專利名稱：用于熔化曲線自動分析的系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熔化曲線分析，更具體地涉及用于化合物(諸如核酸或蛋白質(zhì))的熔化曲線自動分析的系統(tǒng)和方法。


圖1是描繪了線性基線熔化曲線分析的圖。圖2是未標(biāo)記探測熔化實驗的未調(diào)整的實驗熔化曲線的圖，該圖示出了低溫下的多個基因型和指數(shù)背景熒光。圖3是用于產(chǎn)生實驗熔化曲線的偏離函數(shù)的方法的一個實施例的流程圖。圖4描繪了發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin structure)的示例性的、未調(diào)整的實驗熔化曲線的圖。圖5描繪了圖4的熔化曲線的導(dǎo)數(shù)圖。圖6描繪了圖4的熔化曲線在減去指數(shù)背景之后的導(dǎo)數(shù)圖。圖7描繪了存在于圖4中的數(shù)據(jù)的偏離函數(shù)的圖。圖8描繪了在指數(shù)背景去除之后，圖4中的數(shù)據(jù)的均一化熔化曲線的圖。圖9描繪了存在于圖4中的數(shù)據(jù)的積分偏離函數(shù)的圖。圖10描繪了在對于復(fù)合基因型減去指數(shù)背景之后的熔化曲線數(shù)據(jù)的導(dǎo)數(shù)圖。圖11描繪了圖10中的熔化曲線數(shù)據(jù)的偏差圖。圖12A描繪了示例性平滑化蛋白質(zhì)熔化曲線。圖12B描繪了圖12A的平滑化蛋白質(zhì)熔化曲線的導(dǎo)數(shù)圖。圖12C描繪了圖12A的蛋白質(zhì)熔化曲線數(shù)據(jù)的偏離函數(shù)圖。圖12D描繪了在背景校正之后的導(dǎo)數(shù)熔化曲線。圖13描繪了圖12A的蛋白質(zhì)熔化曲線的歸一化擴(kuò)展曲線的導(dǎo)數(shù)圖。圖14A描繪了示例性平滑化蛋白質(zhì)熔化曲線。圖14B描繪了圖14A的平滑化蛋白質(zhì)熔化曲線的導(dǎo)數(shù)圖。圖14C描繪了圖14A的蛋白質(zhì)熔化曲線數(shù)據(jù)的偏離函數(shù)圖。圖14D描繪了在背景校正之后的導(dǎo)數(shù)熔化曲線。圖15描繪了圖14A的蛋白質(zhì)熔化曲線的歸一化展開曲線的導(dǎo)數(shù)圖。圖16是用于使用偏差分析來識別陰性樣本的方法的一個實施例的流程圖。圖17是用于使用偏差分析來識別陰性樣本的方法的另一個實施例的流程圖。圖18是用于自動地識別背景和/或熔化曲線的熔化區(qū)域的方法的一個實施例的流程圖。圖19描繪了示例性偏離函數(shù)的圖。圖20是用于自動地識別擴(kuò)增子(amplicon)以及探測背景和/或熔化區(qū)域的方法的一個實施例的流程圖。圖21A是包括擴(kuò)增子和探測熔化區(qū)域的偏差方法的圖。
圖21B是探測熔化區(qū)域的偏離函數(shù)的圖。圖22是用于自動背景去除的方法的一個實施例的流程圖。
圖23A和圖2 描繪了示例性理想和熔化曲線。圖M是用于自動背景去除的方法的另一個實施例的圖。圖25描繪了通過無偏分級方法自動地正確地集群的偏差圖。圖沈描繪了沒有通過無偏分級方法正確地校正的、在指數(shù)背景去除之后的導(dǎo)數(shù)圖。圖27描繪了在PCR熔化分析之后包括陰性樣本的一組未調(diào)整熔化曲線。圖觀描繪了使用振幅截止技術(shù)進(jìn)行陰性樣本排除之后的一組陰性樣本指示器。圖四描繪了在使用偏差分析進(jìn)行陰性樣本排除之后的一組熔化曲線。圖30描繪了在使用背離分析進(jìn)行陰性樣本排除之后的一組陰性樣本指示器。圖31描繪了在探測熔化區(qū)域和擴(kuò)增子熔化區(qū)域的自動定位之后的背離圖。圖32描繪了一組陰性樣本和集群成員指示器。圖33是用于分析熔化曲線數(shù)據(jù)的系統(tǒng)的框圖。通過下面參照附圖對優(yōu)選實施例進(jìn)行的說明，將清楚本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點。
具體實施例方式熔化曲線分析在各種物質(zhì)的研究中非常有用。特別地，已經(jīng)廣泛地通過熔化曲線研究了核酸，其中熔化曲線的差異可以表示不同的核酸序列。熔化曲線也被用來研究蛋白質(zhì)鍵聯(lián)(binding)，其中特征熔化曲線表示特別配體的蛋白質(zhì)鍵聯(lián)吸引力。雖然本文是結(jié)合核酸和蛋白質(zhì)熔化進(jìn)行說明的，但是可以理解的是其他化合物的熔化曲線分析也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在這里的一個實施例中，熔化曲線分析可以提供關(guān)于核酸產(chǎn)品的一致性和/或結(jié)構(gòu)的信息。破壞核酸結(jié)構(gòu)內(nèi)的基團(tuán)-基團(tuán)氫鍵所需的能量的量(例如，DNA的雙(2)鏈之間)可能由于產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)相關(guān)的因素決定。