2型糖尿病脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種2型糖尿病脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，包括以下步驟：樣品收集；樣品預(yù)處理；納米磁珠活化；唾液樣品上樣；納米磁珠洗脫；數(shù)據(jù)采集；數(shù)據(jù)分析；建立診斷模型。本發(fā)明采用液態(tài)芯片聯(lián)合MALDI技術(shù)檢測2型糖尿病脾虛證患者的唾液蛋白質(zhì)指紋圖譜，從唾液蛋白質(zhì)中篩選出64個有極顯著的統(tǒng)計學(xué)意義的差異蛋白峰，選擇質(zhì)荷比為2082.92、2843.79兩個差異蛋白質(zhì)峰進(jìn)行建模，識別率為97.5％，預(yù)測能力86.7％。本發(fā)明構(gòu)建的模型能夠正確地區(qū)分2型糖尿病脾虛證患者及不同的中醫(yī)證型的患者，為臨床疾病診斷及中醫(yī)辯證客觀化開辟了新途徑，開拓了中醫(yī)微觀辯證學(xué)的研究新思路。
【專利說明】
2型糖尿病脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)譜應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種2型糖尿病脾虛證唾液蛋 白指紋圖譜分子診斷模型建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 2型糖尿?。═ype 2diabetes mellitus，T2DM)是臨床常見的老年代謝紊亂性疾 病，生化檢查主要表現(xiàn)為患者空腹血糖及(或者)餐后血糖的升高，癥狀典型者可以同時伴 有口干多飲、多食易饑、尿量增多以及體重減輕等表現(xiàn)，在病程后期，患者多出現(xiàn)心、腦、腎 等組織器官的血管粥樣硬化性病變，導(dǎo)致血管管腔狹窄，從而引起一系列心、腦、腎等組織 器官供血不足、代謝障礙甚至衰竭的臨床表現(xiàn)。病情危重者，則由于碳水化合物、脂肪、蛋白 質(zhì)等物質(zhì)代謝嚴(yán)重失常，或者胰島素使用不當(dāng)，血糖在短時間內(nèi)急劇飆升，引起患者出現(xiàn)病 情危重的狀態(tài)，例如糖尿病酮癥酸中毒昏迷(DKA)、高血糖高滲性昏迷，倘若搶救不及時，患 者多有生命危險。此外，2型糖尿病的致殘率極高，有的老年性患者因?yàn)檠欠磸?fù)或持續(xù)性 升高，出現(xiàn)了白內(nèi)障、青光眼、失明、尿毒癥，甚至肢體壞疽、截肢等嚴(yán)重不良后果，嚴(yán)重影響 患者生活質(zhì)量，增加社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，隨著人們現(xiàn)在生活水平的提高、平均壽命年齡的 延長、人口的老齡化以及人們飲食習(xí)慣的西方化，我國的2型糖尿病患者人口總數(shù)已經(jīng)高居 于世界首位，而且處于快速增長的階段，與此同時，我國2型糖尿病患者的患病年齡日趨于 年輕化，形勢非常嚴(yán)峻。
[0003] 機(jī)體胰島素分泌相對不足(胰島素缺乏)和(或)胰島素的生物效應(yīng)降低(胰島素抵 抗)是2型糖尿病患者血糖持續(xù)性居高不下的重要原因，是2型糖尿病發(fā)病的主要機(jī)制。為了 更好的防治2型糖尿病，減少或者阻止2型糖尿病的并發(fā)癥出現(xiàn)，目前已經(jīng)對其發(fā)病機(jī)制進(jìn) 行更深層次的研究。例如患者胰島素分泌或功能減退，除了與體型肥胖、運(yùn)動過少等環(huán)境因 素有關(guān)外，也跟基因等遺傳因素有關(guān)，其中基因核轉(zhuǎn)錄因子7類似物2(tran SCripti〇n factor 7-like 2，TCF7L2)是引起2型糖尿病最重要的一個遺傳基因，它除了可以通過直接 影響0細(xì)胞的生長、分化以及功能來干擾胰島素的分泌，也可以通過間接的引起胰島功能的 缺陷，從而引起血糖的異常。隨著科學(xué)的進(jìn)步，人們對2型糖尿病的研究逐漸由基因轉(zhuǎn)向基 因表達(dá)的蛋白質(zhì)研究，例如有人發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者跟正常人比較，存在唾液激素原轉(zhuǎn)化酶 (Prohormone convertase，PC)含量明顯偏低的現(xiàn)象，這種酶是一種內(nèi)切蛋白酶，能夠?qū)ι?經(jīng)內(nèi)分泌激素的前身進(jìn)行加工，而且能夠作用于胰島辟田胞，使其分泌的胰島素原去除部分 肽段形成胰島素，其含量的降低則可以導(dǎo)致胰島素的形成不足，從而引起血糖升高。
[0004] 中醫(yī)將2型糖尿病歸屬于"消渴病"范疇，對其有深刻的認(rèn)識及理解，并創(chuàng)立各具特 色的流派及治療學(xué)說，如腎虛論、脾虛論、陰虛燥熱論，及從脾論治，從肝論治等。中醫(yī)藥理 論治療2型糖尿病，確實(shí)可以提高機(jī)體對胰島素的敏感性，縮減西藥的毒副作用及使用劑 量，延緩甚至能夠有效地防止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。但是，實(shí)際生活中，中醫(yī)藥診斷 治療2型糖尿病并不能夠得到很好的重視及廣泛運(yùn)用，其主要的原因就是2型糖尿病的辨證 分型方法太過于繁多，缺少可靠的客觀性的量化性指標(biāo)，從而在相當(dāng)大的程度上影響中醫(yī) 藥治療2型糖尿病的可行性以及具體操作性。因此，要提升2型糖尿病的中醫(yī)藥理論發(fā)展，必 要先著手2型糖尿病的中醫(yī)辨證論治理論的現(xiàn)代研究發(fā)展。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展， 運(yùn)用中西醫(yī)結(jié)合診治手段研究中醫(yī)藥理論成為一種必然趨勢，本課題研究從宏觀辨證與微 觀辨證相結(jié)合的思想理念出發(fā)，運(yùn)用唾液蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探討2型糖尿病不同證候的微觀 物質(zhì)變化，嘗試開展2型糖尿病的"病"與"證"相結(jié)合的研究，為2型糖尿病臨床辨證分型的 規(guī)范化、客觀化提供分子物質(zhì)基礎(chǔ)依據(jù)，以期將來能夠促進(jìn)中醫(yī)藥對2型糖尿病的診斷與治 療。
