一株具有廣譜抑菌特性的植物乳桿菌ab-1及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾盟酸面團中的植物乳桿菌 (Lactobaci1lusplantarum)AB-1，還涉及所述植物乳桿菌在抑制致病菌、作為食品發(fā)酵劑 或在植物生物農(nóng)藥或果蔬保鮮劑中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 當今世界，食品安全問題已經(jīng)被大眾認為是主要的公共衛(wèi)生安全問題，然而，食品 微生物污染問題是食品安全的主要問題之一。食品微生物的污染主要是細菌污染，特別是 常見致病性的單細胞李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌等細菌均 能引起食源性疾病，這一問題已經(jīng)引起了公共的注意，普通的化學藥物治療方法的有使致 病菌產(chǎn)生抗藥性和治療效果不佳等缺陷，最近的研宄表明乳酸菌能有效的抑制致病菌生 長，因其具有穩(wěn)定性、免疫性和安全性等優(yōu)勢，被認為是新型食品防腐劑和保健食品的研宄 熱點。
[0003] 如今，消費者對于食品的需求不僅局限在味道和眼前的營養(yǎng)，而是更希望他們能 提供給身體超出基本營養(yǎng)價值以外有更針對性的健康益處。酸奶是益生菌的良好載體，不 僅能提供給人們酸奶的營養(yǎng)，還能通過益生菌在腸道內(nèi)定植來調(diào)整腸道菌群和產(chǎn)生特定的 抑菌物質(zhì)來抑制有害菌的存活。乳酸菌的抑制作用可能是由于產(chǎn)生酸性物質(zhì)使不耐酸致 病菌生長繁殖受到抑制；產(chǎn)生類似細菌素的小分子肽類使致病菌受到抑制作用；產(chǎn)生溶菌 酶、過氧化氫等物質(zhì)殺死潛在的病原菌。使用植物乳桿菌（L.plantarum)來抑制致病菌的 的生長和調(diào)節(jié)腸道菌群，已經(jīng)在體內(nèi)和體外得到證明。本發(fā)明中的植物乳桿菌主要來至于 傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，其安全性是有保證的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種新型乳桿菌菌株，其具有優(yōu)異的作為益生菌基本 性質(zhì)的耐酸性、耐膽汁酸性、過氧化氫酶的穩(wěn)定性、蛋白酶穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供用于預防和治療腸道疾病的含有新型植物乳桿菌的組 合物。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供新型乳桿菌廣譜抑菌活性的應用。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供新型乳桿菌在農(nóng)業(yè)生物農(nóng)藥和果蔬保鮮劑方面的應用。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供新型乳桿菌在整腸中的應用，具有良好的益生特性。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供新型乳桿菌以作為發(fā)酵劑或添加劑在在酸奶或保健食 品中的應用。
[0010] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一株植物乳桿菌的新菌株（L.plantarum)AB-1及 其制備方法。該菌株（L.plantarum)AB-1已于2014年09月15日在中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為CGMCCNo. 9653。
[0011] 本發(fā)明的植物乳桿菌AB-1是經(jīng)過篩選的、從內(nèi)蒙古巴彥淖爾盟發(fā)酵酸面團中分 離得到、具有廣譜抑菌活性的益生乳酸菌。
[0012] 本發(fā)明的植物乳桿菌AB-1通過如下方法分離得到。
[0013]a.菌株培養(yǎng)及分尚方法
[0014] 將采集的酸面團先進行前處理，再將樣品做梯度稀釋后（1(T4,1(T5,KT6)涂布于含 有放線菌酮（〇?lwt%，OXID公司）和硫酸粘菌素（0?lwt%，OXID公司）的MRS瓊脂平板 培養(yǎng)基或者M17瓊脂平板培養(yǎng)基（OXID公司）上，30°C厭氧培養(yǎng)48h~72h，挑取單菌落， 轉(zhuǎn)接于TPY增菌培養(yǎng)液中，30°C培養(yǎng)24h~48h，劃線接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基（OXID)，30°C 培養(yǎng)24h~48h，觀察記錄菌落形態(tài)和革蘭氏染色細胞形態(tài)特征，并同時進行過氧化氫酶試 驗。將革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性的菌，暫定為乳酸菌。將菌株接種于MRS液體 培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h~48h后，做進一步鑒定和保存。
[0015] 其中MRS培養(yǎng)基的組成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、 Tweeen80lml、磷酸二氫鈉2g、無水乙酸鈉5g、梓檬酸三胺2g、硫酸猛0.02g、硫酸鎂0.lg， 蒸餾水1L，調(diào)節(jié)pH至6. 2左右，瓊脂15g，121°C、15min滅菌。
[0016]M17培養(yǎng)基的組成是：胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、肉蛋白胨5g、酵母粉2. 5g、抗 壞血酸0. 5g、硫酸鎂0. 25g、二鈉甘油19g、瓊脂llg、蒸餾水1L。
[0017] b?分子生物學鑒定
[0018] 將冷凍保存的供試菌株接種于TPY增菌液體培養(yǎng)基中，30°C恒溫培養(yǎng)24h，經(jīng)TPY 傳代培養(yǎng)2~3代后，取2mL對數(shù)生長末期的菌體培養(yǎng)物置于無菌EP管內(nèi)離心，經(jīng)8000Xg 離心3min(4°C)后收集菌體，棄上清，采用乳酸菌專用CTAB凍融法提取菌株的基因組DNA。
[0019] 其中，TPY增菌培養(yǎng)液的組成是：乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大 豆蛋白胨5g、磷酸氫二鉀2. 5g、磷酸二氫鉀2. 5g、硫酸鎂0.lg、吐溫80 0. 25g、L-半胱氨酸 鹽酸鹽〇? 5g、15g瓊脂、蒸餾水1L，121°C、15min滅菌。
