淫羊藿苷的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及淫羊藿苷的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細胞具有多向分化潛能和自我更新的能力,在細胞替代治療、基因治療、組織工 程等方面具有良好的應(yīng)用前景。近年來關(guān)于干細胞基礎(chǔ)與臨床的研宄突飛猛進、日新月異, 使人們對干細胞有了更深刻的理解。從全能性胚胎干細胞(ES細胞)的研宄,到成體干細 胞的發(fā)現(xiàn),再到人們通過體細胞重新編程而得到的誘導全能干細胞(iPS),無不體現(xiàn)了科研 工作者對干細胞研宄的智慧和傾注的心血。人們對于干細胞的大規(guī)模、常規(guī)臨床應(yīng)用報以 了極大的熱情和希望,但是由于胚胎干細胞的免疫排斥反應(yīng)、致瘤性、倫理道德問題等因素 的制約,極大的限制了其臨床應(yīng)用。
[0003] 通過體細胞重新編程而得到iPS是近年干細胞研宄的熱點,人們采用體細胞核移 植(SNCT),利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將特定基因(Oct-4、Nanog等)、小分子非病毒載體導入體細胞 等方法均成功獲得了 iPS。0ct_4和Nanog是兩種維持干細胞多能性和自我更新的最為重 要的轉(zhuǎn)錄因子。它們通常只在多能干細胞中表達,在分化細胞中不表達。目前多采用成纖 維細胞、表皮細胞作為供體細胞進行逆分化而獲得多能性細胞,這些研宄工作證明了細胞 的逆分化性。但成纖維細胞、表皮細胞均為終末分化細胞,其逆分化能力差、重編程為多能 性細胞所需要的時間比較長、效率低。最新研宄表明,應(yīng)用具有一定干細胞特性的成體干細 胞可以更加容易的得到iPS,如Kim等報道:神經(jīng)干細胞可以簡化重編程步驟得到iPS ;同 時研宄表明,體外應(yīng)用小分子化合物可以增加體細胞逆分化比例,提高逆分化效率。
[0004] 然而,現(xiàn)階段所用成體細胞移植治療某些疾病,但成體細胞多能性差,影響治療效 果,現(xiàn)在傳統(tǒng)誘導細胞多能性的方案是病毒或基因改造,這樣處理的細胞不利于移植給人 或者動物。
[0005] 人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUMSCs)是近年人們從胎兒臍帶華爾通氏膠(Whartonps Jelly)部位分離得到的基質(zhì)細胞。hUCMSCs具有一定干細胞特性,其多向分化潛能和可塑 性已得到證實。特定條件下,hUCMSCs可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、胰島細胞、 神經(jīng)細胞、心肌細胞以及生殖細胞等。鑒于臍帶間充質(zhì)具有一定的分化多能性、可塑性強、 排異反應(yīng)低、無倫理道德爭議等優(yōu)點,hUMSCs將有望成為自體與同種異體移植及細胞替代 治療的理想細胞來源。雖然hUCMSCs具有一定干細胞特性,但其分化能力仍具有一定局限 性。若能利用藥物干預誘導hUCMSCs,使其獲得像ES -樣的多能性,則可以避免應(yīng)用胚胎干 細胞所產(chǎn)生的免疫排斥、倫理問題及應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導iPS所致的操作復雜性、致瘤性 等缺點。
[0006] 中醫(yī)學"腎藏精"理論認為腎精的盛衰決定著人體的生長、發(fā)育與生殖,其內(nèi)涵及 功能與干細胞具有多向分化及自我增殖的能力密切相關(guān),而且許多補腎益精中藥具有促進 干細胞分化及增殖的功能。鑒于此,本發(fā)明以〇ct-4多能性調(diào)控基因為切入點,通過觀察常 用補腎中藥有效成分對hUMSCs多能性調(diào)控基因Oct-4表達的影響,篩選出影響hUMSCs多 能性的補腎中藥活性成分;通過考察所篩選出的活性成分對hUMSCs向內(nèi)、中、外三胚層細 胞分化的影響,確證補腎中藥活性成分誘導hUMSCs多能性的作用及應(yīng)用價值。
[0007] 在諸多補腎中藥有效成分中,淫羊藿苷為小檗科植物淫羊藿(Epimedium grandiflorum Morr.)的地上部分,分子式為C33H4(l015,分子量676. 65,為淡黃色針狀結(jié)晶, 熔點231-232°C。溶于乙醇、乙酸乙酯、不溶于醚、苯、氯仿。淫羊藿苷具有促進造血功能、免 疫功能及骨代謝等功效,現(xiàn)代藥理實驗研宄表明:淫羊藿能增加心腦血管血流量、促進造血 功能、免疫功能及骨代謝,具有抗衰老、抗腫瘤等功效,被用于本申請誘導hUMSCs多能性的 研宄中。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供淫羊藿苷的新用途。
[0009] 為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0010] 淫羊藿苷在增強干細胞多能性中的用途。
[0011] 優(yōu)選的,上述淫羊藿苷的用途,通過淫羊藿苷處理干細胞,提高干細胞多能性,再 移植干細胞給動物。
[0012] 優(yōu)選的,上述淫羊藿苷的用途,應(yīng)用于誘導培養(yǎng)用于治療急性肝損傷或腦缺血損 傷時的待移植細胞的培養(yǎng)液。