[0005] 隨著人類基因組計劃(human genomic project，HGP)的完成，人們逐漸將研究革巴 向轉(zhuǎn)變對蛋白質(zhì)組(pro teome)的研究。蛋白質(zhì)組一詞是在1994年由Williams和Wilkins提 出，指基因組編碼的所有蛋白質(zhì)，即某一物種、個體、器官、組織乃至細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)，強(qiáng) 調(diào)基因組對應(yīng)的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體。2001年，Nature和Science在公布人類基因組草圖 的同時，分別發(fā)表了 Abbott和Fields的評述與展望。隨之，蛋白質(zhì)組學(xué)的地位提升到了前所 未有的高度，被認(rèn)為是功能基因組學(xué)前沿研究戰(zhàn)略的制高點(diǎn)、決勝點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué) (proteomics)是一種新興的科學(xué)研究技術(shù)，其有別于傳統(tǒng)的單個基因或單個蛋白的研究模 式，而是從整體水平分析機(jī)體或細(xì)胞全部蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)、修飾、結(jié)構(gòu)功能和相互作 用，以及蛋白質(zhì)和核酸之間的相互作用，對生命的復(fù)雜活動有全面和本質(zhì)的認(rèn)識，從整體層 次上對蛋白質(zhì)進(jìn)行動態(tài)研究。
[0006] 蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者，是基因表達(dá)的產(chǎn)物，其表達(dá)、修飾、功能以及彼此相 互作用均受到遺傳及環(huán)境因素的影響，于是機(jī)體出現(xiàn)疾病狀態(tài)必然會引起蛋白質(zhì)含量或者 存在形式的變化，這些變化的蛋白質(zhì)分子可以為臨床疾病診斷的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。蛋白 質(zhì)組學(xué)主要是運(yùn)用現(xiàn)代先進(jìn)的檢測技術(shù)，檢測機(jī)體從小到一個細(xì)胞到大至整個機(jī)體的全部 基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的特性，比較分析生理或病理狀態(tài)、用藥及不用藥狀態(tài)下的差異表達(dá) 蛋白質(zhì)，找出不同狀態(tài)下個體表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，從而為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)、疾病的早期檢測 與診斷等研究尋找分子診斷標(biāo)志物提供依據(jù)。
[0007] 近年來，隨著現(xiàn)代科學(xué)及生物化學(xué)的微量檢測分析技術(shù)的發(fā)展創(chuàng)新，唾液作為一 種臨床容易采集而且操作過程完全沒有創(chuàng)傷性的體液逐漸進(jìn)入了人們研究活動的視角，且 具有無法估計的科研潛力以及臨床應(yīng)用前景。首先，相比血清標(biāo)本而言，唾液標(biāo)本的采集更 安全，具有無創(chuàng)性，采集過程中患者無痛苦，易于接受，而且無血源性疾病傳播的風(fēng)險存在； 與尿液標(biāo)本相比，唾液標(biāo)本具有可實(shí)時采樣、更方便的優(yōu)點(diǎn)。此外，唾液檢測需要的樣本量 小、成本低、易于儲存和運(yùn)輸。最重要的是，唾液標(biāo)本成分與血液、尿液等體液成分具有極高 的相似性，對疾病診斷具有極強(qiáng)的敏感性和特異性。
[0008] 唾液是人體常見的一種重要體液，其包涵大量的激素、蛋白質(zhì)、酶、抗體、補(bǔ)體、細(xì) 胞因子及各種微生物等血液成分，這些血液成分通過順濃度梯度被動的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)或逆 濃度梯度的主動轉(zhuǎn)運(yùn)等途徑分泌在唾液當(dāng)中，且隨體內(nèi)病理生理變化的影響而呈動態(tài)變化 過程。研究唾液的PH值、電解質(zhì)、生化指標(biāo)、微生物、免疫指標(biāo)、蛋白質(zhì)等成分變化與疾病的 關(guān)系，發(fā)現(xiàn)唾液成分的變化可作為疾病診斷、療效判斷、藥物監(jiān)測的參考指標(biāo)，在臨床疾病 的診治活動中具有重要的潛在應(yīng)用價值。根據(jù)目前的文獻(xiàn)資料顯示，唾液不僅能夠作為艾 滋病、乙型肝炎等傳染性疾病、口腔惡性腫瘤及乳腺癌等惡性腫瘤的診斷標(biāo)志，而且也可以 應(yīng)用于糖尿病、關(guān)節(jié)炎、心臟病及腎臟疾病等各個系統(tǒng)疾病的診斷，從而成為目前西方國家 研究者熱衷的取代血清學(xué)檢查的首選標(biāo)本。
