一種外周血胎兒游離dna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種外周血胎兒游離DNA提取方法，包括1）取孕婦外周血，離心取上清液；2）取步驟1）得到的上清液于離心管中，加等體積消化液和蛋白酶復(fù)合物，55~62℃孵育；3）把步驟2）得到的樣品在冰上冷卻，沉淀蛋白，離心；4）轉(zhuǎn)移步驟3）上清液與0.8倍體積磁珠混懸液混合，室溫孵育；5）將步驟4）得到的樣品置于磁力架上靜置吸附后，吸取上清；6）將步驟5）得到的上清與磁珠混懸液室溫孵育，置于磁力架上靜置吸附后，棄掉上清，75%酒精洗滌2次，即得磁珠-目的DNA復(fù)合體；7）采用DNA洗脫液，將步驟6）獲得的磁珠-目的DNA復(fù)合體在DNA洗脫液中旋渦振蕩，置于磁力架上靜置，吸取上清液，得到目的DNA。
【專利說明】一種外周血胎兒游離DNA提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種核酸提取方法，具體上的涉及一種脫氧核糖核酸(DNA)的提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002]基因組DNA提取一般需遵循以下幾個(gè)原則:1、保證提取的DNA具有一定的長(zhǎng)度；
2、排除有機(jī)溶劑和金屬離子污染；3、蛋白質(zhì)、多糖、脂類等降低到最低程。C ;4、排除其他核酸分子的污染。對(duì)于范圍在2-10ml血樣的基因組DNA提取，經(jīng)典方法是用SDS、蛋白酶k消化，再用酚氯仿反復(fù)抽提，此過程用到了有毒的苯酚、氯仿、異戊醇等溶劑，苯酚對(duì)皮膚有強(qiáng)烈的腐蝕作用，可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)；而氯仿易揮發(fā)，能分解出有毒氣體，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。吸入后對(duì)心、腎、肝有損害；異戊醇吸入或經(jīng)皮膚吸收有麻醉作用，對(duì)皮膚和呼吸道有刺激，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂。酚氯仿法操作繁瑣、耗時(shí)耗力，極易造成樣本的丟失和污染。尤其應(yīng)用于外周血胎兒游離DNA檢測(cè)時(shí)，由于外周血中胎兒游離DNA含量較低，采用酚氯仿法時(shí)，需要的樣本量較大，其有毒溶劑用量多，檢測(cè)過程復(fù)雜，容易發(fā)生污染和樣本丟失的問題更加突出，因此迫切需要無毒且操作步驟簡(jiǎn)單，提取時(shí)間段的提取試劑和方法。
[0003]有鑒于上述的缺陷，本設(shè)計(jì)人，積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)設(shè)外周血胎兒游離DNA提取方法，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種外周血胎兒游離DNA提取方法。
[0005]本發(fā)明提供了一種外周血胎兒游離DNA提取方法，其特征在于包括以下步驟
1)、取2~1ml孕婦外周血，3~6°C1600g離心8_12min，將上清液于:T6°C 16000g離心8-12min后再取上清液；
2)取步驟I)中經(jīng)16000g離心得到的上清液于離心管中，加等體積消化液和蛋白酶復(fù)合物，55~62 °C孵育30min ；
3)把步驟2)得到的樣品在冰上冷卻，然后加入NH4AC沉淀蛋白，并充分混勻，5000g離心 4_6min ；
4)轉(zhuǎn)移步驟3)上清液與0.8倍體積磁珠混懸液混合，室溫孵育1min ；
5)將步驟4)得到樣品置于磁力架上靜置吸附后，吸取上清；
6)將步驟5)得到的上清液與1.5倍體積磁珠混懸液室溫孵育lOmin，置于磁力架上靜置吸附后，棄掉上清液，用75%酒精洗滌2次，即得磁珠-目的DNA復(fù)合體。
[0006]7)采用DNA洗脫液，將步驟6)獲得的磁珠-目的DNA復(fù)合體在DNA洗脫液中旋渦振蕩，置于磁力架上靜置，吸取上清液，得到目的DNA。
[0007]所述的外周血胎兒游離DNA提取方法，優(yōu)選
步驟I)為:取2~1ml孕婦外周血，4°C 1600g離心10min，將上清液于4°C 16000g離心1min后再取上清液。
[0008]步驟2)為:取步驟I)中經(jīng)16000g離心得到的上清液得到的上清液于離心管中，加等體積消化液和蛋白酶復(fù)合物，60V孵育30min。
