gtgggcagcagcctgtgtgtgcctgggtt ctctctatcccggaatgtgccaacaatggaggtgtttacctgtctcagaccaagga (SEQ ID NO :3))的特征 序列的引物對A2V-F和A2V-R :
[0054] A2V-F:5' -GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3'（SEQ ID NO :4);
[0055] A2V-R:5' -TCCTTGGTCTGAGACAGGTA-3'（SEQ ID NO :5);
[0056] (3)可以擴增內(nèi)參基因 GAPDH片段的引物對中GAPDH-F和GAPDH-R :
[0057] GAPDH-F:5' -CCCCACACACATGCACTTACC-3'（SEQ ID NO :6);
[0058] GAPDH-R:5' -CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3'（SEQ ID NO :7);
[0059] (4)特異性檢測21. 9-F和21. 9-R擴增產(chǎn)物的熒光探針21. 9-Prob為：
[0060] 21. 9-Prob:5' -6-FAM-CTGGGGAAGGGTGGGTGGGAATAACAGC-BHQ-1-3'（SEQ ID NO : 8)；
[0061] (5)特異性檢測A2V-F和A2V-R擴增產(chǎn)物的熒光探針A2V-Prob為：
[0062] A2V-Prob:5, 6-R0X-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-3, BHQ-I (SEQ ID NO :9) 〇
[0063] (6)特異性檢測GAPDH-F和GAPDH-R擴增產(chǎn)物的熒光探針GAPDH-Prob為：
[0064] GAPDH-Prob:5' -CY5-AAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGC-BHQ2-3'（SEQ ID NO : 10) 〇
[0065] 上述內(nèi)參基因 GAPDH 片段的序列參見（Zimmermann B1Holzgreve W1Wenzel F,Hahn S.Novel real-time quantitative PCR test for trisomy 21.Cl in Chem. 2002Feb ;48 (2) : 362-3.)，具體如下：
[0066] CCCCACACACATGCACTTACCTGTGCTCCCACTCCTGATTTCTGGAAAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAA CTTGGCAA(SEQ ID NO :11)。
[0067] (7)其它組成成分：
[0068] GoldStar Taq DNA Polymerase、與 GoldStar Taq DNAPolymerase 配套的緩沖液 和dNTPs均購自康為世紀(jì)，MgCl2購自Life Technology。
[0069] 按下述表1配制PCR反應(yīng)體系：
[0070] 表1 : (mM 表不 mmol/L，μ M 表不 μ mol/L)
[0071] CN 105176995 A 說明書 5/7 頁
[0072] 2、實施方法：
[0073] PCR反應(yīng)所用儀器為Bio-Rad實時熱循環(huán)儀CFX96。PCR反應(yīng)程序為：95°C預(yù)變性 10分鐘，然后95°C 15秒，60°C退火60秒，40個循環(huán)，于60°C退火步驟末采集熒光信號。
[0074] 樣本處理：米用 Lab-Aid DNAmini extraction kid (Bio-V, Xiamen)試劑盒抽提 DNA，以雙蒸水稀釋至20~200ng/ μ L備用。DNA樣本也可采用其他常規(guī)DNA提取方法提 取。
[0075] 樣本檢測：將已知基因型待檢樣本2份（其中1份為已知含有 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC基因型待檢樣本（簡稱1#樣本）；另一份為已知含有-α 21·9基因型待檢樣本（簡稱2#樣本）），以及1份正?；蛐停é?α/α α，Ν/Ν)樣本（簡稱3# 樣本），根據(jù)上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，于熒光定量PCR儀上進行擴增檢測，記錄Cq值。
[0076] 3、樣本來源：所有樣本均來源自經(jīng)常規(guī)Gap-PCR技術(shù)確定基因型的DNA樣本。
[0077] 4、數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判定：根據(jù)實時熒光PCR儀自帶的分析軟件分析判讀結(jié)果。若 CY5通道有Cq值讀數(shù)，則表示該樣本被正常擴增；
[0078] 在CY5通道有讀數(shù)的前提下，若ROX通道有讀數(shù)，則表示該樣本攜帶 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC 等位基因；
[0079] 在CY5通道有讀數(shù)的前提下，若ROX通道沒有Cq值讀數(shù)，則表示該樣本不攜帶 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC 等位基因；
[0080] 在CY5通道有讀數(shù)的前提下，若FAM通道有Cq值讀數(shù)，則表示該樣本攜帶-α 21·9等位基因；
[0081] 在CY5通道有讀數(shù)的前提下，若FAM通道沒有Cq值讀數(shù)，則表示該樣本不攜 帶-α21·9等位基因。
[0082] 經(jīng)檢測分析，1#樣本的CY5通道有Cq值且ROX通道有Cq值（擴增曲線如圖1 所示，Cq值讀數(shù)由表2所示），表示1#樣本攜帶HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC等位基 因；2#樣本的CY5通道有Cq值且FAM通道有Cq值（擴增曲線如圖2所示，Cq值讀數(shù)由 表3所示），表示2#樣本攜帶-α 21·9等位基因；3#樣本的CY5通道有Cq值且ROX通道和 FAM通道沒有Cq值（擴增曲線如圖3所示，Cq值讀數(shù)由表4所示），表示3#樣本不攜帶 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC等位基因也不攜帶-α 21·9等位基因。
[0083]表 2 :
[0089] 可見，采用本發(fā)明所述試劑盒進行-α 21·9缺失型和α 2變異等位基因檢測時，結(jié)果 準(zhǔn)確；而且野生型樣本無非特異性Cq值，具有較高的特異性。