[0009]唾液具有消化食物、潤滑、防御保護(hù)、緩沖、機(jī)械清洗、抗菌以及內(nèi)分泌等生物作 用，而蛋白質(zhì)和多肽是唾液成分中最主要的具有生物學(xué)功能的物質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn)唾液蛋白 質(zhì)和多肽有2300多種，主要有a-淀粉酶、白蛋白、半胱氨酸蛋白酶、IgA、溶菌酶、乳鐵蛋白、 黏蛋白等蛋白質(zhì)，其中有98%的唾液蛋白質(zhì)是富酷蛋白及轉(zhuǎn)鐵蛋白。然而，通過對已發(fā)現(xiàn)的 唾液蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)功能未知的蛋白質(zhì)占有28.7% (比例最大），與免疫功能 相關(guān)的蛋白質(zhì)占21%，與蛋白質(zhì)復(fù)制及修復(fù)相關(guān)的蛋白質(zhì)占1.6%，與細(xì)胞動力及分泌相關(guān) 的蛋白質(zhì)占4.8%，與轉(zhuǎn)錄和核糖體相關(guān)的蛋白質(zhì)占2.3%，與細(xì)胞繁殖及細(xì)胞循環(huán)相關(guān)的 占4.2%，而與信號傳導(dǎo)、代謝、細(xì)胞骨架及內(nèi)膜相關(guān)的蛋白質(zhì)分別占9.7%、5.2%、7.1 % 等?？梢?，生物功能尚處于未知狀態(tài)的唾液蛋白質(zhì)仍占有相當(dāng)大的比例，需要進(jìn)一步研究挖 掘，且意義重大。新近研究證實(shí)，大通量、大精度的蛋白組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，使唾液蛋白質(zhì)生物 標(biāo)記用于疾病的早期診斷預(yù)防、生物蛋白質(zhì)靶向治療、預(yù)后監(jiān)測判斷等均成為可能。
[0010]因此，提供一種診斷模型簡便、快速、標(biāo)本用量少，靈敏度高，特異性好的2型糖尿 病脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型的建立方法，就成為該技術(shù)領(lǐng)域急需解決的技術(shù) 難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 有鑒于此，本發(fā)明要解決現(xiàn)有2型糖尿病脾虛證檢測技術(shù)方法復(fù)雜，靈敏度低，特 異性差，檢測時間長，標(biāo)本用量大的問題，提供了一種2型糖尿病脾虛證唾液蛋白指紋圖譜 分子診斷模型建立方法。
[0012] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種2型糖尿病脾虛證唾液蛋白指紋圖譜 分子診斷模型建立方法，包括以下步驟：
[0013] (1)樣品收集；
[0014] (2)樣品預(yù)處理:收集的唾液樣品在2h內(nèi)置于轉(zhuǎn)速3000r/min的4°C低溫離心機(jī)離 心lOmin，并按照50iU/管分裝于凍存管(EP管），置于-80°C冰箱冷凍保存?zhèn)溆茫?br>[0015] ⑶納米磁珠活化；
[0016] (4)唾液樣品上樣:④取5yl唾液樣品，加10yl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入 185yl的Wash Buff er稀釋（唾液最終上樣量為2.5yl);⑤向含有活化磁珠的PCR管中加入 lOOiil處理好的唾液樣品（注意避免產(chǎn)生氣泡），室溫孵育30min，置于磁鐵上孵育lmin，去除 上清液;⑥再往PCR管中加入100y 1的Wash Buffer，洗脫5min，并置于磁鐵上孵育lmin，去除 上清液;⑦重復(fù)步驟⑥一次，重復(fù)步驟⑥是為了去除雜質(zhì)，洗脫更干凈，獲得較純的目的蛋 白；
[0017] (5)納米磁珠洗脫:每個PCR管中加入10yl的Elution Buffer，洗脫5min(不能少于 5min)，放置于磁鐵上孵育lmin，取5yl上清液移至另一個PCR管中，并加入5yl的CHCA飽和溶 液充分混勻，吸取2iU混合溶液加樣到Au/Steel芯片上，風(fēng)干，然后上機(jī)讀取芯片，收集數(shù) 據(jù)；
[0018] (6)數(shù)據(jù)采集；
[0019] (7)數(shù)據(jù)分析；
[0020] (8)建立診斷模型：用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用決策樹算法計算 出多個變量(m/z蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰)變化對兩樣本的判別價值，確定最佳的診斷模型。
[0021]進(jìn)一步的，步驟（1)所述樣品收集方法為:2型糖尿病脾虛證組和正常對照組在取 材前一天晚上臨睡前清水漱口，之后不再進(jìn)食任何食物和藥物，于第二天清晨起床漱口后 空腹取材，前5min內(nèi)的唾液自然吞下后開始收集，收集到的唾液置于冰浴預(yù)冷的50ml具塞 離心管內(nèi)，每個臨床病例共采集唾液樣品2-3毫升，將每個裝有唾液樣本的所述離心管置于 冰盒里，4°C保存。
[0022] 進(jìn)一步的，步驟(3)所述納米磁珠活化方法為:①取WCX納米磁珠50iil加入到200iil 的PCR管中，置于磁鐵上孵育lmin(注意避免由于孵育時間過長導(dǎo)致磁珠結(jié)塊），去除上清 液;②再加入l〇〇yl的Wash Buffer洗脫5min，在磁鐵上孵育lmin，去除上清液;③重復(fù)步驟 ②一次，重復(fù)是為了洗脫更干凈，去除雜質(zhì)，最好洗脫2次，這樣質(zhì)譜檢測受到干擾的可能性 會更少。
[0023]進(jìn)一步的，步驟(6)所述數(shù)據(jù)采集方法為:采用質(zhì)譜儀讀取芯片信息，設(shè)置激光強(qiáng) 度為190,靈敏度為5,收集數(shù)據(jù)的質(zhì)荷比范圍為2000~25000m/z，信號收集位置40~60,平 均每點(diǎn)收集20次，收集總點(diǎn)為100次，用Ciphergen Proteinchip Software3? 2? 1軟件自動 采集數(shù)據(jù)，縱坐標(biāo)為峰強(qiáng)度(蛋白質(zhì)相對含量），橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(m/z);數(shù)據(jù)采集前， 用已知A11-in-one多肽標(biāo)準(zhǔn)芯片校正儀器，激光離子流為0.5。