[0009]步驟3)為:把步驟2)得到的樣品在冰上冷卻，然后加入NH4AC沉淀蛋白，并充分混勻，5000g離心5min。
[0010]本發(fā)明提供的外周血胎兒游離DNA提取方法，采用磁珠吸附方法將提取外周血DNA，與現(xiàn)有的酚氯仿法相比，避免了苯酚、氯仿、異丙醇等有毒試劑的使用，且操作步驟簡(jiǎn)單，磁珠通過靜電作用能和DNA結(jié)合在一起，能吸附溶液中的DNA，且本發(fā)明提供的方法，針對(duì)胎兒游離DNA在外周血中含量較低的特點(diǎn)，采用了兩次加入磁珠混懸液吸附的方法，能夠更有針對(duì)性的提取外周血中的胎兒游離DNA。通過乙醇清洗，可以去除DNA中的其他小分子污染，DNA提取完全且純度高，與酚氯仿法提取的DNA樣品相比，本法提取的DNA樣品，除了適用于巢式PCR擴(kuò)增外，還可以適用于普通PCR擴(kuò)增，顯著的降低了后續(xù)檢測(cè)的成本。

【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0012]實(shí)施例1外周血胎兒游離DNA提取方法
樣品類型:新鮮外周血，取自孕周為12~37的健康婦女一.實(shí)驗(yàn)步驟 1)取2ml孕婦外周血，4°C1600g離心10min，所得上清液于4°C 16000g離心1min后再取上清液；
2)取步驟I)經(jīng)ieooog離心得到的上清液于離心管中，加等體積消化液和蛋白酶復(fù)合物，60°C孵育 30min ；
3)把步驟2)得到的樣品在冰上冷卻，然后加入NH4AC沉淀蛋白，并充分混勻，5000g離心 5min ；
4)轉(zhuǎn)移步驟3)上清液與0.8倍體積磁珠混懸液混合，室溫孵育1min ；
5)將步驟4)得到樣品置于磁力架上靜置吸附后，吸取上清，
6)將步驟5)得到的上清液與1.5倍體積磁珠混懸液室溫孵育lOmin，置于磁力架上靜置吸附后，棄掉上清液，用75%酒精洗滌2次，即得磁珠-目的DNA復(fù)合體。
[0013]7)采用DNA洗脫液，將步驟6)獲得的磁珠-目的DNA復(fù)合體在DNA洗脫液中旋渦振蕩，置于磁力架上靜置，吸取上清液，得到目的DNA。
[0014]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種外周血胎兒游離DNA提取方法，其特征在于包括以下步驟: 1)取2~1ml孕婦外周血，3~6°C1600g離心8_12min，將上清液于:T6°C 16000g離心8-12min后再取上清液； 2)取步驟I)中經(jīng)16000g離心得到的上清液于離心管中，加等體積消化液和蛋白酶復(fù)合物，55~62 °C孵育30min ； 3)把步驟2)得到的樣品在冰上冷卻，然后加入NH4AC沉淀蛋白，并充分混勻，5000g離心 4_6min ； 4)轉(zhuǎn)移步驟3)上清液與0.8倍體積磁珠混懸液混合，室溫孵育1min ； 5)將步驟4)得到樣品置于磁力架上靜置吸附后，吸取上清； 6)將步驟5)得到的上清與1.5倍體積磁珠混懸液室溫孵育lOmin，置于磁力架上靜置吸附后，棄掉上清液，用75%酒精洗滌2次，即得磁珠-目的DNA復(fù)合體； 7)采用DNA洗脫液，將步驟6)獲得的磁珠-目的DNA復(fù)合體在DNA洗脫液中旋渦振蕩，置于磁力架上靜置，吸取上清液，得到目的DNA。
2.如權(quán)利要求1所述外周血胎兒游離DNA提取方法，其特征在于，所述步驟I)為:取2~1ml孕婦外周血，4°C 1600g離心10min，將上清液于4°C 16000g離心1min后再取上清液。
3.如權(quán)利要求1所述外周 血胎兒游離DNA提取方法，其特征在于，所述步驟2)為:取步驟I)中經(jīng)16000g離心得到的上清液于離心管中，加等體積消化液和蛋白酶復(fù)合物，60°C孵育30min。
4.如權(quán)利要求1所述外周血胎兒游離DNA提取方法，其特征在于，所述步驟3)為:把步驟2)得到的樣品在冰上冷卻，然后加入NH4AC沉淀蛋白，并充分混勻，5000g離心5min。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104164417SQ201410292018
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】張丹丹, 葉樺, 陸慶宇, 閻賀, 張廣春 申請(qǐng)人:北京圣谷同創(chuàng)科技發(fā)展有限公司