhì)。前者全國 各地多有栽培，產(chǎn)量大，主產(chǎn)于江蘇、安微、四川等地，習(xí)稱大決明子；后者 多為野生，產(chǎn)量較小，主產(chǎn)于廣西、安徽、云南等省區(qū)，習(xí)稱小決明子。有清 熱明目，潤腸通便之功效。望江南子&wewCaw/aoccWe"toto呈扁平狀近圓形， 一端略長，長3.5 4.5mm，寬2.5 3.5mm，厚1 1.5mm。表面灰綠色或灰棕 色，在兩平面中央有橢圓形凹斑。質(zhì)堅硬，不易破碎，橫切面可見灰白色胚乳 與兩片平直緊貼的黃色子葉，味淡，有小毒。張鐵軍等對全國21個省(市)進(jìn) 行實地調(diào)查，結(jié)果表明目前作決明子藥用的除正品決明子外，還有望江南， 僅在廣東潮州一帶，又稱圓決明。1.實驗材料、儀器與試劑1.1實驗材料本實驗所用大決明子生藥正品13批、小決明子生藥正品19批、大決明子 生藥待檢品2批，小決明子生藥待檢品3批，望江南生藥正品10批，上述藥材均為商品藥材。1.2儀器與試劑Agilent 1100高效液相色譜儀(包括Agilent1100四元泵，Agilent 1100 二極管 陣列檢測器，Agilent 1100色譜化學(xué)工作站)；FA 2004電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；BK 14- C2 0孔玻璃儀器快速烘干器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；超聲波清洗機(上海必能信超聲有限公司)；ZFQ85A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海醫(yī)械專機廠)；蘆薈大黃素對照品(批號766-200210)、大黃素對照品(批號756-200110)、 大黃酸對照品(批號774-200311)、大黃酚對照品(批號796-200204)、大黃素 甲醚對照品(批號758-2004080)均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈、甲醇 為色譜純，鹽酸、磷酸及氯仿為分析純。2.實驗方法2.1供試品制備2丄1決明子炮制品取小決明子生藥正品19批中的一批，按下列方法制備炮制品，每種炮制品 制備5批。清炒品生品以文火炒至微有爆裂聲并有香氣。 酒炙品生品加酒泡過夜，文火炒干。 鹽炙品生品加鹽水拌勻，悶透，文火炒干。 醋炙品生品加醋悶潤過夜，文火炒干。 醋蒸品生品加醋悶潤過夜，蒸2h,晾千。2丄2對照品溶液稱取蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚對照品適量，以甲醇為溶劑，配制成20pg/ml的蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大 黃酚五種成分的對照品溶液及其混合對照品溶液。 2丄3供試品溶液取決明子樣品，粉碎，過80目篩，稱取2.0g，加1.5mol/L的鹽酸溶液30ml， 加熱回流1.5h，放冷，加氯仿25ml，回流20min，取出，分取氯仿層，酸水層再 加氯仿25ml，回流20min，分取氯仿層，同上法操作，加氯仿再回流提取二次， 合并四次氯仿提取液，加水20ml振搖洗脫，棄去水層，將氯仿液蒸干，殘渣加 甲醇15ml使溶解，過濾，定量轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻， 經(jīng)0.45pm微孔濾膜過濾，即得。2.2色譜條件色譜柱Zorbax Eclipse XDB - d8(4.6mmx250mm，5iim),保護(hù)柱Zorbax SB -<:18柱(4.611111^12.5111111,5^1111);流動相乙腈(A) - 0.1。/o磷酸水溶液(B)作梯 度洗脫，Omin， 10%A-90%B; 5 min， 15%A-85%B; 10min， 40%A-60%B; 40min， 70%A - 30%B; 41min后100。/oA。流速l.Oml/min;柱溫室溫；檢 測波長278nm，參比波長550nm;光譜數(shù)據(jù)記錄范圍220 500nm，波長間 隔2nm;色譜記錄時間0 50min;進(jìn)樣量10^1。 2.3色譜指紋峰標(biāo)定2.3.1特征峰選定按2丄3供試品溶液的制備方法做空白試驗，結(jié)果見圖 5。