一種木霉菌疏水蛋白及其編碼基因、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種木霉菌疏水蛋白及其編碼基因、應(yīng)用，特別涉及木霉菌分生孢子 合成及其合成調(diào)控相關(guān)基因，尤其涉及調(diào)控木霉分生孢子合成的基因在調(diào)控木霉菌分生孢 子產(chǎn)量方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 木霉作為一種重要的生防菌，廣泛分布于幾乎所有的溫帶及熱帶地區(qū)。木霉 是一種非常重要的生防菌，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、抑制病原菌生長(zhǎng)、產(chǎn)生抗生素、次級(jí)代謝 產(chǎn)物、誘導(dǎo)植物抗性等多種功能。目前研究較多的主要有5種具有生防潛力：哈茨木霉 (Trichoderma harzianum)、綠色木霉（T.viride)、康寧木霉（T.koningii)、鉤狀木霉 (T. hamatum)和長(zhǎng)枝木霉（T. longibratum)。尤其哈茨木霉菌得到研究者的越來(lái)越多的關(guān) 注，Bigirimana發(fā)現(xiàn)哈茨木霉菌株T39接種蠶豆根部后，導(dǎo)致蠶豆對(duì)灰霉病菌的抗性明顯 提高。木霉菌分泌多種酶類，抗性物質(zhì)，不僅能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)（酶類），而且能進(jìn)行生物防 治農(nóng)業(yè)土傳病害應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。對(duì)于能增加分生孢子的一種疏水蛋白，也就能通過基因 工程的手段增加木霉菌的生物量，即具有重要的應(yīng)用前景。
[0003] 疏水蛋白最早是研究細(xì)菌與寄主吸附機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)并提出的，泛指覆蓋在微生物細(xì) 胞表面的一些疏水物質(zhì)（hydrophobic substances)。學(xué)者研究裂裙菌（Schizophyllum commune)氣生菌絲缺陷型thn時(shí)，發(fā)現(xiàn)其與sc3基因表達(dá)受到阻止相關(guān)，同時(shí)也找到了與 sc3基因同源的其它子實(shí)體特異性基因。這類基因編碼的蛋白組成的疏水性氨基酸含量較 高，同時(shí)與細(xì)胞壁的疏水性密切有關(guān)，因而被稱之為疏水蛋白。疏水蛋白的分子量一般比較 小，約100個(gè)氨基酸，大小在10kDa左右，全部氨基酸中疏水的占一半樣子，在保守位置上含 8個(gè)半胱氨酸殘基形成4對(duì)二硫鍵，氨基酸親水-疏水性特征圖譜決定了其具獨(dú)特而相似的 水緣性圖譜特征。疏水蛋白包括兩種類型，I型疏水蛋白能形成膜，同時(shí)它們僅能在有機(jī)溶 劑和2 % SDS中溶解，II型疏水蛋白較容易溶解在60 %甲醇或者2 % SDS中。
[0004] 研究孢子量調(diào)控是非常有意義的一項(xiàng)工作。孢子對(duì)真菌具有重要的作用，不僅對(duì) 增加生物量占據(jù)生態(tài)位具有作用，而且對(duì)繁衍生殖孢子就要特殊的意義。疏水蛋白與產(chǎn)孢 率的關(guān)系雖已報(bào)導(dǎo)，如禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum)中II類疏水蛋白Hyd5突變株 Fg A hyd5的產(chǎn)孢子大小和孢子數(shù)量都變小了，但屬致病菌相關(guān)研究；致病菌與生防菌屬于 不同的生物類群，生物學(xué)特性迥異，研究方案存在顯著差異，致病菌疏水蛋白的研究在現(xiàn)實(shí) 中不能給予生防菌研究以技術(shù)啟示，而作為生防菌中的一種的木霉菌，其疏水蛋白與孢子 產(chǎn)量的關(guān)系如何還屬本領(lǐng)域空白，需要本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行針對(duì)性的探究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的在于尋找與木霉分生孢子量相關(guān)的功能基 因，提供一種木霉菌疏水蛋白及其編碼基因、應(yīng)用，進(jìn)而提供一種增加孢子量的方法，為提 高孢子含量木霉工程菌提供技術(shù)方法；所述基因命名為Thhyd2,該基因編碼的蛋白具有典 型的8個(gè)Cys基序并形成4對(duì)二硫鍵，且受逆境誘導(dǎo)表達(dá)。通過構(gòu)建Thhyd2基因的過表達(dá) 載體并轉(zhuǎn)化到木霉菌中，成功過表達(dá)了木霉菌hyd2基因，所得的轉(zhuǎn)基因木霉菌轉(zhuǎn)化子分生 孢子數(shù)增加，氣生菌絲也有所增加。體外通過原核表達(dá)的方式對(duì)改疏水蛋白進(jìn)行了表達(dá)，在 培養(yǎng)基中添加表達(dá)的疏水蛋白，能夠略微增加孢子量和氣生菌絲。本發(fā)明將為獲得高產(chǎn)孢 率拮抗生防菌提供了重要的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供一種木霉菌疏水蛋白（hydrophobin)，包括如下（a)或（b) 所示的氨基酸序列：