[0024] 進(jìn)一步的，步驟（7)所述數(shù)據(jù)分析方法為：所有原始數(shù)據(jù)先用Proteinchip Software3.2.1做總離子強(qiáng)度及分子量校正，使其達(dá)到均一;對位于2000~25000m/z峰值， 用Biomarker Wizard軟件過濾噪音，設(shè)置初始的噪音過濾值為5，二次信噪比為2，以10 %為 最小閾值進(jìn)行聚類，經(jīng)上述數(shù)據(jù)預(yù)處理后，采用t檢驗(yàn)比較2型糖尿病脾虛證組和正常對照 組唾液蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)（由Biomarker Wizard軟件完成），找出2組之間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué) 意義的蛋白質(zhì)峰，P<〇.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0025] 進(jìn)一步的，步驟(7)中，用Biomarker Wizard軟件分析，在質(zhì)譜峰(m/z)為2000~ 25000范圍內(nèi)總共檢測到331個差異蛋白峰，其中有64個在2型糖尿病脾虛證組和正常對照 組的差異有極顯著意義(P<〇.001，如下表所示），所述64個差異表達(dá)蛋白質(zhì)峰具體如下：



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[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：
[0031] 1)本發(fā)明采用液態(tài)芯片聯(lián)合MALDI技術(shù)檢測2型糖尿病脾虛證患者的唾液蛋白質(zhì) 指紋圖譜，從唾液蛋白質(zhì)中篩選出有意義的特異性生物標(biāo)記物，并建立了相關(guān)病證結(jié)合的 診斷模型。
[0032] 2)本發(fā)明篩選出331個具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的差異蛋白峰，其中64個在2型 糖尿病脾虛證組和正常對照組的差異有極顯著意義（P<〇. 001)，選擇質(zhì)荷比（m/z)為 2082.92、2843.79兩個差異蛋白質(zhì)峰進(jìn)行建模，識別率為97.5 %，預(yù)測能力86.7 %。臨床回 代檢驗(yàn)結(jié)果表明，該診斷模型的靈敏度為85.0%，特異度為82.2%。說明該模型對2型糖尿 病脾虛證的診斷效率優(yōu)良，靈敏度高、特異性強(qiáng)。
[0033] 3)本發(fā)明構(gòu)建的模型能夠正確地區(qū)分2型糖尿病脾虛證患者及不同的中醫(yī)證型的 患者，具有重要的臨床診斷意義，為臨床疾病診斷及中醫(yī)辯證客觀化開辟了新途徑，并為中 醫(yī)微觀辯證學(xué)的研究開拓了新思路。
[0034] 4)本發(fā)明的技術(shù)方案已顯示出良好的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步深入研究并在臨床推 廣轉(zhuǎn)化。
[0035] 當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品必不一定需要同時達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。
【附圖說明】
[0036] 此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā) 明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0037] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中2型糖尿病脾虛證組與正常對照組代表性蛋白指紋圖譜；
[0038] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中2型糖尿病脾虛證組與正常對照組診斷模型。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 以下將配合附圖及實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用 技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。
[0040] 實(shí)施例
[00411 1研究對象的篩選及診斷標(biāo)準(zhǔn)
[0042] 1.1病例收集時間
[0043] 2014 年 10 月--2015年2 月。
[0044] 1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)
[0045] 1.2.1 2型糖尿病的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)
[0046] 參照目前世界衛(wèi)生組織(WHO)以及美國糖尿病協(xié)會(ADA)在2014年公布的《糖尿病 診療指南》，其中關(guān)于2型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)具體如下：
[0047]患者出現(xiàn)典型"三多一少"癥狀：
[0048] 1)糖化血紅蛋白（HbAlC) 2 6.5%;
[0049] 2)空腹血糖濃度(FPG) 2 7.0mmol/L;