這些因素可以包括(但不限于)長度、互配能力、鳥嘌呤-胞嘧啶(G-C)含量、重復(fù)序列存在或不存在等?？梢酝ㄟ^將梯度能量施加到(例如，加熱)含有核酸產(chǎn)品的溶液而獲得熔化曲線。 隨著能量的添加以及溶液溫度的增加，產(chǎn)品可能變性(例如，分裂)。雖然示例參照了溫度的升高，但是其他熔化方法(例如，梯度地改變離子濃度)也是本領(lǐng)域中已知的。通過測量發(fā)生這種分裂的程度與溫度(或者其他熔化梯度)的函數(shù)關(guān)系，可以產(chǎn)生熔化曲線。例如， 見美國專利No. 5，871，908，通過引用將之結(jié)合在這里。因此，如這里所使用的，熔化曲線可以指的是包括對化合物響應(yīng)于熔化梯度(諸如溫度和離子濃度)而改變其結(jié)構(gòu)的程度進(jìn)行量化的測量結(jié)果(例如，核酸中的鏈分裂的程度與施加到其上的能量梯度的函數(shù)關(guān)系)的任何數(shù)據(jù)組。在一些實施例中，可以電學(xué)地測量分裂。核酸產(chǎn)品(或者其他化合物)也可以被放置在包括鍵聯(lián)染料(binding dye)的溶液中。在結(jié)合到雙鏈DNA (dsDNA)時，鍵聯(lián)染料可以適合于發(fā)射電-光(electro-optical，簡記為E0)輻射隨著產(chǎn)品分裂，鍵聯(lián)染料可以停止發(fā)射EO輻射(例如，隨著溶液的溫度增加)。此外，可以通過獲取從隨著向其施加能量(例如， 隨著溶液的溫度增加)溶液發(fā)射的EO輻射(熒光)的測量結(jié)果而產(chǎn)生熔解曲線。此外，理解本發(fā)明不局限于熒光在熔解期間減小的實施例；在一些實施例中，諸如使用G淬火單標(biāo)記探針的那些實施例中，熒光信號可以在熔解期間增加(例如，見美國專利No. 6，635，427)。因此，熔解曲線可以包括一系列EO輻射測量結(jié)果(例如，從溶液發(fā)射的熒光的測量結(jié)果)與溫度的函數(shù)。然而，本發(fā)明的教導(dǎo)可以應(yīng)用到包括以其他方式獲得的分離測量結(jié)果的其他熔化曲線。因此，本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)被解讀為局限于用于獲取熔化曲線數(shù)據(jù)的特定的方法和/或技術(shù)(例如，用于獲取量化核酸分裂與施加到溶液的能量的函數(shù)關(guān)系的測量結(jié)果)ο如上所述，可以從熔化曲線推斷關(guān)于核酸產(chǎn)品的結(jié)果的信息。因此，熔化曲線數(shù)據(jù)可以被用來研究聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)品?？梢酝ㄟ^在鍵聯(lián)染料存在的情況下，加熱 PCR反應(yīng)的產(chǎn)品來獲取PCR產(chǎn)品的熔化曲線，如下所述，相比于結(jié)合到單鏈長度DNA (ssDNA) 時該曲線在結(jié)合到dsDNA時可以適合于更加強(qiáng)烈地發(fā)出熒光。因此，在相對低的溫度下，在 PCR產(chǎn)品可以主要地存在為dsDNA的情況下，溶液可以以相對高水平發(fā)出熒光。隨著溶液的溫度增加，產(chǎn)品可以分裂(例如變性)為兩個( 鏈的ssDNA，這可以使得在更低水平下發(fā)出熒光。在窄的溫度窗口內(nèi)，PCR產(chǎn)品會經(jīng)歷從dsDNA和ssDNA狀態(tài)的相變。如上所述，這種轉(zhuǎn)變可以減小由溶液發(fā)射的熒光。這種轉(zhuǎn)變發(fā)生的溫度窗口可以被稱作熔化區(qū)域、熔化轉(zhuǎn)變和/或熔化窗口。通常用在這種熔化曲線實驗中的鍵聯(lián)染料可以隨著溫度變化而自然地在溶液中發(fā)出熒光。例如，在不存在dsDNA的情況下，鍵聯(lián)染料(諸如LCGreen Plus(這可以從 Idaho Technology公司買到，并且是其注冊商標(biāo)))的熒光信號可以作為溫度的函數(shù)而單調(diào)減小。因此，以上述方式(例如，通過測量隨著核酸產(chǎn)品和鍵聯(lián)染料被加熱而發(fā)射的EO 輻射)獲得的熔化曲線可以包括由染料化合物發(fā)射到dsDNA產(chǎn)品的熒光與通過溶液中的鍵聯(lián)染料和/或結(jié)合到ddDNA的染料而自然地產(chǎn)生的背景熒光的組合。因此，所測量結(jié)構(gòu)，通過在鍵聯(lián)染料存在的情況下加熱核酸產(chǎn)品而獲得的粗熒光信號，可以被建模為由于產(chǎn)品熔化而產(chǎn)生的熒光與背景熒光的總和(產(chǎn)品隨著溶液被加熱而從dsDNA分裂為ssDNA)。公式1示出了實驗熔化曲線F(T)，實驗熔化曲線F(T)包括“真實”熔化曲線M(T)(例如，通過產(chǎn)品熔化而產(chǎn)生的熒光)和背景熒光B(T)的總和F(T) = M (T)+B (T) 公式(1)如上所述，可以從實驗熔化曲線F(T)推斷和/或判斷關(guān)于核酸產(chǎn)品的信息(例如，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)、成分等)。