[0008] (a) SEQ ID No : 1所示氨基酸序列；
[0009] (b)SEQ ID No :1所示氨基酸序列經(jīng)過1~10個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加 而衍生的蛋白質(zhì)，并且所衍生的蛋白質(zhì)具有與（a)所述蛋白質(zhì)相同的功能。
[0010] SEQ ID No :1所示由99個(gè)氨基酸殘基組成，其中第80位至第99位氨基酸殘基是 hydrophobin2 結(jié)構(gòu)域；
[0011] 所述取代、缺失或添加的一至十個(gè)氨基酸殘基可以是非所述結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘 基，其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行取代、缺失或添加，以及對(duì)相 關(guān)功能的檢測(cè)可以通過本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0012] 第二方面，本發(fā)明提供一種編碼所述木霉菌疏水蛋白（hydrophobin)的基因的序 列。
[0013] 優(yōu)選地，所述基因的cDNA序列如SEQ ID No :2所示。
[0014] 本發(fā)明的木霉菌hydrophobin蛋白基因Thhyd2可以是其cDNA序列，也可以是基 因組DNA序列，或者是與這些序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。 例如序列表中SEQID N0 :2所示的DNA序列。
[0015] 第三方面，本發(fā)明提供一種所述基因在木霉菌工程菌株構(gòu)建中的應(yīng)用。
[0016] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用具體包括用于提高木霉工程菌株的分生孢子產(chǎn)量。
[0017] 第四方面，本發(fā)明提供一種用所述基因提高木霉菌菌株分生孢子產(chǎn)量的方法，所 述方法為：
[0018] 通過重疊PCR的方法，將TrpC啟動(dòng)子序列、TrpC終止子序列和所述基因融合成過 表達(dá)框；
[0019] 將通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將所述過表達(dá)框轉(zhuǎn)化到木霉菌株中，即可獲得分生孢 子產(chǎn)量提高的木霉菌轉(zhuǎn)化子、提高分生孢子產(chǎn)量。
[0020] 優(yōu)選地，所述過表達(dá)框的構(gòu)建具體如下：
[0021] 以SEQ ID No :11、SEQ ID No :12為引物擴(kuò)增TrpC啟動(dòng)子序列，得片段1 ;
[0022] 以SEQ ID No : 13、SEQ ID No : 14為引物擴(kuò)增所述基因序列，得片段2 ;
[0023] 以SEQ ID No :11、SEQ ID No :14為引物，以所述片段1、片段2為模板，融合擴(kuò)增 得所述片段1、片段2的融合片段1 ;
[0024] 以SEQ ID No : 15、SEQ ID No : 16為引物，擴(kuò)增TrpC終止子序列，得片段3 ;
[0025] 以SEQ ID No :11、SEQ ID No :16為引物，融合擴(kuò)增得所述融合片段1和片段3得 所述基因的表達(dá)框。
[0026] 第五個(gè)方面，本發(fā)明提供一種通過所述方法構(gòu)建的木霉菌轉(zhuǎn)化子。
[0027] 優(yōu)選地，所述木霉菌包括茨木霉菌為T. harzianum T28。
[0028] 本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌的Thhyds是受逆境的誘導(dǎo)而表達(dá)。通過融合PCR技術(shù) 在木霉菌中過表達(dá)Thhyd2基因，獲得轉(zhuǎn)基因木霉轉(zhuǎn)化子，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化子中分 生孢子的含量相對(duì)野生型要高很多。由此推測(cè)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，過表達(dá)某些Thhyds，可為 獲得高分生孢子含量木霉工程菌種提供重要的科學(xué)依據(jù)。鑒于該類基因的應(yīng)用價(jià)值及其利 用潛力的應(yīng)用前景，有必要通過專利加以保護(hù)。