[0050] 3)隨機(jī)血糖濃度(GLU) 2 ll.lmmol/L;
[0051] 4) 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(0GTT)2小時的血糖濃度2 11. lmmol/L，即服用75克無水 葡萄糖溶于水來作為糖負(fù)荷，且嚴(yán)格按照世界衛(wèi)生組織(WHO)的要求標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行該試驗(yàn)。
[0052] 患者沒有明確典型的高血糖癥狀：
[0053] 5)應(yīng)當(dāng)重復(fù)檢測確認(rèn)結(jié)果，即除了上述診斷標(biāo)準(zhǔn)外尚須另一次口服葡萄糖耐量試 驗(yàn)（0GTT)2小時血糖濃度211.1mmol/L，或者另一次檢測發(fā)現(xiàn)空腹血糖（FPG)濃度2 7.0mmol/L〇
[0054] 2型糖尿病典型的"三多一少"癥狀是指口渴多飲、多食易饑、排尿增加和體重減 輕。
[0055]空腹的準(zhǔn)確定義即是指患者禁止攝入熱量至少達(dá)8小時以上。
[0056] 1.2.2 2型糖尿病的中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)
[0057] 在確定西醫(yī)臨床診斷為2型糖尿病的基礎(chǔ)上，參照全國中西醫(yī)結(jié)合虛癥研究專業(yè) 委員會制定的《中醫(yī)虛癥辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》及中華人民共和國衛(wèi)生部2002年制定頒發(fā)的《中藥 新藥臨床研究指導(dǎo)原則》關(guān)于2型糖尿病的診斷建議，將所收集到的2型糖尿病患者資料分 為脾虛證、腎虛證及其他證：
[0058] 脾虛證的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：
[0059] 1)脾氣虛證:飲食減少、納谷不馨、食后脘腹脹滿、有時自覺腹部隱隱作痛、喜按、 少氣體倦、神疲、懶言、面色萎黃、大便泄瀉溏薄、甚至或者肛門墜脹、體型消瘦、乏力自汗、 舌體胖大或邊有齒痕、脈象虛弱無力或軟濡；
[0060] 2)脾陽虛證:脘腹自覺冷痛綿綿難忍、喜溫喜按、口淡不欲飲水、口中常常泛吐清 水、飲食減少、食后脘腹脹滿、形寒肢冷、肢體浮腫、大便清稀甚至出現(xiàn)完谷不化、小便短少、 舌質(zhì)淡胖多伴邊有齒痕、舌苔白滑、脈象沉遲微弱。
[0061 ] 1.2.3正常對照組的診斷標(biāo)準(zhǔn)
[0062]正常對照組的篩選標(biāo)準(zhǔn)是空腹血漿葡萄糖濃度水平可以波動在4.4mmo 1/L (80mg/ dl)至6. lmmol/L( 1 lOmg/dl)之間，餐后兩小時血衆(zhòng)葡萄糖濃度水平在4.4mmol/L(80mg/dl) 至8.0mmol/L(144mg/dl)之間，并且沒有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重疾病。
[0063] 1.3病例的納入標(biāo)準(zhǔn)
[0064] 1)符合2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，而且患者的年齡、性別、臨床表現(xiàn)、有無嚴(yán)重并發(fā)癥及 舌苔、脈象等基本資料都應(yīng)該收集齊全。
[0065] 2)正常對照組人群經(jīng)過廣東省深圳市第二人民醫(yī)院體檢科生化檢查排除2型糖尿 病，各項理化指標(biāo)正常，無其他嚴(yán)重疾病的患者。
[0066] 1.4病例的排除標(biāo)準(zhǔn)
[0067]在唾液標(biāo)本收集前的一天，本課題研究人員對2型糖尿病患者進(jìn)行篩查排除，凡是 出現(xiàn)以下任意一項及以上標(biāo)準(zhǔn)的患者，均不予病例的入選，應(yīng)當(dāng)予以排除：
[0068] 1)年齡在30歲以下或者70歲以上的2型糖尿病患者；
[0069] 2)性別、年齡、臨床表現(xiàn)、舌苔、脈象等資料不齊全的患者；
[0070] 3)不愿意提供唾液標(biāo)本或者唾液標(biāo)本收集量不足的患者；
[0071] 4)確診為2型糖尿病，但正處于妊娠期或者哺乳期的婦女患者；
[0072] 5)確診為1型糖尿病、其他特殊類型糖尿病的患者；
[0073] 6)確診為2型糖尿病，但是并發(fā)糖尿病酮癥酸中毒、高滲性昏迷的患者；
[0074] 7)嚴(yán)重的精神分裂患者；
[0075] 8)患有口腔局部及唾液腺的炎癥、腫瘤性疾病的患者。
[0076] 1.5病例的剔除標(biāo)準(zhǔn)
[0077]在唾液標(biāo)本收集完成后，本次課題研究人員對當(dāng)天所收的2型糖尿病患者基本資 料進(jìn)行篩查剔除，凡是出現(xiàn)以下任意一項及以上標(biāo)準(zhǔn)的2型糖尿病患者，均應(yīng)當(dāng)予以剔除： [0078] 1)病例篩選過程中因粗忽而納入者；
[0079] 2)病歷資料符合以上排除標(biāo)準(zhǔn)者；
[0080] 3)對臨床表現(xiàn)及舌脈的中醫(yī)辨證分型不明確者；
[0081] 4)沒有嚴(yán)格遵守唾液取樣標(biāo)準(zhǔn)操作的患者；
[0082] 5)在唾液標(biāo)本轉(zhuǎn)移過程中出現(xiàn)不小心被污染者；
[0083] 6)唾液樣本收取的量明顯不足者。
[0084] 2納入病例基本資料
[0085] 本次研究所收集的唾液樣本全部來自廣東省深圳市第二人民醫(yī)院住院部內(nèi)分泌 科臨床明確診斷為2型糖尿病患者，總計共70例，年齡階段在30-70歲，男女性別不限;45例 正常對照組的健康人為本院體檢科體檢，并且無糖尿病、高脂血癥、原發(fā)性高血壓、冠狀動 脈硬化性心臟病、肥胖癥等疾病的志愿者。
[0086] 3研究分組