然而，其背景熒光B(T)成分使得對實驗熔化曲線數(shù)據(jù)F(T)的分析變得復(fù)雜。已經(jīng)發(fā)展了各種系統(tǒng)和方法來建模并從實驗熔化曲線數(shù)據(jù)F(T)去除背景熒光 B(T)信號。在一個示例中，背景熒光B(T)被建模為線性函數(shù)。許多普通染料的熒光隨著溫度而線性地減小(在特定溫度范圍內(nèi)隨溫度增加而降低)。在核酸熔化曲線中，產(chǎn)品的熒光在熔化區(qū)域內(nèi)快速地下降。然而，在熔化區(qū)域之外，熒光隨著溫度的變化是基本線性的。因此，實驗熔化曲線可以通過在熔化轉(zhuǎn)變之前或之后外推線性基線而歸一化。圖1描繪了具有線性基線L1(T)和Ltl(T)的實驗熔化曲線F(T)?？梢詮南禄€ L0(T)上方的實驗熔化曲線F(T)的高度與上、下基線(它們可以具有相同的斜率)之間的差的比例來計算歸一化熔化曲線。圖2描繪了通過在未標(biāo)注探測(probe)存在的情況下將不對稱PCR反應(yīng)的產(chǎn)物熔化而獲得的熔化曲線的圖。所述曲線包括未標(biāo)注探測和PCR產(chǎn)物熔化轉(zhuǎn)變部。如圖2所示，因為上、下基線由于其非線性而穿插到熔化曲線下方，所以上述線性基線方法的使用是有問題的，并且圖1中描繪的線性補(bǔ)償公式的分母變?yōu)榱?0)。在替換方法中，可以使用指數(shù)衰減函數(shù)對背景熒光B(T)建模。在PCT申請 No. W02007/035806中提供了用于指數(shù)背景建模和去除的系統(tǒng)和方法，其申請日為2006 年9 月 20 日，并且題為“MELTING CURVEANALYSIS WITH EXPONENTIAL BACKGROUND SUBTRACTION”，通過弓I用將其全部結(jié)合在這里。實驗證據(jù)提出在特定溫度下(例如，小于85°C的溫度)，來自鍵聯(lián)染料的背景熒光信號可以被精確地建模為以下形式的延遲指數(shù)B(T) = Cea[T_TD公式 2在公式2中，C和a是待從熔化曲線數(shù)據(jù)F(T)擬合的常數(shù)，并且IY是用于指數(shù)的自變量的偏移參數(shù)(下文中描述的指示器位置)，其通常位于熔化曲線F(T)內(nèi)的熔化轉(zhuǎn)變部下方。在其他因素中，由于背景熒光的大小在熔化區(qū)域之前和之后改變，所以公式2的背景熒光的模型不會直接地符合所觀察到的熒光數(shù)據(jù)?；谟脕韺Ρ尘盁晒釨(T)建模的指數(shù)特性(例如，指數(shù)的導(dǎo)數(shù)自身是指數(shù))，可以獲得公式3 B’=aCea(T—n)公式 3根據(jù)背景熒光模型，在熔化過渡區(qū)域之前和之后，產(chǎn)品熔化函數(shù)是恒定的?？梢赃x擇兩個溫度以限定熔化過渡區(qū)域的邊界在熔化過渡區(qū)域之前選擇第一溫度ιγ，并且可以在熔化過渡區(qū)域之后選擇第二溫度τκ。這些溫度可以被稱作為“歸一化指示器”。歸一化指示器IY和Tk可以被用來通過結(jié)合公式2和3而構(gòu)成指數(shù)背景信號B (T)F' (Tl)=B' (Tl) = aC 公式 4aF1(Tr) = B'(Tr) = aCea(T-h)公式 4b所觀察的熒光數(shù)據(jù)的推導(dǎo)可以例如適當(dāng)?shù)厥褂弥行牟罘旨夹g(shù)。公式如和4b可以解出a和C，產(chǎn)生公式fe和恥a = K RJ v 公式 5a
權(quán)利要求
1.一種用于分析熔化曲線數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括獲取實驗熔化曲線數(shù)據(jù)，所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)包括作為溫度的函數(shù)的多個電-光 (EO)輻射測量結(jié)果，通過將包括熒光染料的混合物熔化而獲得所述測量結(jié)果，其中，所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)包括背景EO輻射信號； 獲取所述背景EO輻射信號的模型；計算偏離函數(shù)，所述偏離函數(shù)將所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)與背景EO輻射信號的模型之間的偏差量化為溫度的函數(shù)；以及將所述偏離函數(shù)存儲在計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)上，以用來分析所述混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過將能量梯度施加到包括所述熒光染料的混合物而獲得所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述背景EO輻射信號的模型包括由指數(shù)衰減函數(shù)和二次函數(shù)構(gòu)成的組的其中之一。