[0013] 優(yōu)選的,上述淫羊藿苷的用途,所述誘導培養(yǎng)細胞的方法為:臍帶間充質(zhì)干細胞于 含有100 yM淫羊藿苷的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)7天,每3天換液一次,培養(yǎng)條件為37°C、5% C02, 得到多能性增強的干細胞,所述完全培養(yǎng)基為DMEM-F12培養(yǎng)基+20% FBS (胎牛血清)+1 % LG (谷氨酰胺)+1 % PS (青霉素鏈霉素)+10ng/mlEGF (表皮生長因子)+10ng/mlbFGF (堿性 成纖維生長因子)。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是:
[0015] 淫羊藿苷作用臍帶間充質(zhì)干細胞一周能夠增強其多能性,促進其向神經(jīng)細胞,心 肌細胞,胰島細胞的分化,明確了 hUMSCs(人臍帶間充質(zhì)干細胞)體外具有向三胚層細胞分 化的能力,體內(nèi)實驗建立代表三個胚層不同器官的損傷模型,移植ICA干預后的hUMSCs,通 過評價模型動物各項機能指標和移植細胞分化能力情況,進一步驗證了補腎中藥活性成分 對hUMSCs分化多能性的影響。同時通過研宄淫羊藿苷對臍帶間充質(zhì)干細胞在基因組整體 水平的變化,表明淫羊藿苷作用臍帶間充質(zhì)干細胞一周后,能夠降低多能性調(diào)控基因〇ct-4 甲基化水平和促進組蛋白H3K9乙?;?。
[0016] 通過實驗驗證,最終結(jié)果表明淫羊藿苷作用于臍帶間充質(zhì)干細胞后能夠增強其多 能性,揭示出淫羊藿苷作用于臍帶間充質(zhì)干細胞的分子生物學機制,為臍帶間充質(zhì)干細胞 廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學提供理論和實驗依據(jù)。
【附圖說明】
[0017] 圖1是hUCMSCs的原代及傳代培養(yǎng)形態(tài)學變化圖(倒置顯微鏡,X 100),a :原代 培養(yǎng)5天,b :原代培養(yǎng)一周,c :原代培養(yǎng)兩周,d :傳代培養(yǎng)P1 ;
[0018] 圖2是免疫熒光細胞化學染色結(jié)果圖,
[0019] a:CD29(X400),b:CD44(X400),c:CD90(X200) ;d:C45(X200),e:CD31(X200), f:CD34(X200);
[0020] 圖3是流式細胞術(shù)檢測人臍帶間充質(zhì)干細胞表型圖;
[0021] 圖4是淫羊藿苷上調(diào)人臍帶間充質(zhì)干細胞多能性基因Oct-4表達圖,
[0022] *P〈0. 05. **P〈0. 01 ;
[0023] 圖5是向神經(jīng)樣細胞誘導形態(tài)變化圖,
[0024] a:對照組(X100) ;b:誘導 4h(X100) ;c:誘導 6h(X200);
[0025] 圖6是免疫熒光鑒定結(jié)果圖,
[0026] a:對照組,b :nestin,c:GFAP,d :Map_2 (X 200);
[0027] 圖7是向心肌細胞誘導形態(tài)變化圖,
[0028] a:對照組(X2〇0) ;b:誘導 4 周組(X2〇0);
[0029] 圖8是RT-PCR檢測cTNI mRNA表達結(jié)果圖,
[0030] a:內(nèi)參基因GAPDH;b:目的基因cTNI;1 :未誘導組;2 :誘導組;
[0031] 圖9是向胰島細胞誘導形態(tài)變化圖,
[0032]a未誘導組(X 100),b誘導12天組(X 100);
[0033] 圖10是雙硫腙染色結(jié)果圖,
[0034]a:未誘導組(X200),b:誘導 12 天組(X200);
[0035] 圖11是細胞移植3天對小鼠血肌酐和尿素氮的影響圖;
[0036] 圖12是細胞移植7天對小鼠血肌酐和尿素氮的影響圖;
[0037] 圖13是活體成像系統(tǒng)對腎組織體外拍照結(jié)果圖一一細胞移植3d和7d腎組織熒 光信號強度,備注:腎組織依次的順序為對照組、模型組、MSC組、MSC+I組;
[0038] 圖14是細胞移植3天和7天腎組織熒光信號強度圖;
[0039] 圖15是細胞移植3d對腎組織形態(tài)學的影響(X 100)圖;
[0040] 圖16是細胞移植7d對腎組織形態(tài)學的影響(X 100)圖;
[0041] 圖17是細胞移植3d hUCMSCs向腎小管上皮細胞分化情況(X 200)圖,其中,紅色 熒光為DIR標記hUCMSCs、綠色熒光為腎小管上皮細胞標記物Cadherin、藍色熒光為DAPI;
[0042] 圖18是細胞移植7d hUCMSCs向腎小管上皮細胞分化情況(X 200)圖,其中,紅色 熒光為DIR標記hUCMSCs、綠色熒光為腎小管上皮細胞標記物Cadherin、藍色熒光為DAPI;
[0043] 圖19是四氯化碳造模24小時對小鼠ALT和AST的影響圖;
[0044] 圖20是細胞移植3天對小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響圖;
[0045] 圖21是細胞移植7天對小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響圖;
[0046] 圖22是移植細胞3天和7天對肝臟系數(shù)的影響圖;
[0047] 圖23是細胞移植3d和7d肝組織熒光信號強度圖,備注:肝組織依次的順序為對 照組、模型組、MSC組、MSC+I組;
[0048] 圖24是細胞移植3天和7天肝組織熒光信號強度圖;
[0049] 圖25是細胞移植3d對肝組織形態(tài)學的影響(X 100)