[0090] 實施例2 :本發(fā)明所述試劑盒在隨機基因型樣本中的檢測效果。
[0091] 1、試劑盒的組成：
[0092] 同實施例1。
[0093] 2、實施方法：
[0094] 同實施例1。
[0095] 3、樣本來源：
[0096] 樣本為5例隨機樣本（由欽州市婦幼保健院提供），以雙蒸水稀釋至20~ 200ng，作為待檢樣本），以及經(jīng)Gap-PCR和測序驗證的1例野生型樣本，1例攜帶 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC等位基因樣本，1例攜帶-α 21·9等位基因樣本。
[0097] 4、數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判定：
[0098] 根據(jù)實時熒光定量PCR儀自帶的分析軟件分析判讀結(jié)果；當(dāng)CY5通道有Cq值讀數(shù) 時，則該樣本被正常擴增；
[0099] 在CY5通道有讀數(shù)的前提下，若ROX通道有讀數(shù)，則表示該樣本攜帶 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC 等位基因；
[0100] 在CY5通道有讀數(shù)的前提下，若ROX通道沒有Cq值讀數(shù)，則表示該樣本不攜帶 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC 等位基因；
[0101] 在CY5通道有讀數(shù)的前提下，若FAM通道有Cq值讀數(shù)，則表示該樣本攜帶-α 21·9等位基因；
[0102] 在CY5通道有讀數(shù)的前提下，若FAM通道沒有Cq值讀數(shù)，則表示該樣本不攜 帶_α21·9等位基因。
[0103] 表 5 :
[0105] 注：樣本類型中Neg Ctrl =陰性對照，Pos Ctrl =陽性對照，Unkn =未知樣本類 型，檢測結(jié)果中，N/A=無 Cq值。
[0106] 結(jié)果顯示，野生型樣本與陽性樣本檢出Cq值與理論一致，隨機樣本中檢出1例攜 帶 HBA2: c. 30 l-24deIinsCTCGGCCC 等位基因。
【主權(quán)項】
1. 基于水解探針法的可同時檢測地中海貧血-a21'9缺失型和a2變異的試劑盒，包括 擴增引物和熒光探針，其特征在于： 所述〇2變異為€1-珠蛋白基因簇（如_000006.1)中€[2基因的變異基因型，該基因 型被描述為HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC; 所述的擴增引物為：一對可以擴增a-珠蛋白基因簇中-a21'9等位基因的特征序列的 引物21. 9-F和21. 9-R，一對可以擴增a-珠蛋白基因簇中HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC 等位基因的特征序列的引物A2V-F和A2V-R，以及一對可以擴增內(nèi)參基因GAPDH片段的引物 GAPDH-F和GAPDH-R; 所述的熒光探針為：一條特異性檢測21. 9-F和21. 9-R擴增產(chǎn)物的熒光探針 21. 9-Prob，一條特異性檢測A2V-F和A2V-R擴增產(chǎn)物的熒光探針A2V-Prob，一條特異性檢 測GAPDH-F和GAPDH-R擴增產(chǎn)物的熒光探針GAPDH-Prob; 其中： 所述可以擴增a-珠蛋白基因簇中-a21'9等位基因的特征序列的引物對中， 21. 9-F:5' -GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3' ； 21. 9-R:5' -TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3' ； 所述可以擴增a-珠蛋白基因簇中HBA2 :c. 301-24delinsCTCGGCCC等位基因的特征序 列的引物對中， A2V-F:5' -GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3' ； A2V-R:5' -TCCTTGGTCTGAGACAGGTA-3' ； 所述可以擴增內(nèi)參基因GAPDH片段的引物對中， GAPDH-F:5' -CCCCACACACATGCACTTACC-3' ； GAPDH-R:5' -CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3' ； 所述特異性檢測21. 9-F和21. 9-R擴增產(chǎn)物的熒光探針21. 9-Prob為： 21.9-Prob:5' -6-FAM-CTGGGGAAGGGTGGGTGGGAATAACAGC-BHQ-1-3' ； 所述的特異性檢測A2V-F和A2V-R擴增產(chǎn)物的熒光探針A2V-Prob為： A2V-Prob:5' -6-R0X-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-BHQ-1-3' ； 所述的特異性檢測GAPDH-F和GAPDH-R擴增產(chǎn)物的熒光探針GAPDH-Prob為：GAPDH-Prob:5' -CY5-AAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGC-BHQ-2-3'。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒還包括緩沖液、酶液、 MgCljPdNTP。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于水解探針法的可同時檢測地中海貧血-α21.9缺失型和α2變異的試劑盒。所述α2變異為α-珠蛋白基因簇(NG_000006.1)中α2基因的變異基因型，該基因型被描述為HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC。上述試劑盒包括一對可以擴增-α21.9等位基因的特征序列的引物，一對可以擴增α2變異等位基因的特征序列的引物，一對可以擴增內(nèi)參基因GAPDH片段的引物；特異性檢測-α21.9擴增產(chǎn)物的探針，特異性檢測α2變異等位基因擴增產(chǎn)物的探針和特異性檢測GAPDH片斷擴增產(chǎn)物的探針。上述試劑盒可單管單次反應(yīng)直接完成α2變異和-α21.9基因型的檢測。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105176995
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】龍駒, 龐婉容
【申請人】欽州市婦幼保健院
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月26日