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括在人機(jī)界面裝置上向用戶呈現(xiàn)所述偏離函數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，計算所述偏離函數(shù)包括將所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)劃分為多個窗口，每個窗口被限定在所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)的區(qū)域內(nèi)；以及計算多個擬合參數(shù)，在各相應(yīng)窗口中計算每個擬合參數(shù)，所述擬合參數(shù)對所述各個窗口內(nèi)的所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)與背景EO輻射信號的模型之間的偏差進(jìn)行量化，其中，所述偏離函數(shù)通過所述擬合參數(shù)形成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述混合物包括核酸樣本，并且其中，通過將所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)擬合到所述背景EO輻射信號的模型來計算所選擇的窗口的擬合參數(shù)，擬合的形式為
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，計算偏離函數(shù)還包括從其減去所述偏離函數(shù)的最小值。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，還包括通過以下步驟來判斷所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)是否包括有效熔化轉(zhuǎn)變區(qū)域計算偏離函數(shù)的最大值與所述偏離函數(shù)的平均值和中值的其中之一的比率；并且在所述比率超出閾值時判斷所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)包括有效熔化轉(zhuǎn)變區(qū)域。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，還包括識別所述偏離函數(shù)的第一溫度區(qū)域內(nèi)的高背景去除指示器和低背景去除指示器；以及使用所述高和低背景去除指示器來計算經(jīng)背景校正的熔化曲線。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，還包括將第一背景溫度識別為所述第一溫度區(qū)域內(nèi)的在所述偏離函數(shù)超出閾值處的最高溫度；限定包括比所述第一背景溫度高和/或與第一背景溫度相等的溫度的指示器探測區(qū)域；以及從所述指示器探測區(qū)域選擇所述高背景去除指示器和低背景去除指示器。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述混合物包括蛋白質(zhì)樣本，所述方法還包括獲得所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)內(nèi)的聚集信號的導(dǎo)數(shù)的模型；以及使用所述導(dǎo)數(shù)信號模型來從所述經(jīng)過背景校正的熔化曲線去除所述聚集信號。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述混合物包括核酸樣本，所述方法還包括 將高背景溫度識別為所述第一溫度區(qū)域內(nèi)所述偏離函數(shù)超出閾值加上第一緩沖常數(shù)處的最高溫度；將低背景溫度識別為所述第一溫度區(qū)域內(nèi)所述偏離函數(shù)超出閾值減去第二緩沖常數(shù)處的最低溫度；限定高探測區(qū)域，所述高探測區(qū)域包括大于和/或等于所述高背景溫度的溫度并且具有預(yù)定寬度；限定低探測區(qū)域，所述低探測區(qū)域包括小于和/或等于所述低背景溫度的溫度并且具有預(yù)定寬度；以及從所述高探測區(qū)域選擇所述高背景去除指示器和從所述低探測區(qū)域選擇所述低背景去除指示器。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，通過使得目標(biāo)函數(shù)最小化來選擇所述高背景去除指示器和所述低背景去除指示器，所述目標(biāo)函數(shù)被構(gòu)造為對所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)與所述背景EO輻射信號的模型之間的誤差進(jìn)行量化。