檢出峰中峰面積最大值及峰高最大值分別在200毫吸收度及5毫吸收度以下, 因此選取面積閾值(Area Reject) =200，峰高閾值(Height Reject) =5對所有供 試品進(jìn)行積分，選取有積分值的峰做為決明子的特征峰。取決明子生品的供試 品溶液按選定色譜條件測定，記錄其色譜圖，按規(guī)定方法積分，結(jié)果見圖6、圖 7。2.3.2部分特征峰確認(rèn)取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃 素甲醚純組分對照品溶液和混合對照品溶液按上述色譜條件測定，見圖8。 比較各對照品溶液的色譜圖與供試品溶液的色譜圖，根據(jù)色譜保留時間，初步確定圖6、圖7中的A12、 B12、 A15、 B15和A16、 B16號峰分別為大黃素、 大黃酚和大黃素甲醚峰，大黃酚峰所在峰在所選定的特征峰中，其峰高值居中。3. 內(nèi)標(biāo)峰的確定本實驗決明子特征指紋譜的建立以大黃酚為內(nèi)參照峰，在分析望江南樣品 時，以大黃素甲醚為內(nèi)參照峰。4. 指紋圖譜。 4.1指紋圖譜取大、小決明子、小決明子的炮制品、望江南的供試品溶液按選定色譜條 件測定，記錄其色譜圖。以大黃酚為內(nèi)參照峰，分別計算E1 E15大決明子樣品、F1 F22小決明 子樣品、小決明的5種炮制品的相對保留時間cn及歸一化面積值A(chǔ)n。的相對保 留時間a及歸一化面積值A(chǔ)r。以大黃素甲醚為內(nèi)參照峰，計算E1 E13大決明子樣品、F1 F19小決明 子樣品、H1 H10望江南樣品的相對保留時間(X2及歸一化面積值A(chǔ)r2。計算的 相對保留時間a及歸一化面積值A(chǔ)r。4丄1大決明子的特征指紋圖譜庫4.L1.1大決明子的特征指紋圖譜庫以El正品為基準(zhǔn)樣品，共有峰窗口為0.02， n強峰數(shù)為8，共有率要求^80%， n強峰出現(xiàn)頻次要求^8，對其余的El E13大決明子正品的on、 Ai^進(jìn)行數(shù)據(jù)處 理，得13批大決明子的特征指紋圖譜庫、n強峰、n強峰出現(xiàn)頻次表、相似度 表。大決明子的特征指紋圖譜庫有16個特征峰，相似度閾值為0.745。4丄1.2對E14、 E15大決明子樣品的驗證將E14、 E15大決明子樣品的cn、 An和大決明子的特征指紋圖譜庫進(jìn)行比較。E14、 E15樣品的相似度低于閾值0.745，因此其應(yīng)為不合格品。4丄1.3小決明子與大決明子特征指紋圖譜庫的比較以大決明子的特征指紋圖譜庫為標(biāo)準(zhǔn)，以F1 F19小決明子正品為待鑒樣 品(相對保留時間為on ，歸一化面積值為An)，對小決明子進(jìn)行分析。結(jié)果顯示 所有小決明子的相似度值均低于大決明子的相似度閾值0.745。4.1.2小決明子的特征指紋圖譜庫4丄2.1小決明子的特征指紋圖譜庫以Fl樣品為基準(zhǔn)樣品，共有峰窗口限度為0.02， n強峰數(shù)為8，共有率要 求^80%， n強峰出現(xiàn)頻次要求^8，對其余18批小決明子正品的w、 An進(jìn)行數(shù) 據(jù)處理，得19批小決明子的特征指紋圖譜庫、n強峰、n強峰出現(xiàn)頻次表、相 似度表。小決明子的特征指紋圖譜庫有13個特征峰，相似度閾值為0.816。4.1.2.2 對F20、 F21、 F22小決明子的驗證 將F20、 F21、 F22小決明子樣品的oii、 和小決明子的特征指紋圖譜庫 進(jìn)行比較，三者的相似度均低于相似度閾值0.816，因此判定這三種樣品為不合 格品。4丄2.3大決明子與小決明子特征指紋圖譜庫的比較以小決明子的特征指紋圖譜庫為標(biāo)準(zhǔn)，以E1 E13大決明子正品為待鑒樣 品，對大決明子進(jìn)行分析。結(jié)果顯示所有大決明子的相似度值均低于小決明子 的相似度閾值0.816。4丄3決明子綜合指紋圖譜庫以Fl小決明子正品為基準(zhǔn)樣品，共有峰窗口限度為0.02， n強峰數(shù)為8， 共有率要求^80%， n強峰出現(xiàn)頻次要求28，對E1 E13大決明子樣品及F1 F19 號批小決明子樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得決明子的綜合特征指紋圖譜庫，庫中共有特征峰12個，相似度閾值為0.641。4丄4炮制品與決明子特征指紋圖譜庫的比較 4丄4.1炮制品與小決明子特征指紋圖譜庫的比較因炮制品系由小決明子制得，因此以小決明子的特征指紋圖譜庫為標(biāo)準(zhǔn)， 對炮制品進(jìn)行分析。