用于胎兒和母體紅細胞計數(shù)的系統(tǒng)和方法
【專利說明】用于胎兒和母體紅細胞計數(shù)的系統(tǒng)和方法
[0001]本申請要求享有2012年9月13日遞交的美國臨時專利申請申請?zhí)枮镹0.61/700, 659的優(yōu)先權，此專利申請以引用的方式全部并入本文。
技術領域
[0002]本發(fā)明主要涉及用于細胞分析的圖像處理領域，尤其涉及用于區(qū)分和計數(shù)胎兒和母體紅細胞的系統(tǒng)和方法。
【背景技術】
[0003]在北美，每年有超過600萬次的妊娠。新生兒Rh血型不合溶血病是一種嚴重的同種免疫情況，胎兒紅細胞(RBCs)經(jīng)胎盤由母體免疫系統(tǒng)破壞。在妊娠期間或分娩過程中，少數(shù)胎兒的紅細胞可進入母體的血液循環(huán)。如果母體為Rh陰性，而胎兒為Rh陽性時，母體的身體會產生對抗Rh抗原的抗體(IgG)。這個過程被稱為致敏過程。最常見的，致敏過程在分娩時(約85%的致敏病例)發(fā)生，但胎兒的血液也可在妊娠時較早地進入母體循環(huán)(約15%的致敏病例)(參見 J.M.Bowman and J.M.Pollock, “Rh-1mmunizat1n duringPregnancy and Grandmother Theory,，，Journal of Pediatrics, vol.93, pp.313-314，1978)。在此期間或以后妊娠過程中IgG能夠通過胎盤進入胎兒體內，從而引起Rh陽性胎兒紅細胞的破壞。
[0004]所有妊娠的白種人中有約1/10是一個Rh陰性婦女懷著一個Rh陽性嬰兒的情況，其中13%的Rh陰性母親是致敏的(參見A.S.Prasad, EcL，Acquired hemolyticanemias.1n: Bick RL, ed.Hema to logy: Clinical and Laboratory Practice.St.Louis: Mosby-Yearbook, Inc., 1993)0除了造成貧血，胎兒-母體出血可能對胎兒造成如神經(jīng)系統(tǒng)損傷、死胎或新生兒死亡的災難性后果(B.J.Wylie and Μ.E.D’Alton,“Fetomaternal hemorrhage” Obstet.Gynecol., Vol.115, pp.1039-51，2010)。許多存活下來的嬰兒也會有嚴重疾病。診斷和治療需要確定胎兒-母體出血量(即，已經(jīng)進入母體循環(huán)的胎兒血液量)，這通常實施于Rh-陰性母體，用以確定藥物的所需劑量，使用Rho(D)免疫球蛋白(RhIg)以抑制母體內Rh抗體的形成并防止Rh-陽性幼兒將來發(fā)生Rh血型不合溶血病。
[0005]除Rh血型不合溶血病外，胎兒-母體出血也可以由胎兒和母體循環(huán)之間的正常生理屏障完整性缺乏而引起，此時也必須在妊娠監(jiān)護時定量以方便及時治療(例如，輸血)(C.J.Chen, S.N.Cheng, C.M.Lee, F.ff.Chang, C.C.ffu, and Y.S.Yuh,“Fetomaternal hemorrhage,” J.Med.Sc1., Vol.23, pp.231-34，2003)。量化胎兒-母體出血的標準臨床方法是Kleihauer-Betke (KB)試驗(Z.Y.Wang, J.ff.Shi,Y.L.Zhou, and C.G.Ruan, “Detect1n of red blood cell-bound immunoglobulin Gby flow cytometry and its applicat1n in the diagnosis of autoimmune hemolyticanemia,” Interna t1nal Journal of Hematology, vol.73, pp.188—193， 2001)。試驗利用胎兒與母體血紅蛋白對酸耐受的差異性(胎兒血紅蛋白耐受更顯著)。由母體血液制備標準血涂片(PBS溶液1:1000稀釋)。經(jīng)干燥、染色和孵育后，血涂片切片由通過認證的技術人員在顯微鏡下計數(shù)。由于胎兒血紅蛋白對檸檬酸鹽緩沖液耐受，得到的亮粉色細胞被歸類為胎兒細胞。然后可以計算出胎兒-母體出血的百分比。
[0006]KB試驗的重要組成部分，是胎兒與母體紅細胞的計數(shù)。目前這種計數(shù)由經(jīng)過培訓的技術人員通過顯微鏡目鏡計數(shù)并至少人工完成2000個細胞。人工計數(shù)大約需要15分鐘，同時存在固有的不一致性和不可靠性。