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，還包括 將多個經(jīng)背景校正的熔化曲線彼此比較；基于所述比較，將所述多個經(jīng)背景校正的熔化曲線聚集為兩個以上的組； 基于所述兩個以上的聚集之內(nèi)的背離以及所述兩個以上的聚集之間的背離來計算聚集質(zhì)量度量；以及基于所述聚集質(zhì)量度量來判斷是否改進(jìn)所述背景去除指示器，并且在要改進(jìn)所述背景去除指示器時，調(diào)整所述背景去除指示器，使用經(jīng)調(diào)整的背景去除指示器來計算經(jīng)調(diào)整的經(jīng)背景校正的熔化曲線，以及重新計算所述聚集質(zhì)量度量。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述混合物包括核酸樣本，所述方法還包括 擴(kuò)大所述核酸樣本；通過施加能量梯度來熔化包括核酸樣本和熒光染料的溶液；以及獲取作為溫度的函數(shù)的多個EO輻射測量結(jié)果。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述混合物包括蛋白質(zhì)樣本。
17.一種計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，其包括被構(gòu)造為使得計算裝置執(zhí)行用于分析熔化曲線數(shù)據(jù)的方法的計算機(jī)可讀指令，所述方法包括獲取實驗熔化曲線數(shù)據(jù)，所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)包括作為溫度的函數(shù)的多個電-光 (EO)輻射測量結(jié)果，通過將包括熒光染料的混合物熔化而獲得所述測量結(jié)果，其中，所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)包括背景EO輻射信號；獲取所述背景EO輻射信號的模型；以及計算偏離函數(shù)，所述偏離函數(shù)將所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)與背景EO輻射信號的模型之間的偏差量化為溫度的函數(shù)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，其中，通過將能量梯度施加到包括所述熒光染料的混合物而獲得所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，其中，所述背景EO輻射信號的模型包括由指數(shù)衰減函數(shù)和二次函數(shù)構(gòu)成的組的其中之一。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，所述方法還包括在人機(jī)界面裝置上向用戶呈現(xiàn)所述偏離函數(shù)。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，其中，計算所述偏離函數(shù)包括 將所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)劃分為多個窗口，每個窗口限定在所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)的溫度范圍內(nèi)；以及計算多個擬合參數(shù)，在各個所述窗口中計算每個擬合參數(shù)，所述擬合參數(shù)對所述各個窗口內(nèi)的所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)與背景EO輻射信號的模型之間的偏差進(jìn)行量化，其中，所述偏離函數(shù)通過所述擬合參數(shù)形成。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，其中，所述混合物包括核酸樣本，并且其中，通過將所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)擬合到所述背景EO輻射信號的模型來計算所選擇的窗口的擬合參數(shù)，擬合的形式為 W
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，其中，計算的偏離函數(shù)還包括從其減去所述偏離函數(shù)的最小值。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，所述方法還包括通過以下步驟判斷實驗熔化曲線數(shù)據(jù)是否包括有效熔化轉(zhuǎn)變區(qū)域計算偏離函數(shù)的最大值與所述偏離函數(shù)的平均值和中值的其中之一的比率；并且在所述比率超出閾值時判斷所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)包括有效熔化轉(zhuǎn)變區(qū)域。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，所述方法還包括識別所述偏離函數(shù)的第一溫度區(qū)域內(nèi)的高背景去除指示器和低背景去除指示器；以及使用所述高和低背景去除指示器來計算經(jīng)背景校正的熔化曲線。