各炮制品與小決明子特征指紋圖譜庫的比較，結(jié)果顯示各 炮制品的相似度值均低于小決明子特征指紋圖譜庫的相似度閾值0.816。4丄4.2炮制品與決明子綜合特征指紋圖譜庫的比較以32批決明子的綜合特征指紋圖譜庫為標(biāo)準(zhǔn)，對炮制品進(jìn)行分析，顯示各 炮制品的相似度值均高于決明子綜合特征指紋圖譜庫的相似度閾值0.641。 4丄5望江南與大、小決明子及決明子綜合特征指紋圖譜庫的比較 4丄5.1望江南與大決明子特征指紋圖譜庫的比較以E1號大決明子樣品為基準(zhǔn)樣品，共有峰窗口限度為0.02， n強峰數(shù)為8， 共有率要求^80%， n強峰出現(xiàn)頻次要求^8,對El EB大決明子樣品的a2、 Ar2 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得13批大決明子的特征指紋圖譜庫并對望江南進(jìn)行分析。結(jié)果 顯示望江南的相似度在0.151 0.189之間，遠(yuǎn)小于大決明子特征指紋圖譜庫的 相似度閾值0.720。4丄5.2望江南與小決明子特征指紋圖譜庫的比較以Fl小決明子樣品為基準(zhǔn)樣品，共有峰窗口限度為0.02， n強峰數(shù)為8， 共有率要求^80%， n強峰出現(xiàn)頻次要求^8，對Fl F19小決明子樣品的a2、 Ar2 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得19批小決明子的特征指紋圖譜庫并對望江南迸行分析。結(jié)果 顯示望江南的相似度在0.203 0.251之間，遠(yuǎn)小于小決明子特征指紋圖譜庫的 相似度閾值0.813。4丄5.3望江南與決明子綜合特征指紋圖譜庫的比較以Fl小決明子樣品為基準(zhǔn)樣品，共有峰窗口限度為0.02， n強峰數(shù)為8， 共有率要求280%， n強峰出現(xiàn)頻次要求28，對E1 E13大決明子樣品及F1 F19 號小決明子樣品(相對保留時間為a2 ，歸一化面積值為Ar2)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得 32批決明子的綜合特征指紋圖譜庫并對望江南進(jìn)行分析。結(jié)果顯示望江南的相 似度在0.202 0.242之間，遠(yuǎn)小于決明子綜合特征指紋圖譜庫的相似度閾值 0.699。以往的文獻(xiàn)報道中均采用大黃酚為測定指標(biāo)來控制決明子及其制劑的質(zhì) 量，但在大、小決明子的特征指紋圖譜中大黃酚并非為含量最高成分且含量分 布并不均勻。在13批大決明子的8強峰中，9批大決明子含有大黃酚，列第5 的有1個，第6的有3個，第7的有4個，第8的有1個；在19批小決明子的 8強峰中，19批小決明子均含大黃酚，列第4的有7個，第5的有8個，第6 的有2個，第7、第8的各1個。13批大決明子的特征指紋圖譜庫的相似度閾值為0.745， 19批小決明子的 特征指紋圖譜庫的相似度閾值為0.816。大、小決明子間的特征峰不相同，大決 明子的特征峰為16個，其中相對保留時間為0.374、 0.529、 0.553、 0.563的四 個峰在小決明子的特征指紋圖譜庫中沒有；小決明子的特征峰為13個，其中相 對保留時間為0.666的峰在大決明子的特征指紋圖譜庫中沒有。決明子綜合特征指紋圖譜庫中，大、小決明子的檢出峰數(shù)、檢出率、重疊 峰數(shù)、重疊率均相同，但相似度卻僅為0.641，說明大、小決明子特征成分間的 含量差異較大。以小決明子生品為基準(zhǔn)樣品，采集小決明子生品和其炮制品指紋圖譜共17 個特征峰的相對峰比值數(shù)據(jù)，其中一個峰((x=0.669)為生品所特有，三個峰(a =0.372， 0.446， 0.564)為炮制品所特有，說明藥材炮制前后其內(nèi)在質(zhì)量發(fā)生了很大變化，其層次聚類樹圖也說明了這一點。代用品望江南和大、小決明子及其綜合特征指紋圖譜庫相比較，各項評價指標(biāo)均相差較大，不可作為決明子的代用品。將本發(fā)明實施例1用于不同溫度的決明子袋泡劑指紋相似度評價。 決明子含蒽醌類化合物和萘駢吡喃酮類等多種化學(xué)成分，具有清肝明目、潤腸通便的功效，已開發(fā)出多種制劑，采用梯度洗脫的高效液相色譜法來表征決明子袋泡劑的色譜指紋特征。5. 儀器與試藥 5.1儀器惠普1100高效液相色譜儀，包括Agilent 1100四元泵，惠普1100二極管陣 列檢測器，惠普色譜化學(xué)工作站。