[0020] 采用通用引物，正向引物是27f(對應于Escherichiacoil8-27位堿基）： 5 ' -AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3 反向引物是 1495r(對應于Escherichiacoil 1495-1515位堿基）：5' -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'，以菌體DNA為擴增模板PCR擴增 16S rRNA基因區(qū)域，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后進行16SrRNA基因序列測定，然后通過基因序列比對和 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研宄進行種屬鑒定。如上從酸面團采集到的菌株顯示出了與植物乳桿菌最高 的分子系統(tǒng)學上的親緣關(guān)系。將上述微生物鑒定為植物乳桿菌Lplantarum。植物乳桿菌 L.plantarum的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖見圖3〇
[0021] c.形態(tài)學特性
[0022] 本發(fā)明的植物乳桿菌L.plantarumAB-1具有如下形態(tài)學特征：細胞呈直桿狀，有 圓形末端，長3. 0-8. 0ym，寬0? 9-1. 2ym，呈單個、成對，或短鏈狀出現(xiàn)（見圖1)，有些菌能 減少硝酸鹽，偶爾有些菌株表現(xiàn)出擬過氧化氫酶活性。
[0023] d.菌落形態(tài)特性
[0024] 本發(fā)明的植物乳桿菌L.plantarumAB-1在MRS培養(yǎng)基上生長形成乳白色菌落，不 透明，圓形，表面光滑，中央凸起，直徑約為1.2-1. 5mm(見圖2)。
[0025] 植物乳桿菌（L. plantarum) AB-1抑菌性能測定
[0026]e.植物乳桿菌上清液的制備方法
[0027]以347株廣泛采集的植物乳桿菌作為篩選本發(fā)明的具有抑制致病菌活性植物乳 桿菌的來源并進行對比，該347株植物乳桿菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學"乳品生物技術(shù)與工程"教 育部重點實驗室提供，它們分別分離自內(nèi)蒙古、新疆、青海、西藏、甘肅、云南、四川以及蒙古 國地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，該347株植物乳桿菌的16S核糖體RNA信息都已上傳到NCBI數(shù) 據(jù)庫。
[0028] 把凍存管中的保藏液接種到5ml的MRS培養(yǎng)基中，震蕩混勻，37°C恒溫培養(yǎng)24h，連 續(xù)活化兩代，用活化第二代的植物乳桿菌MRS培養(yǎng)液以（lX109cfU/ml)以2%的比例（V/ V)接種到全脂乳（llwt%全脂乳粉添加到89wt%無菌水中混勻后經(jīng)巴氏殺菌）中，37°C恒 溫培養(yǎng)24h，取發(fā)酵液以4000Xg離心lOmin，取上清，上清液經(jīng)0. 22ym微膜過濾，-20°C冰 箱保存?zhèn)溆谩?br>[0029]f.瓊脂打孔擴散法測定抑菌活性
[0030] 將活化好的5株指示菌（單細胞李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157:H7、 鼠傷寒沙門氏菌、弗氏志賀氏菌，均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學"乳品生物技術(shù)與工程"教育部重點 實驗室提供，面向公眾開放）按2% (V/V)接入各自培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，使菌體充分富 集，以MRS為培養(yǎng)基用平板計數(shù)法計數(shù)。得到計數(shù)結(jié)果后，將腸道致病菌菌液制成104、105、 1〇 6、1〇7的指示菌細胞懸液，以乳酸調(diào)節(jié)pH為4. 0的MRS無細胞懸液為標準，利用瓊脂打孔 擴散法，確定抑菌圈最易觀測的腸道致病菌的生長量作為指示菌懸液的最佳濃度，抑菌效 果見表1。
[0031] 表1不同濃度指示菌的抑菌效果
[0032]
[0033]
【主權(quán)項】
1. 一株具有廣譜抑菌特性的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)AB_l，該菌株于 2014年09月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏， 保藏號為 CGMCC No. 9653。
2. 含有如權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌的組合物。
3. 權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌抑制致病菌的應用，其特征在于所述制致病菌為： (1) 大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、弗氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單細胞李斯特氏菌； 和 (2) 甜瓜枯萎菌和甜瓜疫霉菌。
4. 權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌作為發(fā)酵劑或食品添加劑在食品中的應用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述食品是發(fā)酵食品。
6. 權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌在植物生物農(nóng)藥或果蔬保鮮劑中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株具有廣譜抑菌特性的植物乳桿菌，該菌被命名為Lactobacillus plantarum AB-1，已于2014年9月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為CGMCC No.9653。本發(fā)明中的植物乳桿菌在全脂乳培養(yǎng)基中和該菌參與的復配發(fā)酵酸奶中均表現(xiàn)出較強廣譜抑菌特性，且該菌株參與酸奶發(fā)酵時，能有效增強發(fā)酵酸奶的風味特征，復配發(fā)酵酸奶上清經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后依然能表現(xiàn)出較好的廣譜抑菌特性。該菌在胃腸液中較高的存活率還證明其有優(yōu)良的益生特性，在人體內(nèi)具有較強的存活能力。另外，該菌對甜瓜枯萎和甜瓜疫霉菌具有較好的抑菌活性。CGMCC No.965320140915
【IPC分類】C12R1-25, A01P3-00, A61P1-00, A23L1-30, A23C9-123, A01N63-00, A61K35-747, C12N1-20
【公開號】CN104830731
【申請?zhí)枴緾N201510232204
【發(fā)明人】陳永福, 張和平, 李常坤
【申請人】內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月8日