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，所述方法還包括將第一背景溫度識別為所述第一溫度區(qū)域內(nèi)在所述偏離函數(shù)超出閾值處的最高溫度；限定包括比所述第一背景溫度高和/或與第一背景溫度相等的溫度的指示器探測區(qū)域；以及從所述指示器探測區(qū)域選擇高背景去除指示器和低背景去除指示器。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，其中，所述混合物包括蛋白質(zhì)樣本， 所述方法還包括獲得所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)內(nèi)的聚集信號的導(dǎo)數(shù)的模型；以及使用所述導(dǎo)數(shù)信號模型來從所述經(jīng)過背景校正的熔化曲線去除所述聚集信號。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，其中，所述混合物包括核酸樣本，所述方法還包括將高背景溫度識別為所述第一溫度區(qū)域內(nèi)所述偏離函數(shù)超出閾值加上第一緩沖常數(shù)處的最高溫度；將低背景溫度識別為所述第一溫度區(qū)域內(nèi)所述偏離函數(shù)超出閾值減去第二緩沖常數(shù)處的最低溫度；限定高探測區(qū)域，所述高探測區(qū)域包括大于和/或等于所述高背景溫度的溫度并且具有預(yù)定寬度；限定低探測區(qū)域，所述低探測區(qū)域包括小于和/或等于所述低背景溫度的溫度并且具有預(yù)定寬度；以及從所述高探測區(qū)域選擇所述高背景去除指示器和從所述低探測區(qū)域選擇所述低背景去除指示器。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，其中，通過使得目標(biāo)函數(shù)最小化來選擇所述高背景去除指示器和所述低背景去除指示器，所述目標(biāo)函數(shù)被構(gòu)造為對所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)與所述背景EO輻射信號的模型之間的誤差進(jìn)行量化。
30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，所述方法還包括 將多個經(jīng)背景校正的熔化曲線彼此比較；基于所述比較，將所述多個經(jīng)背景校正的熔化曲線聚集為兩個以上的組； 基于所述兩個以上的聚集之內(nèi)的背離以及所述兩個以上的聚集之間的背離來計算聚集質(zhì)量度量；以及基于所述聚集質(zhì)量度量來判斷是否改進(jìn)所述背景去除指示器，并且在要改進(jìn)所述背景去除指示器時，調(diào)整所述背景去除指示器，使用經(jīng)調(diào)整的背景去除指示器來計算經(jīng)調(diào)整的經(jīng)背景校正的熔化曲線，以及重新計算所述聚集質(zhì)量度量。
31.根據(jù)權(quán)利要求17所述的計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，其中，所述混合物包括核酸樣本，所述方法還包括擴(kuò)大所述核酸樣本；通過施加能量梯度至所述混合物以及增加所述混合物的離子濃度這兩者之一來熔化所述混合物；以及獲取作為溫度和離子濃度這兩者之一的函數(shù)的多個EO輻射測量結(jié)果。
32.一種用于分析熔化曲線數(shù)據(jù)的設(shè)備，包括 包括處理器的計算裝置；獲取模塊，其可以在所述處理器上運(yùn)行并且被構(gòu)造為獲取實驗熔化曲線數(shù)據(jù)，所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)包括通過將包括熒光染料的混合物熔化而獲得的多個電-光(EO)輻射測量結(jié)果，其中，所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)包括背景EO輻射信號；建模模塊，其可以在所述處理器上運(yùn)行并且被構(gòu)造為獲取所述背景EO輻射信號的模型；處理模塊，其可以在所述處理器上運(yùn)行并計算偏離函數(shù)，所述偏離函數(shù)將所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)與背景EO輻射信號的模型之間的偏差進(jìn)行量化，其中，所述處理模塊通過下述方式來計算所述偏離函數(shù)將所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)劃分為多個窗口，每個窗口限定在所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)的區(qū)域內(nèi)，計算多個擬合參數(shù)，每個擬合參數(shù)在一個相應(yīng)的所述窗口中計算，以及對所述各個窗口內(nèi)的所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)與背景EO輻射信號的模型之間的偏差進(jìn)行量化，其中，所述偏離函數(shù)通過所述擬合參數(shù)形成。