[0007]雖然文獻有記載術語“自動檢測胎兒紅細胞”，但是并沒有對自動計數(shù)胎兒和母體紅細胞的方法的記載，也沒有對區(qū)別這兩種細胞的方法的記載。文獻中已經(jīng)記載的工作中(參見 D.M.V Pelikan, ff.E.Mesker, S.a Scherjon, H.H.H.Kanhai, and H.J.Tanke, “Improvement of the Kleihauer-Betke test by automated detect1n of fetalerythrocytes in maternal blood,，， Cytometry.Part B，Clinical cytometry, vol.54, n0.1, pp.1-9, Jul.2003 以及 D.M.Pelikan, S.a Scherjon, ff.E.Mesker,G.M.de Groot-Swings, G.G.Brouwer-Mandema, H.J.Tanke, and Η.H.Kanhai,“Quantificat1n of fetomaternal hemorrhage: a comparative study of the manualand automated microscopic Kleihauer-Betke tests and flow cytometry in clinicalsamples, ” American journal of obstetrics and gynecology, vol.191, n0.2, pp.551-7，Aug.2004)，這些工作過程中的自動化是指使用商業(yè)化的機械載物臺采集細胞圖像。圖像先用綠色濾光器采集，然后經(jīng)由紅色濾光器的第二次掃描再次被采集。因此，圖像采集需要使用裝有綠色吸收濾光器和紅色吸收濾光器的顯微鏡。技術人員基于染色的強度和分布型態(tài)從母體紅細胞中區(qū)分胎兒紅細胞。在KB切片中的細胞總數(shù)也是人工估算的。
[0008]圖像處理方法已經(jīng)被開發(fā)用于其它類型細胞的計數(shù)，但還未用于計數(shù)紅細胞。在一項研宄中(參見 N.Bandekar, A.Wong D.Clausi and M.Gorbet, “A novel approachto automated cell counting for studying human corneal epithelial cells,，，Intn，I Conf.1EEE EMBS, Boston, pp.5997-6000, 2011)，細胞計數(shù)是通過非最大抑制和種子區(qū)域生長以分割聚集的角膜上皮細胞來進行的。盡管如此，這種算法只應用灰度和空間信息，使得它難以檢測血影細胞和分割那些聚集的細胞。在另一項研宄中，霍夫圓形轉換被用于自動計數(shù)培養(yǎng)瓶中細胞集落(參見J.M.Bewes et al., “Automated cellcolony counting and analysis using the circular Hough image transform algorithm(CHiTA), Phys.Med.B1l., Vol.53，pp.5991-6008，2008)。強度梯度和圓形霍夫轉換被用來區(qū)分集落邊緣和檢測細胞。在這些嚴重重疊的細胞欠分割不可避免的情況下，使用這種方法定量低濃度的細胞集落是有效的。此外，污染物不能在計數(shù)結果中剔除。
[0009]現(xiàn)有技術的專利包括CellVis1n 公司的 US6341180、US7327901 和 US7835077 ；和 Nextslide Imaging 公司的公開專利 US2011/0170760、Nexcelom B1science 公司的US2010/0189338,B1-RadLaboratories 公司的 US2012/0314092。后述三者與本發(fā)明相關。
[0010]Nextslide Imaging公司的US2011 / 0170760 “臨床血液學的網(wǎng)絡圖像檢查”，公開了建立基于互聯(lián)網(wǎng)的數(shù)據(jù)庫進行細胞數(shù)字成像分析的方法。用戶通過因特網(wǎng)上傳細胞圖像，并且所述圖像在遠程服務器上進行處理。其并未公開細胞計數(shù)的方法。
[0011]CellaVis1n AB公司申請的專利號為7835077的專利，“包括有平臺定位裝置的顯微鏡系統(tǒng)”，公開了一個屈曲系統(tǒng)以調整樣本的垂直位置，從而保持樣本在聚焦位置。
[0012]由B1-Rad Laboratories公司申請的“細胞計數(shù)系統(tǒng)和方法”，如在US2012/0314092中公開的，介紹了使用樣本的數(shù)字圖像計數(shù)細胞數(shù)量的系統(tǒng)。裝載有一份細胞的樣品裝載器可被插入系統(tǒng)的對應槽位，并且系統(tǒng)具有能自動調整樣品裝載器相對位置的運動機制。在樣本裝載器的轉動和平移過程中采集不超過三個圖像。樣品上的大部分區(qū)域會被遺漏使得計數(shù)準確度并不可靠。此外，該系統(tǒng)僅適用于低細胞濃度的樣品的測試。
[0013]因此，現(xiàn)有技術沒有公開用于計數(shù)和區(qū)分母體和胎兒紅細胞的自動地且能充分地定性的方法或系統(tǒng)