專利名稱：一種用于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理中消除外源性成分干擾的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物代謝學(xué)的數(shù)據(jù)處理方法，具體涉及一種藥物代謝學(xué)數(shù)據(jù)處理中如何剔除外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)的分析方法，經(jīng)消除外源性數(shù)據(jù)干擾后能真實(shí)展現(xiàn)和評價(jià)藥物的整體生物效應(yīng)。
背景技術(shù)：
代謝組學(xué)是“后基因組學(xué)”時(shí)期新興的一門“組學(xué)”技術(shù)，也是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，它是關(guān)于生物體系受刺激或擾動(dòng)后(如將某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后)其代謝產(chǎn)物(內(nèi)源代謝物質(zhì))種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學(xué)。它研究的是生物整體、系統(tǒng)或器官的內(nèi)源性代謝物質(zhì)的代謝途徑及其所受內(nèi)在或外在因素的影響。常用的方法是檢測和 量化一個(gè)生物整體代謝組隨時(shí)間變化的規(guī)律；建立內(nèi)在和外在因素影響下，代謝組整體的變化軌跡，來反映某種病理(生理)過程中所發(fā)生的一系列生物事件。目前，代謝組學(xué)方法已被應(yīng)用于評價(jià)藥物(尤其是中藥)的治療作用。中藥的化學(xué)成分復(fù)雜，其在治療疾病時(shí)主要是藥效組分在多靶點(diǎn)或多器官上發(fā)揮整體綜合調(diào)節(jié)作用，而代謝組學(xué)是研究機(jī)體內(nèi)所有小分子代謝物在受外界因素干擾后的整體變化，恰恰能表征中藥多成分所產(chǎn)生的整體生物效應(yīng)。然而，進(jìn)行代謝組學(xué)研究時(shí)，要求所采用的分析技術(shù)如液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)和核磁共振光譜(NMR)技術(shù)對生物樣品中所有小分子代謝物進(jìn)行全掃描的檢測，這其中包括外源性的藥物原型成分及其代謝物。在隨后的模式識別分析中，這些外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)的存在必定干擾對內(nèi)源性代謝組的建模，將使對藥物整體生物效應(yīng)的評價(jià)發(fā)生偏離。因此，在代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理時(shí)，必須將外源性成分的數(shù)據(jù)徹底剔除，使正確評價(jià)藥物的整體生物效應(yīng)。以往剔除外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)的方法主要有(I)對采集的全掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，如PCA、PLS-DA, 0PLS-DA，抽提引起組間分離的標(biāo)志物，然后進(jìn)行鑒定，如果是外源性成分，則從數(shù)據(jù)中剔除，然后再次進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，如此循環(huán)操作，直到抽提的標(biāo)志物均為內(nèi)源性代謝物，這時(shí)才能進(jìn)行藥物生物效應(yīng)的整體評價(jià)；(2)首先比較給藥組和空白組的圖譜，找出藥物的原型成分和代謝物，然后在代謝組學(xué)數(shù)據(jù)中將這些外源性的成分?jǐn)?shù)據(jù)逐一剔除，最后進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，評價(jià)藥物的整體生物效應(yīng)。上述方法繁瑣費(fèi)時(shí)，而且不能完全剔除外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)的干擾。本發(fā)明提供了一種在代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理過程中，通過有效分組，直接將外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)剔除的分析方法。該方法簡單、快速、徹底，能使藥物的整體生物效應(yīng)得到真正展現(xiàn)和科學(xué)評價(jià)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是將各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行重新合并分成兩組，一組只包含給藥組，另一組包含所有不給藥的組，通常是空白組和模型組，然后進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，抽提只有在給藥組在存在，而在其它不給藥組中響應(yīng)值為零的標(biāo)志物，即為外源性代謝物，將其剔除，從而解決利用代謝組學(xué)方法評價(jià)藥物整體生物效應(yīng)時(shí)如何排除外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)干擾的問題。為解決上述問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案，步驟包括數(shù)據(jù)分組將各實(shí)驗(yàn)組合并分為兩組，一組只包含給藥組，另一組包含所有不給藥的組，通常有空白組、動(dòng)物模型組。數(shù)據(jù)處理應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)的正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA)對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，給出S-Plot圖，或者應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)的偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)進(jìn)行處理，給出Loadings Plot圖，再或者應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)的主成分分析法(PCA)進(jìn)行處理，給出Loadings Plot 圖。