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其中，基于所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)的分辨率、所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)內(nèi)的感興趣的特征的特性、以及性能度量的其中之一來選擇窗口的寬度。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其中，通過將所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)擬合到所述背景EO輻射信號的模型來計算所選擇的窗口的擬合參數(shù)，擬合的形式為
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其中，所述處理模塊被構(gòu)造為從所述偏離函數(shù)去除所述偏離函數(shù)的最小值。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的設(shè)備，其中，所述處理模塊被構(gòu)造為通過下述方式來判斷實驗熔化曲線數(shù)據(jù)是否包括有效熔化轉(zhuǎn)變區(qū)域計算偏離函數(shù)的最大值與所述偏離函數(shù)的平均值和中值的其中之一的比率，在所述比率超出閾值時判斷所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)包括有效熔化轉(zhuǎn)變區(qū)域，并且在所述比率不超出閾值時判斷所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)不包括有效熔化轉(zhuǎn)變區(qū)域。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的設(shè)備，其中，使用多個偏離函數(shù)來計算所述閾值，每個閾值是使用不同的相應(yīng)實驗熔化曲線數(shù)據(jù)來計算的，并且其中，使用每個所述相應(yīng)偏離函數(shù)的最大值與每個所述相應(yīng)偏離函數(shù)的平均值或中值比率的平均值或中值來計算所述閾值。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的設(shè)備，其中，所述閾值基于所述多個偏離函數(shù)的復(fù)活個比率之內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)差。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的設(shè)備，其中，所述處理模塊被構(gòu)造為識別在所述偏離函數(shù)的第一溫度區(qū)域內(nèi)的高背景去除指示器和低背景去除指示器，以及被構(gòu)造為使用所述高和低背景去除指示器來計算經(jīng)背景校正的熔化曲線數(shù)據(jù)。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的設(shè)備，其中，所述處理模塊被構(gòu)造為將第一背景溫度識別為所述第一溫度區(qū)域內(nèi)在所述偏離函數(shù)超出閾值處的最高溫度；限定包括比所述第一背景溫度更高和/或與第一背景溫度相等的溫度的指示器探測區(qū)域；以及從所述指示器探測區(qū)域選擇高背景去除指示器和低背景去除指示器。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的設(shè)備，其中，所述混合物包括蛋白質(zhì)樣本，其中，所述處理模塊被構(gòu)造為獲得所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)內(nèi)的聚集信號的導(dǎo)數(shù)的模型，以及使用所述導(dǎo)數(shù)信號模型來從所述經(jīng)過背景校正的熔化曲線去除所述聚集信號。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的設(shè)備，其中，所述處理模塊被構(gòu)造為，將高背景溫度識別為所述第一溫度區(qū)域內(nèi)所述偏離函數(shù)超出閾值加上第一緩沖常數(shù)處的最高溫度，將低背景溫度識別為所述第一溫度區(qū)域內(nèi)所述偏離函數(shù)超出閾值減去第二緩沖常數(shù)處的最低溫度，限定高探測區(qū)域，所述高探測區(qū)域包括大于和/或等于所述高背景溫度的溫度并且具有預(yù)定寬度，限定低探測區(qū)域，所述低探測區(qū)域包括小于和/或等于所述低背景溫度的溫度并且具有預(yù)定寬度，以及從所述高探測區(qū)域選擇所述高背景去除指示器和從所述低探測區(qū)域選擇所述低背景去除指示器。