超聲波清洗機(上海必能信超聲有限公司);ZFQ 85 A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海醫(yī)械專機廠)。5.2樣品與試劑5批大決明子生藥樣品符合《中華人民共和國藥典》2005版規(guī)定。蘆薈大 黃素對照品(批號766-200210)、大黃素對照品(批號756-200110)、大黃酸對 照品(批號774-200311)、大黃酚對照品(批號796-200204)、大黃素甲醚對照 品(批號758-2004080)均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈、甲醇為色譜純， 鹽酸、磷酸為分析純。6. 方法與結(jié)果 6.1樣品制備6.1.1決明子袋泡劑的制備取決明子生品，粉碎，過80目篩，稱取2g， 用濾紙袋包裝，制備決明子袋泡劑。6丄2對照品溶液的制備稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，以甲醇為溶劑，配制成200昭'mL—'的戸薈大黃素、大 黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚純組分對照品溶液和五種對照品的混合溶 液。6丄3供試品溶液制備將袋泡劑加入沸水35 mL,置蓋分別保溫20、 40 min，將袋取出，浸出液加鹽酸4.7mL，加熱回流1.5 h,放冷，加氯仿25 mL， 回流20min，取出，分取氯仿層，酸水層再加氯仿25mL，回流20 min，分取 氯仿層，同上法操作，加氯仿再回流提取二次，合并四次氯仿提取液，加水20 mL 振搖洗脫，棄去水層，將氯仿液蒸干，殘渣加甲醇微熱使溶解，定量轉(zhuǎn)移至10mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。放置，取上清液經(jīng)0.45pm微孔濾膜過濾。6.2色譜條件色譜柱Zorbax Eclipse XDB - C18 (4.0 mmx250誰，5 iim)，保護(hù)柱Scienhome Ci8柱(3.0mmx20mm， 5 pm);流動相乙腈(A) -0.1 。/o磷酸水溶液(B)作梯度 洗脫，Omin， 10%A ^%B; 5 min， 15%A 85%B; 10min， 40%A 60% B; 40min， 70%A 30%B; 41min后100o/oA;流速l.OmL.mirT1;柱溫 室溫；檢測波長278 nm，參比波長550 nm;進(jìn)樣量10 ^L。分析時間為50 min。 6.3決明子袋泡劑指紋特征的測定及技術(shù)參數(shù)制備決明子袋泡劑10批，分別獲得其保溫20 min和保溫40 min的供試品 溶液，1 —10號為保溫40分鐘的供試品溶液，11—20號為保溫20分鐘的供試 品溶液，以第1號決明子袋泡劑為基準(zhǔn)樣品，共有峰窗口限度為0.02， n強峰 數(shù)為8，共有率要求^80%， n強峰出現(xiàn)頻次要求28，對決明子袋泡劑樣品的相 對保留時間(a)和相對峰面積(Ar)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得1一20號決明子袋泡劑 提取液的特征指紋圖譜庫。結(jié)果顯示，決明子袋泡劑保溫40min的提取液(l 10號)的檢出峰數(shù)為15個，檢出率為100 %，重疊峰數(shù)為15個，重疊率為100%;而決明子袋泡劑保溫20 min的提取液(11 20號)的檢出峰數(shù)為11 12 個，檢出率為73.33 % 80%，重疊峰數(shù)為11 12，重疊率為84.62 °/。 88.89%。以決明子袋泡劑保溫40 min提取液Cl 10號)建立的特征指紋圖譜庫， 其相似度閾值為0.746。決明子袋泡劑保溫20 min提取液(U 10號)的特征 指紋圖譜與指紋圖譜庫相比較，其相似度在0.513 0.627之間，低于決明子袋 泡劑保溫40min提取液Cl 10號)的相似度閾值0.746。6.4不同產(chǎn)地決明子袋泡劑HPLC指紋圖譜的比較分別取產(chǎn)地為河北、安徽、江蘇、浙江、上海的5批決明子生藥樣品，每 批制備保溫40min的袋泡劑提取液10份(31 40號)和20 min的袋泡劑提取 液10份(41 51號)，按6.3決明子袋泡劑指紋特征的測定及技術(shù)參數(shù)項進(jìn)行測 定，結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的決明子袋泡劑保溫40min的提取液Gl 40號)的 檢出峰數(shù)為15個，檢出率為100%,重疊峰數(shù)為15個，重疊率為100%;而不 同產(chǎn)地的決明子袋泡劑保溫20min的提取液(41 50號)的檢出峰數(shù)為12 13 個，檢出率為80% 86.67%，重疊峰數(shù)為12 13，重疊率為88.88 % 92.86 %。 