一種人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于皮膚修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域,具體設(shè)及一種人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子及其制備方 法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來,隨著對間充質(zhì)干細(xì)胞研究的不斷深入,其分泌因子已成為研究者們的熱 點。間充質(zhì)干細(xì)胞可W分泌多種具有生物活性的細(xì)胞因子,運些細(xì)胞因子可有效地調(diào)控機(jī) 體細(xì)胞信號傳導(dǎo)、活化人體干細(xì)胞,進(jìn)而生理性修復(fù)或替代機(jī)體損傷、病變及衰老的細(xì)胞。 將細(xì)胞因子添加到美容化妝品,不僅具有一般化妝品的保濕美白功效,還能夠修復(fù)受損皮 膚,消除皮膚皺紋,收縮毛孔,改善面色等,越來越受到人們的關(guān)注。
[0003] 含細(xì)胞因子的化妝品現(xiàn)已在多個國家上市,尤其是在W美容整形行業(yè)最為發(fā)達(dá)的 韓國,細(xì)胞因子化妝品尤為甚行。我國亦有多家規(guī)模較大的干細(xì)胞公司開發(fā)出了細(xì)胞因子 化妝品。但市面上的細(xì)胞因子化妝品一般采用干細(xì)胞培養(yǎng)上清液直接滲入或經(jīng)凍干后滲入 化妝品基質(zhì)的方式制造,細(xì)胞因子含量較低,且含有大量糖分等其它雜質(zhì),使用運些化妝品 后反而會造成皮膚干燥等不適感。
[0004] 目前也有一些對干細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行提取純化的報道,但效果依然不佳,例如 公告號為CN102600057B的專利公開了一種人胎盤干細(xì)胞提取物凍干粉的制備方法,對得到 的細(xì)胞培養(yǎng)液采用單一的3000D濾膜進(jìn)行超濾截留,其去掉了部分雜質(zhì),但是糖類等雜質(zhì)仍 未除掉,并且還導(dǎo)致細(xì)胞因子大量損失,修復(fù)效果不佳,而且同樣也會造成皮膚干燥等不適 感,實際應(yīng)用價值較低。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明提供了一種分離人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子的方法,它包括如下步驟:
[0006] a、細(xì)胞培養(yǎng)上清液的獲取:取人間充質(zhì)干細(xì)胞,置于間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基 中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長到匯合度75~85 %時,收集上清液;
[0007] b、過濾濃縮:對步驟a的上清液先采用0.22WI1濾膜過濾;然后通過50KD超濾膜,收 集透析液,再將透析液通過化D超濾膜,收集截留液,得到細(xì)胞因子濃縮液,即可。
[000引其中,步驟a中,所述間充質(zhì)干細(xì)胞為廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞;
[0009] 所述廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法為:取廝帶,在無菌條件下,采用組織塊法培 養(yǎng)得到;所述取廝帶為取5-10根廝帶混合。
[0010] 本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的細(xì)胞因子濃縮液。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉的制備方法,步驟如下:取權(quán) 利要求3所述的細(xì)胞因子濃縮液,凍干,得人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉。
[0012] 其中,凍干前,先加入凍干保護(hù)劑;其中,所述凍干保護(hù)劑每100ml中含有如下組 分:抗壞血酸0.3~0.8g,人白蛋白0.1~1ml,右旋糖巧2.5~4.0g、海藻糖1~2g,甘氨酸 0.02~0.08邑、精氨酸0.05~0.17邑、氨基乙酸2邑、巧樣酸鋼0.26邑、叔下醇10~201111;
[0013] 進(jìn)一步地,所述凍干保護(hù)劑每100ml中含有如下組分:抗壞血酸0.5g,人白蛋白 0.51111,右旋糖巧3.5旨、海藻糖1.5旨,甘氨酸0.04旨、精氨酸0.17旨、氨基乙酸2旨、巧樣酸鋼 0.26g、叔下醇 15ml;
[0014] 所述凍干的條件為:壓強(qiáng)為10~30pa,-25~-40°C下,16~24h。
[0015] 本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉。
[0016] 本發(fā)明還提供了上述細(xì)胞因子濃縮液或上述細(xì)胞因子凍干粉在制備化妝品中的 用途。
[0017] 化妝品包括護(hù)膚品。
[0018] 本發(fā)明還提供了上述細(xì)胞因子濃縮液或上述細(xì)胞因子凍干粉在制備修復(fù)皮膚損 傷的藥物中的用途。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞因子化妝品或藥物,其中,每100ml中化妝品或藥物中包 含上述間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉0.5~1.5g,透明質(zhì)酸0.1~Ig,膠原蛋白1~5ml。
