專利名稱：一種檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及使用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,簡(jiǎn)稱Lm)是一種人畜共患食源性致病菌，可使人畜患腦膜炎、心肌炎、敗血癥、早產(chǎn)等疾病，危害較大。李斯特氏菌亦是食源性四大病原菌之一，在環(huán)境中無(wú)處不在，在絕大多數(shù)食品中都能找到李斯特氏菌。肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實(shí)是李斯特氏菌的感染源，這使得食品在儲(chǔ)運(yùn)加工過程中容易被Lm污染。該菌在4°C環(huán)境下仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此,在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中必須加以重視。李斯特氏菌中毒嚴(yán)重的可引起血液和腦組織感染，很多國(guó)家都已經(jīng)采取措施來控制食品中的李斯特氏菌，并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。其中，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是唯一能引起人類疾病的。Lm的致病性與多種毒力因子有關(guān)，包括李斯特氏菌溶血素(KListeriolysin0，簡(jiǎn)稱LL0)、內(nèi)化素、磷脂酶C、ActA蛋白等，由hly基因(GenBank:HM589598.1)編碼的LLO是該菌侵染力的重要組成成分，是Lm的主要毒力因子。因此，針對(duì)Lm DNA中的hly基因提供一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異性高的檢測(cè)方法成為目前食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)的迫切需要
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的方法，該方法利用針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的毒力相關(guān)基因hly的特異性引物和Taqman熒光探針特異性檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。該方法能夠快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異地檢測(cè)食品中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的存在。本發(fā)明利用熒光定量PCR技術(shù)，針對(duì)李斯特氏菌屬特異性毒力相關(guān)基因(hly基因)設(shè)計(jì)引物和Taqman突光探針。hly 基因上游引物序列:5’ -CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3’ (SEQ ID NO:1)hly 基因下游引物序列:5’ -CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3’ (SEQ ID NO:2)Taqman 熒光探針:5’-CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3’ (SEQ ID NO:3)。對(duì)探針進(jìn)行5’端FAM標(biāo)記。反應(yīng)條件為:95°C 5分鐘；95°C 15秒、60°C 45秒、(收集熒光)，共40個(gè)循環(huán)。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的毒力相關(guān)基因hly基因的特異性引物和Taqman熒光探針，其中，hly基因上游引物序列:5’-CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3’ (SEQ ID NO:1) ;hly 基因下游引物序列:5，-CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3 ’ (SEQ ID NO:2) ；Taqman 熒光探針:5’ -CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3’ (SEQ ID NO:3)。
本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選地，進(jìn)一步包括聚合酶及反應(yīng)緩沖液，優(yōu)選地，所述聚合酶為Taq酶。優(yōu)選地，使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的反應(yīng)條件為:95°C 5分鐘；95°C 15秒、60 0C 45秒、(收集熒光)，共40個(gè)循環(huán)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果如下:(1)敏感:熒光PCR檢測(cè)技術(shù)是綜合了 PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯像技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測(cè)靈敏度很高。(2)特異:使用特異性引物和探針雙重對(duì)靶分子進(jìn)行識(shí)別，特異性好、準(zhǔn)確性高、假陽(yáng)性低。(3)簡(jiǎn)便安全:操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高、防污染。擴(kuò)增和檢測(cè)可以在同一管內(nèi)檢測(cè)，不需要開蓋，不易污染。(4)快速:速度快、高通量，可在2內(nèi)小時(shí)完成。


圖1為顯示Lm陽(yáng)性的擴(kuò)增曲線的圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例實(shí)施例1.引物和探針設(shè)計(jì)l)hly基因引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)可擴(kuò)增一段80_120bp片段的引物，相關(guān)參數(shù)為:Tm值55.(TC -60.0°C，GC值40.0% -60.0%，引物大小20±3bp。所設(shè)計(jì)的引物序列如下:上游引物:5’-CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3’ (SEQ ID NO:1)下游引物:5’-CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3，(SEQ ID NO:2)3)探針設(shè)計(jì)在引物擴(kuò)增片段內(nèi)設(shè)計(jì)探針，相關(guān)參數(shù)為:Tm值68.0 °C -70.0 °C，GC值40.0% -70.0%，對(duì)探針進(jìn)行5’端FAM標(biāo)記，其序列如下:探針:5’-CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3’ (SEQ ID NO:3)上述引物和探針均由上海生工合成。實(shí)施例2.Lm菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法Lm標(biāo)準(zhǔn)菌株(中國(guó)藥品生物制品檢定研究所)經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302-02)按照說明書的步驟提取DNA。具體過程為PCR儀上將30 μ I包括下表中組分的反應(yīng)體系(其中樣本基因組DNA是從Lm標(biāo)準(zhǔn)菌株中提取的基因組DNA)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的方法，該方法利用針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的毒力相關(guān)基因hly的特異性引物和Taqman熒光探針來特異性檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，其中，所述hIy基因的上游引物序列為5 ’ -CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3 ’;所述hIy基因的下游引物序列為5’ -CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3’;所述Taqman熒光探針的序列為5， -CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3，。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，反應(yīng)條件為95°C5分鐘；95°C 15秒、60°C 45秒、(收集熒光)，共40個(gè)循環(huán)。
3.—種檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的毒力相關(guān)基因hly的特異性引物和Taqman熒光探針，其中，所述hly基因的上游引物序列為5 ’ -CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3 ’ ；所述hly基因的下游引物序列為5 ’ -CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3 ’ ；所述Taqman熒光探針的序列為5， -CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3，。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中，使用所述試劑盒進(jìn)行反應(yīng)的條件為95°C5分鐘；950C 15秒、60°C 45秒、(收集熒光)，共40個(gè)循環(huán)。
5.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括聚合酶及反應(yīng)緩沖液。
6.如權(quán)利要求5所 述的試劑盒，其中，所述聚合酶為Taq酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種一步檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的方法和試劑盒，該方法利用熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)Lm菌的毒力相關(guān)基因hly進(jìn)行特異性擴(kuò)增，從而進(jìn)行是否污染了Lm的檢測(cè)。該方法能快速、簡(jiǎn)便、特異地檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的存在。
文檔編號(hào)C12R1/01GK103215344SQ201210017868
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者賈斌, 姜君, 陳唯軍, 馮華華, 劉利成, 吳偉立 申請(qǐng)人:北京世紀(jì)盈和科技發(fā)展有限公司, 北京華大基因研究中心有限公司