數(shù)據(jù)剔除結(jié)合Trend Plot圖，在0PLS-DA分析的S-Plot圖中，或者是在PLS-DA·分析的Loadings Plot圖中，再或者是PCA分析的Loadings Plot圖中，選擇只有在給藥組存在而在另一組中不存在的數(shù)據(jù)點(diǎn)，即為外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)，將這部分?jǐn)?shù)據(jù)剔除。數(shù)據(jù)更新和建模剔除外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)后，更新數(shù)據(jù)組，再進(jìn)行模式識別的PCA分析，在Scores Plot圖中描繪了內(nèi)源性代謝組在藥物治療前后的變化軌跡，從而在整體上評價(jià)藥物的整體生物效應(yīng)。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)是，不需要預(yù)先獲知藥物組成及其代謝物的信息，通過本發(fā)明的分組設(shè)計(jì)，外源性成分將直接暴露在S-Plot圖的一側(cè)或Loadings Plot圖的一個(gè)集中區(qū)域內(nèi)，再根據(jù)外源性成分只有在給藥組存在而在另一組中響應(yīng)值為零的分布特點(diǎn)，能夠?qū)⑵渲苯映樘岢鰜恚缓筇蕹?，?shù)據(jù)更新后可直接進(jìn)行下一步的內(nèi)源性代謝組變化軌跡的分析。這一點(diǎn)對于化學(xué)組成復(fù)雜的中藥尤為重要。


圖I.黃芩干預(yù)酵母誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱證候模型前后尿液UPLC/T0F-MS數(shù)據(jù)直接經(jīng)PCA處理后給出的Scores Plot圖。由于尿液UPLC/T0F-MS數(shù)據(jù)中不僅包含了內(nèi)源性小分子代謝物，還包含了來源于黃芩的外源性代謝物，結(jié)果導(dǎo)致代謝組的整體變化軌跡沒有表現(xiàn)明顯的回歸趨勢，不能說明黃芩的解熱作用。K :空白組；M-10 :模型組；QD-10h :黃芩低劑量組；QG-1Oh :黃芩高劑量組。圖2.黃芩干預(yù)酵母誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱證候模型前后尿液UPLC/T0F-MS數(shù)據(jù)經(jīng)圖3_8中方法剔除外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)后，再經(jīng)PCA處理后給出的Scores Plot圖。圖中的代謝組變化軌跡真正體現(xiàn)了內(nèi)源性代謝組的整體變化，圖中顯示黃芩干預(yù)后機(jī)體內(nèi)源性代謝組表現(xiàn)明顯的回歸趨勢，高劑量組最為明顯，從而證明了黃芩具有解熱作用。K:空白組；M-IO :模型組；QD-10h :黃芩低劑量組；QG-10h :黃芩高劑量組。圖3. OPLS-DA分析的S-Plot圖，圖中標(biāo)有紅色方框的點(diǎn)為要剔除的外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)。圖4.圖3中標(biāo)有紅色方框的數(shù)據(jù)點(diǎn)對于的Trend Plot圖，圖中顯示這些數(shù)據(jù)點(diǎn)只有在黃芩給藥組中存在，而在空白組和模型組中響應(yīng)值為零。K :空白組;M-10 :模型組；QD-IOh :黃芩低劑量組；QG-10h :黃芩高劑量組。圖5. PLS-DA分析的Loadings Plot圖，圖中標(biāo)有紅色方框的點(diǎn)為要剔除的外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)。
圖6.圖5中標(biāo)有紅色方框的數(shù)據(jù)點(diǎn)對于的Trend Plot圖，圖中顯示這些數(shù)據(jù)點(diǎn)只有在黃芩給藥組中存在，而在空白組和模型組中響應(yīng)值為零。K :空白組;M-10 :模型組；QD-IOh :黃芩低劑量組；QG-10h :黃芩高劑量組。圖7. PCA分析的Loadings Plot圖，圖中標(biāo)有紅色方框的點(diǎn)為要剔除的外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)。圖8.圖7中標(biāo)有紅色方框的數(shù)據(jù)點(diǎn)對于的Trend Plot圖，圖中顯示這些數(shù)據(jù)點(diǎn)只有在黃芩給藥組中存在，而在空白組和模型組中響應(yīng)值為零。K :空白組;M-10 :模型組；QD-IOh :黃芩低劑量組；QG-10h :黃芩高劑量組。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過下面的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的解釋，但并不意味著本發(fā)明僅限于此。實(shí)施實(shí)例 黃芩干預(yù)酵母誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱證候模型的代謝組學(xué)評價(jià)I.實(shí)驗(yàn)方案與樣品采集40只Wistar大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、黃芩高劑量組(12g生藥/kg體重)、黃芩低劑量組(3g生藥/kg體重)；模型組、黃芩高劑量組、黃芩低劑量組應(yīng)用干酵母造模，皮下注射干酵母(10ml/kg體重)，空白組皮下注射等體積的無菌生理鹽水；黃芩高、低劑量組分別于造模后4h、8h灌胃給予黃芩水煎液，空白組和模型組給予同體積的蒸餾水；造模前三天用代謝籠收集24h尿液，每日上午8點(diǎn)收集I次，連續(xù)3d，尿液于冰水浴中收集；于干酵母造模后6h、10h、18h、24h、30h、36h各時(shí)間點(diǎn)的分別收集尿液I次,尿液于冰水浴中收集。收集的尿液置于超低溫(-70°C )冰箱中保存。2.樣品處理取冷凍保存的尿液，自然融化，用蒸餾水稀釋5倍后于13000rpm離心15分鐘，吸取上清液供UPLC/T0F-MS檢測。3.樣品測定儀器超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC/T0F-MS)檢測系統(tǒng)(美國WatersAcquity UPLC液相色譜儀，配備四元梯度泵-在線真空脫氣機(jī)-自動(dòng)進(jìn)樣器-柱溫箱-二極管陣列檢測器；美國Waters LCT Premier飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,配備電噴霧離子源-正負(fù)離子掃描方法-Lockspray)色譜條件色譜柱ACQUITYUPLC BEH C18column (50mmX 2. lmmi. d.