[0029] 通過木霉菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行de novo拼接，利用所獲得的木霉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以 及NCBI公布的木霉基因組序列片段和EST片段進(jìn)行曲霉同源hydrophobin的Blast分析， 本發(fā)明的相關(guān)研究獲得了一些木霉菌hydrophobin蛋白（Thhyds)成員。其中，設(shè)計(jì)引物 克隆了 Thhyd2的0RF全長(zhǎng)序列（SEQ ID N0:2)，其編碼的蛋白序列如序列表中的SEQ ID No :1所示。序列分析結(jié)果表明，該蛋白含有保守的hydrophobin2結(jié)構(gòu)域。其次，利用通過 RT-PCR及Real-timePCR發(fā)現(xiàn)該基因是-C (缺碳源）和H202誘導(dǎo)而表達(dá)的（圖1)。
[0030] 基于上述研究，本發(fā)明通過過表達(dá)技術(shù)構(gòu)建了 Thhyd2基因的Overexpression轉(zhuǎn) 基因載體，成功獲得了過表達(dá)在木霉菌細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化子，所獲得的轉(zhuǎn)基因木霉 轉(zhuǎn)化子擁有分生孢子含量相對(duì)對(duì)照明顯升高的表型?？梢?，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，過表達(dá)Thhyd2 基因能夠獲得高分生孢子的轉(zhuǎn)基因木霉菌，這使得高分生孢子的工程菌成為可能，為提高 木霉發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量提供了一種有效的技術(shù)手段。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)例中，首先，為構(gòu) 建Thhyd2的Overexpression表達(dá)載體，選擇此基因cDNA讀碼框片段（序列表SEQ ID N0 : 2)為Overexpression的表達(dá)序列，曲霉菌TrpC啟動(dòng)子序列（SEQ ID NO :3)和TrpC終止 序列（SEQ ID NO :4)分別作為目的表達(dá)基因的引導(dǎo)序列和終止序列，設(shè)計(jì)引物分別獲得上 述三段序列，然后通過融合PCR技術(shù)使其形成一個(gè)完整表達(dá)框。如圖2所示，該載體中的除 了 TrpC啟動(dòng)子引導(dǎo)表達(dá)Thhyd2表達(dá)盒之外，還有由TrpC啟動(dòng)子引導(dǎo)表達(dá)Hygromycin表 達(dá)框的抗性篩選標(biāo)記。之后，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105,并經(jīng)由農(nóng)桿菌將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入木霉 菌T28中。進(jìn)而，通過Real-timePCR方法對(duì)Thhyd2表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，所獲得 的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化子中Thhyd2的表達(dá)量明顯增高（圖3)。
[0031] 針對(duì)Thhyd2_0verexpression木霉菌轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化子，利用血球板計(jì)數(shù)板測(cè)定了在 28°C在SM和SM(缺碳源）培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天，測(cè)定分生孢子的量。相比對(duì)照野生型孢子量， 過表達(dá)轉(zhuǎn)化子分生孢子量有提高明顯（圖4)。通過原核表達(dá)Hyd2蛋白，添加到5 yM Hyd2 蛋白到SM培養(yǎng)基中，野生型木霉菌的分生孢子書有所增加（圖5)。因此，本發(fā)明為獲得提 高分生孢子含量木霉工程菌提供重要的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 通過閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0033] 圖l、Real-time PCR檢測(cè)低糖㈧和H202逆境下⑶Thhyd2的表達(dá)變化，其中：低 糖、5mM H202條件下Thhyd2誘導(dǎo)表達(dá)明顯，以Actin為內(nèi)參；
[0034] 圖2、Thhyd2_0verexpression木霉表達(dá)載體構(gòu)建示意圖，該載體中，Thhyd2過表 達(dá)引導(dǎo)和終止序列分別為TrpC啟動(dòng)子和終