[0020] 進(jìn)一步地,每100ml中化妝品或藥物中包含間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉Ig,透明質(zhì)酸 0.5g,膠原蛋白2ml;所述透明質(zhì)酸為分子量為3000D-10KD的透明質(zhì)酸。
[0021] 本發(fā)明分離純化人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子的方法,可W有效去除間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 液中的雜質(zhì),而且得到的細(xì)胞因子純度高,且產(chǎn)量很高。本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞因子能夠促 進(jìn)表皮細(xì)胞營養(yǎng)代謝;促進(jìn)皮下膠原細(xì)胞功能,加速皮膚膠原細(xì)胞生長,增加膠原分泌,具 有預(yù)防和修復(fù)皮膚損傷,延緩衰老,抗皺及美白等功效,而且使用時無皮膚干燥等不適感。 本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞因子可W添加到化妝品或藥品中,尤其W0.5%~1.5%比例加入化 妝品,增強(qiáng)其皮膚修復(fù)、抗老化、桂皺美白等美容護(hù)膚功效,具有良好的市場前景。
[0022] 顯然,根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容,按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段,在不脫 離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下,還可W做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0023] W下通過實施例形式的【具體實施方式】,對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0024] 圖1為P5代MSC細(xì)胞表面標(biāo)志圖。
[0025] 圖2大圖為家兔背部皮膚激光照射后40秒鐘的創(chuàng)面圖;小圖為局部放大圖。
[00%]圖3為照射后40秒鐘的組織病理皿染色圖,可見表皮壞死,真皮淺層受累,部分皮 膚附屬器結(jié)構(gòu)破壞,血管擴(kuò)張充血(X 20)。
[0027]圖4左圖為實驗第6天,模型對照組的恢復(fù)情況圖,可見創(chuàng)面仍有厚挪殼覆蓋;右圖 為實驗第6天,模型對照組病理肥染色圖,可見部分表皮再生,但仍有部分缺損,真皮淺層缺 損,表皮及真皮中有較多炎癥細(xì)胞浸潤(X 50)。
[00%]圖5左圖為實驗第12天,模型對照組恢復(fù)情況圖,可見大部分挪殼已經(jīng)脫落,基底 潮紅,略有水腫;右圖為實驗第12天,模型對照組病理肥染色圖,可見部分表皮再生,但仍有 部分缺損,真皮淺層缺損,表皮及真皮中有較多炎癥細(xì)胞浸潤(X50)。
【具體實施方式】
[0029] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,按照常規(guī)方法和條件,或按照試劑盒 說明書選擇。
[0030] 實驗試劑及儀器:
[0031]
[0033] 實施例1本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞因子的制備
[0034] -、廝帶來源
[0035] 胎兒父母簽署廝帶捐贈知情者同意書,產(chǎn)前檢查產(chǎn)婦的丙型肝炎病毒抗體、艾滋 病病毒Ι/Π 抗體、乙型肝炎病毒抗原和梅毒螺旋體抗體。分娩的同時采集檢查結(jié)果合格的 廝帶,廝血。廝血用于檢測病毒,保證所采廝帶無病毒污染。
[0036] 二、制備方法
[0037] 1、人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞化C-MSC)培養(yǎng)上清液的獲取
[003引(1)在無菌的條件下將捐贈的10根病毒檢測合格的廝帶用眼科剪剪碎成1mm3大小 左右的組織塊后混合均勻。
[0039] (2)將混合均勻的組織塊均勻平鋪在直徑為100mm的塑料培養(yǎng)皿中,加入完全培養(yǎng) 基[90%(v/v)DMEM/Fl化10%(v/v)胎牛血清],對組織塊進(jìn)行培養(yǎng),每隔Ξ天換液,當(dāng)P0代 MSC匯合度達(dá)75~85 %時,棄去含血清的上清液,收獲細(xì)胞。
[0040] (3)將收獲的細(xì)胞W3000個/cm2密度接種到T75培養(yǎng)瓶中,并采用無血清培養(yǎng)基培 養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長到匯合度75~85 %時,收獲細(xì)胞,添加10 %的DMS0,將細(xì)胞量調(diào)整至1.0~ 10.0 X 106個/ml/管,用程控降溫儀凍存后保存在液氮罐中作為種子庫細(xì)胞(即P1代細(xì)胞)。 對得到的P1代細(xì)胞進(jìn)行活率測定,活率為96.9%。
[0041 ] (4)按需求量復(fù)蘇種子庫細(xì)胞,進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),復(fù)蘇細(xì)胞活率為94.5 %。將種子庫 細(xì)胞W3000個/cm2密度接種到T75培養(yǎng)瓶中,并采用無血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長到匯 合度75~85%,收集上清液并