，I. 7um,Waters Corp, Milford, USA);流速 0. 40ml/min ;柱溫45°C :流動(dòng)相A 0. I % 甲酸水溶液，B :0. I %甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序(表I)。柱后流出液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測。質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)，采用正離子掃描檢測；毛細(xì)管電壓為1500V ;樣本錐孔電壓為60V ;離子源溫度為110°C ;脫溶劑溫度為350°C ;脫溶劑氣流量為700L/h ;錐孔氣流量為20L/h ;微通道板電壓為2450V ;每0. 2s采集一次譜圖；準(zhǔn)確質(zhì)量校正采用亮氨酸-腦啡肽(leucine-enk印halin，[Μ+Η]+556· 2771)溶液；掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍 m/z 50-1000。表I梯度洗脫程序表
權(quán)利要求
1.代謝組學(xué)方法評價(jià)藥物整體生物效應(yīng)時(shí)，一種清除外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)干擾的方法，所述方法包括步驟 (1)數(shù)據(jù)分組，即將空白組和動(dòng)物模型組合并為一組，將給藥組單獨(dú)組成一組。
(2)數(shù)據(jù)處理，即應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)的正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA)對(I)中分成的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，給出S-Plot圖，或者應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)的偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)進(jìn)行處理，給出Loadings Plot圖，再或者應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)的主成分分析法(PCA)進(jìn)行處理，給出Loadings Plot圖。
(3)數(shù)據(jù)剔除，即結(jié)合TrendPlot圖，在OPLS-DA分析的S-Plot圖中，或者是在PLS-DA分析的Loadings Plot圖中，再或者是PCA分析的Loadings Plot圖中，選擇只有在給藥組存在而在另一組中不存在的數(shù)據(jù)點(diǎn)，即為外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)，將這部分?jǐn)?shù)據(jù)剔除。
2.一種如權(quán)利要求I (I)所述的數(shù)據(jù)分組方法，其特征在于將不含外源性成分(如藥物及其代謝物)數(shù)據(jù)的所有組合并為一組，將含有外源性成分(如藥物及其代謝物)數(shù)據(jù)的所有組合并為另一組。
3.—種如權(quán)利要求1(2)所述的數(shù)據(jù)處理方法，其特征在于應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)的正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA)或者偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)再或者主成分分析法(PCA)進(jìn)行處理。
4.一種如權(quán)利要求1(3)所述的數(shù)據(jù)剔除方法，其特征在于外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)集中分布于S-Plot圖中的一端,或者是Loadings Plot圖中的一個(gè)區(qū)域,并且Trend Plot圖中顯示這些數(shù)據(jù)點(diǎn)只存在于給藥組中，而在另一組中不存在，這些數(shù)據(jù)點(diǎn)即為要剔除的外源性數(shù)據(jù)點(diǎn)。
5.權(quán)利要求I中的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，是指利用液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)，生物樣本包括血液、尿液、腦脊液、唾液、組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)液。
6.權(quán)利要求I中的藥物包括化學(xué)藥物、中藥、中藥復(fù)方。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從海量的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)中剔除外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)的分析方法。該方法特征在于將各實(shí)驗(yàn)組合并分為兩組，一組包含所有不給藥的組，通常包括空白組和模型組，另一組只包含給藥組，然后利用多變量統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行處理，抽提只有在給藥組中存在，而在其它組中均不存在的標(biāo)志物，即為外源性成分，然后將其數(shù)據(jù)剔除，數(shù)據(jù)更新后再進(jìn)行下一步的模式識別分析。該方法能夠簡單、快速、完全地排除外源性成分?jǐn)?shù)據(jù)的干擾，從而使反映藥物(尤其是中藥)整體生物效應(yīng)的機(jī)體內(nèi)源性代謝組的整體變化獲得真實(shí)展現(xiàn)和科學(xué)評價(jià)。
文檔編號G06F19/18GK102930182SQ20111023085
公開日2013年2月13日 申請日期2011年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月12日
發(fā)明者劉樹民, 閆廣利, 柳長鳳, 盧芳 申請人:劉樹民