[0087] 2型糖尿病組脾虛證組40例，正常對照組45例。
[0088] 4實(shí)驗(yàn)方法
[0089] 4.1主要儀器和試劑
[0090] 弱陽離子交換型（WCX)納米磁珠、Wash Buffer、Elution Buffer、U9裂解液及 MALDI-TIF-MS(蛋白指紋圖譜儀I型），均為湖州賽爾迪生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品;PBSII-c型蛋白質(zhì)芯片閱讀儀，為美國Ciphergen公司產(chǎn)品；高速臺式低溫離心機(jī)(Eppendorf公 司）；-80 °C 冰箱(Harris公司）；dH20(HPLC級）、CHCA為Sigma公司產(chǎn)品。
[0091] 4.2樣品收集
[0092]取材前一天晚上囑患者臨睡前清水漱口三次(漱口以后不再進(jìn)任何食物和藥物）， 第二天清晨起床漱口后空腹取材，取材時間為清晨六點(diǎn)至八點(diǎn)?；颊咴谇?min內(nèi)的唾液自 然吞下，然后將無菌的唾液管棉球含入口中，唾液積聚至一定量后，將棉球吐回50ml經(jīng)過預(yù) 先冰浴預(yù)冷的具塞離心管內(nèi)，每個臨床病例共采集唾液樣品2_3ml，并將每個裝有唾液樣本 的離心管置于冰盒里，低溫保存。
[0093] 4.3樣品處理
[0094] 收集的唾液全部在2h內(nèi)置于轉(zhuǎn)速3000r/min的4°C低溫離心機(jī)離心10min，并按照 50yl/管分裝于凍存管(EP管），置于-80°C冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時取出標(biāo)本，常溫解凍。 [0095] 4.4納米磁珠活化
[0096] ①取WCX Magnetic Beads納米磁珠50yl加入到200yl的PCR管中，在磁鐵上孵育 lmin(注意避免由于孵育時間過長導(dǎo)致磁珠結(jié)塊），去除上清液；②再加入lOOyl的Wash Buffer洗脫5min，置于磁鐵上孵育lmin，去除上清液；③再往PCR管中加入100yl的Wash Buffer洗脫5min，在磁鐵上孵育lmin，去除上清液，即重復(fù)步驟②一次。重復(fù)是為了洗脫更 干凈，去除雜質(zhì)，最好洗脫2次，這樣質(zhì)譜檢測受到干擾的可能性會更少。
[0097] 4.5唾液樣品洗脫上樣
[0098] ①每個唾液樣品取5yl，加10yl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185yl的Wash Buffer稀釋（唾液最終上樣量為2.5yl);②向含有活化磁珠的PCR管中加入100yl處理好的 唾液樣品（注意避免產(chǎn)生氣泡），室溫孵育30min，置于磁鐵上孵育lmin，去除上清液;③再往 PCR管中加入100yl的Wash Buffer，洗脫5min，并置于磁鐵上孵育lmin，去除上清液;④重復(fù) 步驟③一次，以去除雜質(zhì)，洗脫更干凈，獲得較純的目的蛋白。
[0099] 4.6納米磁珠洗脫
[0100] 每個PCR管中加入10yl的Elution Buffer，洗脫5min(不能少于5min)，放置于磁鐵 上孵育lmin，取5yl上清液移至另一個PCR管中，并加入5yl的CHCA飽和溶液充分混勻，吸取2 y 1混合溶液加樣到Au/Steel芯片上，風(fēng)干，然后上機(jī)讀取芯片，收集數(shù)據(jù)。
[0101] 4.7數(shù)據(jù)收集
[0102] 采用質(zhì)譜儀讀取芯片信息，設(shè)置激光強(qiáng)度為190,靈敏度為5,收集數(shù)據(jù)的質(zhì)荷比范 圍為2000~25000m/z，信號收集位置40~60,平均每點(diǎn)收集20次，收集總點(diǎn)為100次。用 Ciphergen Proteinchip Software3.2.1軟件自動采集數(shù)據(jù)，縱坐標(biāo)為峰強(qiáng)度(蛋白質(zhì)相對 含量），橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(m/z)。每次試驗(yàn)數(shù)據(jù)采集前，均用已知All-in-one多肽標(biāo)準(zhǔn) 芯片校正儀器，激光離子流為〇. 5。
[0103] 4.8生物信息學(xué)分析
[0104] 所有原始數(shù)據(jù)先用Proteinchip Software3.2.1做總離子強(qiáng)度及分子量校正，使 其達(dá)到均一;對位于2000~25000m/z峰值，用Biomarker Wizard軟件過濾噪音。設(shè)置初始的 噪音過濾值為5,二次信噪比為2,以10%為最小閾值進(jìn)行聚類，經(jīng)上述數(shù)據(jù)預(yù)處理后，采用t 檢驗(yàn)比較2型糖尿病脾虛證組和正常對照組唾液蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)（由Biomarker Wizard軟 件完成），找出2組之間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義的蛋白質(zhì)峰。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 [0105] 4.9建立診斷模型
[0106] 用Biomarker Pattern Software 5.0.2米用決策樹算法計算出多個變量(m/z蛋 白質(zhì)質(zhì)譜峰)變化對兩樣本的判別價值，確定最佳的篩選模型，即診斷模型。用SPSS軟件進(jìn) 行各組基線值比較，年齡比較用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)用±s表達(dá)，性別構(gòu)成比較用X 2 檢驗(yàn)。
[0107] 5 結(jié)果
[0108] 5.1年齡、性別分布情況