以不同產(chǎn)地決明子袋泡劑保溫40min提取液Gl 40號)建立的特征指紋圖譜 庫，其相似度閾值為0.736。不同產(chǎn)地決明子袋泡劑保溫20min提取液(41 50 號)的特征指紋圖譜與指紋圖譜庫相比較，其相似度在0.513 0.629之間，低 于不同產(chǎn)地的決明子袋泡劑保溫40 min提取液(31 40號)的相似度閾值0.736。 可見，保溫時間不同，決明子袋泡劑提取液的檢出峰數(shù)、檢出率、重疊峰數(shù)、 重疊率則不同；保溫時間對決明子袋泡劑有效成分的浸出量有較大影響，采用相似度評價可有效地控制不同產(chǎn)地的決明子袋泡劑在不同保溫時間下的內(nèi)在質(zhì)
權(quán)利要求
1、中藥數(shù)字化色譜指紋譜相似度評價系統(tǒng)，包括高效液相色譜儀對物質(zhì)進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果輸入到存儲程序的數(shù)字計算機，其特征在于該存儲程序的數(shù)字計算機執(zhí)行如下步驟a)輸入經(jīng)高效液相色譜儀檢測的正品及檢品原始數(shù)據(jù)庫，將樣品數(shù)據(jù)按照參照樣品的保留時間進(jìn)行一點或多點的校正后，形成待處理正品、檢品數(shù)據(jù)庫，設(shè)定正品庫中的一個正品為標(biāo)準(zhǔn)樣品，以其數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，將其余正品、檢品數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配后，形成了正品指紋圖譜集及檢品指紋圖譜集；b)在正品的指紋圖譜集中，選出含量較高的n個峰做為n強峰，以不同樣品所具有相同保留時間的色譜峰為共有峰，共有峰占樣品總峰數(shù)的比率為共有率P，統(tǒng)計所有樣品的共有率，設(shè)定共有率下限P限，設(shè)定n強峰出現(xiàn)的頻率Y限。將所有樣品共有率P與共有率下限P限進(jìn)行比較，若該樣品的共有率P大于共有率下限P限，則保留該樣品的數(shù)據(jù)，若該樣品的共有率P小于共有率下限P限，則進(jìn)行n強峰出現(xiàn)的頻率比較，判斷該樣品n強峰出現(xiàn)頻率與Y限的大小，若樣品n強峰的出現(xiàn)頻率大于標(biāo)準(zhǔn)頻率Y限，則保留該樣品的數(shù)據(jù)，否則將判斷樣品的保留時間與已知成份的保留時間是否相同，若保留時間相同，則保留該樣品的數(shù)據(jù)，否則，刪除此樣品的數(shù)據(jù)；將數(shù)據(jù)按照保留時間重新排序，形成正品特征指紋圖譜庫；c)將a步驟所生成的檢品指紋圖譜集與正品特征指紋圖譜庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行峰匹配，形成檢品指紋圖譜庫，計算檢品與各正品之間的相似度，并計算相似度均值J樣；d)計算正品特征指紋圖譜庫中各個樣品的相似度及相似度均值J，以正品相似度均值最小值J為閾值，判斷檢品相似度均值J樣與特征指紋庫中的相似度均值J，若檢品相似度均值J樣大于正品特征指紋庫中的相似度均值J，，則為合格產(chǎn)品，并將其數(shù)據(jù)加入到正品原始數(shù)據(jù)庫中，以增加正品指紋圖譜庫的代表性，若檢品相似度均值J樣小于正品特征指紋庫中的相似度均值J，則為不合格產(chǎn)品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的中藥數(shù)字化色譜指紋譜相似度評價系統(tǒng)，其特征 在于-所述的數(shù)據(jù)區(qū)配包括以下步驟在待處理正品數(shù)據(jù)庫中，設(shè)定基準(zhǔn)正品樣品，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)窗口，標(biāo)準(zhǔn)窗口的 步長為W，判斷待處理正品數(shù)據(jù)庫中的其它數(shù)據(jù)的相對保留時間a樣與a基準(zhǔn)之差 