43.根據(jù)權(quán)利要求39所述的設(shè)備，其中，所述處理模塊被構(gòu)造為通過使得目標(biāo)函數(shù)最小化來選擇所述高背景去除指示器和所述低背景去除指示器，所述目標(biāo)函數(shù)被構(gòu)造為對所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)與所述背景EO輻射信號的模型之間的誤差進(jìn)行量化。
44.根據(jù)權(quán)利要求39所述的設(shè)備，其中，所述處理模塊被構(gòu)造為， 將多個經(jīng)背景校正的熔化曲線彼此比較，基于所述比較，將所述多個經(jīng)背景校正的熔化曲線聚集為兩個以上的組， 基于所述兩個以上的聚集之內(nèi)的背離以及所述兩個以上的聚集之間的背離來計算聚集質(zhì)量度量，以及基于所述聚集質(zhì)量度量來判斷是否改進(jìn)所述背景去除指示器，并且在要改進(jìn)所述背景去除指示器時，所述處理模塊被構(gòu)造為， 調(diào)整所述背景去除指示器，使用經(jīng)調(diào)整的背景去除指示器來計算經(jīng)調(diào)整的經(jīng)背景校正的熔化曲線，以及重新計算所述聚集質(zhì)量度量。
45.根據(jù)權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其中，所述混合物包括核酸樣本，所述設(shè)備還包括 被構(gòu)造為獲取所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)的儀器，所述儀器包括用于保持所述混合物的容ο
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的設(shè)備，其中，所述儀器包括熱循環(huán)器。
47.一種用于分析熔化曲線數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括獲取實驗熔化曲線數(shù)據(jù)，所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)包括沿著熔化梯度的多個電-光(EO) 輻射測量結(jié)果，通過將熔化梯度施加至包括EO輻射染料的混合物熔化而獲得所述測量結(jié)果，其中，所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)包括背景EO輻射信號； 獲取所述背景EO輻射信號的模型；計算偏離函數(shù)，所述偏離函數(shù)將所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)與背景EO輻射信號的模型之間的偏差量化為溫度的函數(shù)，計算的方式為將所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)劃分為多個窗口，每個窗口限定在所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)的區(qū)域內(nèi)，計算多個擬合參數(shù)，每個擬合參數(shù)對相應(yīng)窗口內(nèi)的所述實驗熔化曲線數(shù)據(jù)與背景EO 輻射信號的模型之間的偏差進(jìn)行量化，并且通過所述擬合參數(shù)形成所述偏離函數(shù)；以及將所述偏離函數(shù)存儲在計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)上，以用于分析所述混合物。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中，通過施加能量梯度至所述混合物以及增加所述混合物的離子濃度的混合物熔化而獲取實驗熔化曲線數(shù)據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于熔化曲線自動分析的系統(tǒng)和方法。實驗熔化曲線被建模為真實熔化曲線和背景熒光的和?？梢曰趯嶒炄刍€數(shù)據(jù)和背景信號模型來產(chǎn)生偏離函數(shù)?？梢酝ㄟ^將實驗曲線的范圍劃分為多個窗口來生成偏離函數(shù)。在每個窗口內(nèi)，可以計算背景信號的模型與實驗熔化曲線數(shù)據(jù)之間的擬合。所述偏離函數(shù)可以以所得到的擬合參數(shù)形成。所述偏離函數(shù)可以包括背景信號補(bǔ)償以及可以被用在各種熔化曲線分析操作(諸如數(shù)據(jù)可視化、聚集、建立基因組、掃描、陰性樣本去除等)中。所述偏離函數(shù)可以被用來引起自動的背景校正處理。經(jīng)背景校正的熔化曲線還可以被進(jìn)一步處理以去除聚集信號。
文檔編號G06F9/00GK102428459SQ201080021436
公開日2012年4月25日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者卡爾·托馬斯·威特沃, 托馬斯·查爾斯·羅賓斯, 羅伯特·安德魯·帕萊斯 申請人:愛達(dá)荷科技公司, 猶他州立大學(xué)研究基金會