[0109] 40例2型糖尿病脾虛證患者中男性患者有27例，女性患者有13例;45例正常對照組 的健康人有男性27例，女性18例。（表1)
[0110] 表1 2型糖尿病組與正常對照組分布
[0112] 表1顯示:經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，各組性別與年齡分布均無顯著性差異(P>0.05)。
[0113] 5.2 2型糖尿病脾虛證組與正常對照組比較結(jié)果
[0114] 將85份唾液標(biāo)本的原始蛋白指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)化后（其中2型糖尿病脾虛證患者40例， 正常對照組45例），用Biomarker Wizard軟件分析，在質(zhì)譜峰(m/z)為2000~25000范圍內(nèi)總 共檢測到331個差異蛋白峰，其中有64個在2型糖尿病脾虛證組和正常對照組的差異有極顯 著意義(P<〇. 001，見表2)。
[0115] 表2正常對照組與2型糖尿病脾虛證組的差異峰結(jié)果


[0119]圖1為2型糖尿病脾虛證組與正常對照組蛋白質(zhì)代表性圖譜，圖中縱坐標(biāo)為峰強(qiáng)度 (蛋白相對含量），橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(m/z)。
[0120] 用Biomarker Pattern Software 5.0.2米用決策樹算法計算出多個變量(m/z蛋 白質(zhì)質(zhì)譜峰)變化對兩樣本的判別價值，確定最佳的篩選模型（圖2)，建立由m/z為2082.92、 2843.79兩個差異蛋白峰聯(lián)合組成的診斷決策樹模型，該模型的敏感性為97.5% (39/40)， 特異性為86.7 % (39/45)(見表3)。
[0121] 如圖2所示，當(dāng)滿足條件以下條件之一者：①m/z 2843.79>2.18且m/z 2082.92〉 2.11且m/z 2082.92 <4.68,②m/z 2082.92 <2.11提示為2型糖尿病脾虛證組；當(dāng)滿足條件 以下條件之一者：@111/2 2082.92>2.11且111/2 2843.79 <2.18，(1)111/2 2843.79>2.18且111/2 2082.92>4.68提示為正常組。M:質(zhì)譜峰相對強(qiáng)度。
[0122]表3所建診斷模型的診斷效率(臨床回代檢驗(yàn)結(jié)果）
[0124] 為了驗(yàn)證由2082.92、2843.79這兩個差異蛋白峰組成的診斷模型，對所建立的診 斷模型采用十字交叉法進(jìn)行驗(yàn)證，40例2型糖尿病脾虛證患者的唾液樣本中有34例劃分正 確，敏感性為85.0 % (34/40); 45例正常健康對照組樣本，有37例劃分正確，特異性為82.2 % (37/45)(見表 4)。
[0125] 表4所建診斷模型的診斷效率(十字交叉驗(yàn)證結(jié)果）
[0127] 本發(fā)明采用液態(tài)芯片聯(lián)合MALDI技術(shù)檢測2型糖尿病脾虛證患者的唾液蛋白質(zhì)指 紋圖譜，從唾液蛋白質(zhì)中篩選出有意義的特異性生物標(biāo)記物，并建立了相關(guān)病證結(jié)合的診 斷模型。篩選出331個具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的差異蛋白峰，其中64個在2型糖尿病脾虛 證組和正常對照組的差異有極顯著意義(P<0.001 )，選擇質(zhì)荷比(m/z)為2082.92、2843.79 兩個差異蛋白質(zhì)峰進(jìn)行建模，識別率為97.5%，預(yù)測能力86.7%。臨床回代檢驗(yàn)結(jié)果表明， 該診斷模型的靈敏度為85.0%，特異度為82.2%。說明該模型對2型糖尿病脾虛證的診斷效 率優(yōu)良，靈敏度高、特異性強(qiáng)。本發(fā)明構(gòu)建的模型能夠正確地區(qū)分2型糖尿病脾虛證患者及 不同的中醫(yī)證型的患者，具有重要的臨床診斷意義，為臨床疾病診斷及中醫(yī)辯證客觀化開 辟了新途徑，并為中醫(yī)微觀辯證學(xué)的研究開拓了新思路。本發(fā)明顯示出良好的應(yīng)用前景，值 得進(jìn)一步深入研究并在臨床推廣轉(zhuǎn)化。
[0128] 如在說明書及權(quán)利要求當(dāng)中使用了某些詞匯來指稱特定成分或方法。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)可理解，不同地區(qū)可能會用不同名詞來稱呼同一個成分。本說明書及權(quán)利要求并不 以名稱的差異來作為區(qū)分成分的方式。如在通篇說明書及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的"包含"為 一開放式用語，故應(yīng)解釋成"包含但不限定于"。"大致"是指在可接收的誤差范圍內(nèi)，本領(lǐng)域 技術(shù)人員能夠在一定誤差范圍內(nèi)解決所述技術(shù)問題，基本達(dá)到所述技術(shù)效果。說明書后續(xù) 描述為實(shí)施本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，然所述描述乃以說明本發(fā)明的一般原則為目的，并非 用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。
[0129] 還需要說明的是，術(shù)語"包括"、"包含"或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的 包含，從而使得包括一系列要素的商品或者系統(tǒng)不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確 列出的其他要素，或者是還包括為這種商品或者系統(tǒng)所固有的要素。在沒有更多限制的情 況下，由語句"包括一個……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系統(tǒng)中還 存在另外的相同要素。