的絕對值是否小于等于步長W，若該樣品的相對保留時間a #與ot ，之差的絕對 值小于等于步長W，則該樣品的相對峰面積S值添加于a 所在行的相應(yīng)樣品號 下，若該樣品的相對保留時間a樣與a基準(zhǔn)之差的絕對值大于步長W，則在a基準(zhǔn)所 在列中增加ctff，該樣品的相對峰面積S值添加于ciff所在行的相應(yīng)樣品號下，將 數(shù)據(jù)庫中所有正品按照相對保留時間的大小進(jìn)行排序，形成了正品指紋圖譜集；將待處理的檢品數(shù)據(jù)庫中的樣品數(shù)據(jù)，與基準(zhǔn)正品樣品進(jìn)行比較，以相同 的方法，形成了檢品指紋圖譜集。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的中藥數(shù)字化色譜指紋譜相似度評價系統(tǒng)，其特征 在于-所述的峰匹配子程序包括以下步驟在待處理正品數(shù)據(jù)庫中，選擇正品特征指紋圖譜集中的a值，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)窗口，標(biāo) 準(zhǔn)窗口的步長為W，判斷待處理檢品數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)的相對保留時間a #與a之差 的絕對值是否小于等于步長W，若該樣品的相對保留時間a #與a之差的絕對值 小于等于步長W，則該樣品的相對峰面積S值添加于a所在行的相應(yīng)樣品號下， 若該樣品的相對保留時間a #與a之差的絕對值大于步長W，則刪除該樣品數(shù) 據(jù)，將數(shù)據(jù)庫中所有檢品按照相對保留時間的大小進(jìn)行排序，形成了檢品指紋圖譜庫。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的中藥數(shù)字化色譜指紋譜相似度評價系統(tǒng)，其特征 在于-d)步驟也可以為計算正品特征指紋圖譜庫中各個樣品的差異率R,以正品 差異率最大值R為閾值，計算檢品與正品的差異率為檢品差異率Rff,判斷檢品 差異度均值R ft與特征指紋庫中的差異度均值R，若檢品差異率R ^小于正品特 征指紋庫中的差異率R，，則為合格產(chǎn)品，并將其數(shù)據(jù)加入到正品原始數(shù)據(jù)庫中， 以增加正品指紋圖譜庫的代表性，若檢品差異率R^大于正品特征指紋庫中的相 似度均值J，則為不合格產(chǎn)品。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的中藥數(shù)字化色譜指紋譜相似度評價系統(tǒng)，其特征 在于所述的正品原始數(shù)據(jù)庫的正品原始數(shù)據(jù)不小于IO個正品的數(shù)據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了中藥數(shù)字化色譜指紋譜相似度評價系統(tǒng)，包括高效液相色譜儀對物質(zhì)進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果輸入到存儲程序的數(shù)字計算機，該存儲程序的數(shù)字計算機執(zhí)行如下步驟輸入經(jīng)高效液相色譜儀檢測的正品及檢品原始數(shù)據(jù)庫，將正品、檢品數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配后，形成了正品指紋圖譜集、正品特征指紋圖譜庫及檢品指紋圖譜集；將檢品指紋圖譜集與正品特征指紋圖譜庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行峰匹配，形成檢品指紋圖譜庫，計算各正品之間及檢品與各正品之間的相似度，若檢品相似度均值大于正品特征指紋庫中的相似度均值J，則為合格產(chǎn)品，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，提高了峰間可比性，做到了整體性與模糊性的科學(xué)處理，實現(xiàn)了圖譜的數(shù)據(jù)化。
文檔編號G06F17/00GK101256177SQ200710190089
公開日2008年9月3日 申請日期2007年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月21日
發(fā)明者鄒純才, 鄢海燕 申請人:皖南醫(yī)學(xué)院