[0130]上述說明示出并描述了本發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明 并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、 修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識 進(jìn)行改動。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā) 明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種2型糖尿病脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征在于，包括 W下步驟： (1) 樣品收集； (2) 樣品預(yù)處理：收集的唾液樣品在化內(nèi)置于轉(zhuǎn)速3000r/min的4°C低溫離屯、機(jī)離屯、 lOmin，并按照SOiil/管分裝于凍存管，置于-80°C冰箱冷凍保存?zhèn)溆茫? (3) 納米磁珠活化； (4) 唾液樣品上樣:④取化1唾液樣品，加1化1的U9裂解液，混合解育30min后，加入18扣 1的Wash Buffer稀釋;⑤向含有活化磁珠的PCR管中加入10化1處理好的唾液樣品，室溫解 育30min，置于磁鐵上解育Imin,去除上清液；⑥再往管中加入10化1的Wash Buffer洗脫 5min，然后將PCR管置于磁鐵上解育Imin，去除上清液;⑦重復(fù)步驟⑥一次； (5) 納米磁珠洗脫:每個PCR管中加入IOiil的Elution Buffer,洗脫5min，放置于磁鐵上 解育Imin，取扣1上清液移至另一個PCR管中，并加入扣1的CHCA飽和溶液充分混勻，吸取化1 混合溶液加樣到Au/Steel忍片上，風(fēng)干，然后上機(jī)讀取忍片，收集數(shù)據(jù)； (6) 數(shù)據(jù)采集； (7) 數(shù)據(jù)分析； (8) 建立診斷模型:采用決策樹算法計算出多個變量變化對兩樣本的判別價值，確定診 斷模型。2. 如權(quán)利要求1所述的2型糖尿病脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其 特征在于，步驟（1)所述樣品收集方法為:2型糖尿病脾虛證組和正常對照組在取材前一天 晚上臨睡前清水漱口，之后不再進(jìn)食任何食物和藥物，于第二天清晨起床漱口后空腹取材， 前5min內(nèi)的唾液自然吞下后開始收集，收集到的唾液置于冰浴預(yù)冷的50ml具塞離屯、管內(nèi)， 每個臨床病例共采集唾液樣品2-3毫升，將每個裝有唾液樣本的所述離屯、管置于冰盒里，4 °C保存。3. 如權(quán)利要求2所述的2型糖尿病脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其 特征在于，步驟(3)所述納米磁珠活化方法為:①取WCX納米磁珠50山加入到2(K)山的PCR管， 置于磁鐵上解育Imin，去除上清液;②再加入10化1的Wash Buffer洗脫5min，在磁鐵上解育 Imin，去除上清液，③重復(fù)步驟②一次。4. 如權(quán)利要求3所述的2型糖尿病脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其 特征在于，步驟(6)所述數(shù)據(jù)采集方法為:數(shù)據(jù)采集前，用多膚標(biāo)準(zhǔn)忍片校正儀器，激光離子 流為0.5;采用質(zhì)譜儀讀取忍片信息，設(shè)置激光強(qiáng)度為190，靈敏度為5，收集數(shù)據(jù)的質(zhì)荷比范 圍為2000~25000m/z，信號收集位置40~60,平均每點(diǎn)收集20次，收集總點(diǎn)為100次。5. 如權(quán)利要求4所述的2型糖尿病脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其 特征在于，步驟(7)所述數(shù)據(jù)分析方法為:所有原始數(shù)據(jù)先做總離子強(qiáng)度及分子量校正，使 其達(dá)到均一;對位于2000~25000m/z峰值，過濾噪音，設(shè)置初始的噪音過濾值為5，二次信噪 比為2, W10%為最小闊值進(jìn)行聚類，經(jīng)上述數(shù)據(jù)預(yù)處理后，采用t檢驗(yàn)比較2型糖尿病脾虛 證組和正常對照組唾液蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，找出2組之間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義的蛋白質(zhì)峰， P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。6. 如權(quán)利要求5所述的2型糖尿病脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其 特征在于，步驟(7)中，在質(zhì)譜峰為2000~25000m/z范圍內(nèi)總共檢測到331個差異蛋白峰，其 中有64個在2型糖尿病脾虛證組和正常對照組的差異P<0.001，有極顯著意義，所述64個差 異親化蛋白席略且化如下，
【文檔編號】G01N1/38GK105911287SQ201610209147
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月6日
【發(fā)明人】吳正治, 曹美群, 孫珂煥, 黃飛娟, 楊長青
【申請人】深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所, 吳正治