專利名稱：用于美容護膚的干細胞分泌因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可用于美容、護膚的干細胞分泌因子的制備方法。該干細胞分泌的 復(fù)合因子，可被應(yīng)用于美容化妝品、保健品、護膚品。
背景技術(shù)：
干細胞是一種具有多向分化潛能的細胞，根據(jù)來源的不同可以分為胚胎干細胞和成 體干細胞。胚胎干細胞可以分化為身體的任何一種細胞，所以也叫全能干細胞。成體干 細胞是指那些具有組織或器官特異性的干細胞，能在適宜的環(huán)境中分化成與其定位相宜 的細胞系，又稱為多能干細胞。干細胞在特定的環(huán)境中可以定向分化，從而達到修復(fù)組織 和細胞損傷的作用。本發(fā)明者研究表明(Bcl-2 engineered MSCs inhibited apoptosis and improved heart function', Stem Cells, 2007 Aug;25(8):2118- 27..)干細胞可以通過分化為特 定的細胞來修復(fù)組織，而旁分泌作用在組織的修復(fù)中發(fā)揮了更大的作用。也就是說，在 千細胞治療組織損傷的時候，干細胞分泌的細胞因子發(fā)揮了極為重要的作用。該體系包 括干細胞因子(SCF)、內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、表皮細胞生長因子(EGF )、腫瘤壞 死[刮子(TNF)肝細胞生長因子(HGF )、神經(jīng)生長岡子(NGF )、纖維母細胞生長因子 (F〔;F )、胰島素樣成長因子(IGF )、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、白細胞介素(IL) 等20余種。其中干細胞因子(Stem Cell Factor, SCF)不僅是維持生命活動所需要的， 而且在抵抗電離輻射對機體的作有及修復(fù)輻射所致?lián)p傷中都是必不可少的。此外，干細
胞分泌因子中還含各型膠原蛋白(如i、 ii、 m、 [V型膠原蛋白)以及各種溶菌酶等。
表皮千細胞是皮膚更新的種子細胞。每天都有大量的表皮細胞死亡脫落，也會有相 應(yīng)數(shù)量的新生細胞加以補充。隨著人們年齡的增加，皮膚出現(xiàn)斑點，皺紋也逐漸增多， 表皮失去了往昔的光彩，這一切皆源于表皮干細胞再生能力的減退，如何使表皮干細胞 保持旺盛的新陳代謝能力，將是保持皮膚健康美麗的關(guān)鍵所在。
基于人們對美麗的需求，干細胞美容技術(shù)及其相關(guān)產(chǎn)品的丌發(fā)R益受到業(yè)界的重 視。目前市場上出現(xiàn)了很多所謂的干細胞產(chǎn)品，從技術(shù)角度上并不具備實施的可行性。 中國專利CN1817339A、N1872025A和CN1817339A專利涉及產(chǎn)品的內(nèi)容使用了活性干細胞和 中藥組分，首先如何在護膚品種保持干細胞的活性？其次如何避免干細胞壞死后產(chǎn)生毒 素對人體的損害？這些都是值得探討且很難以解決的問題。CN1872025A采用細胞破碎技 術(shù)，以及正常狀態(tài)下的細胞培養(yǎng)技術(shù)來獲取干細胞活性組分。這種獲取干細胞活性組分 的方法缺乏依據(jù)。就如你砍碎了蘋果樹你并不會得到蘋果？粉碎了細胞只是得到了細胞 片斷。常規(guī)來講在正常生長狀態(tài)下，所獲取的細胞培養(yǎng)上清液，上清液中包含更多的是 代謝廢物，同時采用a-MEN(其中添加有激素如地塞米松)培養(yǎng)基，如何有效除去其中的激 素，都是其所面臨的問題。
3目前市場上也有在芙容護膚產(chǎn)品中添加生長因子如bFGF和EGF的，而細胞的更新是 一個系統(tǒng)的過程，單一生長因子的添加在某種程度上雖可以刺激細胞的代謝，但也容易 造成依賴性。
綜上可以看出，基于干細胞的美容療法具有廣闊的前景，但如何科學(xué)、有效地利用 干細胞的獨特性能，開發(fā)出真正意義上的干細胞美容護膚產(chǎn)品，仍讓是一個嶄新的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于關(guān)容護膚的干細胞分泌因子的制備方法，干細胞分 泌因子可用于關(guān)容護膚的產(chǎn)品。
本發(fā)明提供的用于關(guān)容護膚的千細胞分泌因子的制備方法包括的歩驟
1) 采用常規(guī)的細胞分離方法，從人或哺乳動物相應(yīng)組織中分離出干細胞。
2) 干細胞的擴增，用相應(yīng)干細胞的常規(guī)培養(yǎng)方法，包括a-MEM培養(yǎng)基，加入10% 的胎牛血清，5%C02， 37'C條件下培養(yǎng)，定期換液，傳代，進而得到所需數(shù)量的干細胞。
3) 干細胞因子體系的獲取在干細胞分裂最旺盛的時期，棄去正常培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液(磷酸緩沖液，pt^7.4左右)清洗l-3次，然后加入PBS或生理鹽水，細胞培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-24小時。收集上清液，即可得到富含干細胞生長因子體系的溶液。
4) 濃縮、貯存所得液體離心，除去散落細胞，濃縮，按lXl()"個細胞/ml的濃度濃 縮，得產(chǎn)品，于-2(TC長期保存，以備使用。
本發(fā)明所述的來源于干細胞所分泌的干細胞因子體系，該體系包括干細胞因子 (SCF)、內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、表皮細胞生長因子(EGF )、腫瘤壞死因子(TNF) 肝細胞生長因子(HGF )、神經(jīng)生長因子(NGF )、纖維母細胞生長因子(FGF )、胰 島素樣成長因子(K;F )、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、白細胞介素(IL)等。此外， 干細胞分泌因子中還含各型膠原蛋白(如I、 II、 III、 iV型膠原蛋白)以及各種溶菌酶等。
本發(fā)明所述的干細胞因子體系是指來源于人或哺乳動物胚胎干細胞、臍血干細胞、 骨髓干細胞、表皮干細胞、內(nèi)皮干細胞、外周血干細胞、脂肪干細胞等，也可泛指所有 的干細胞。
本發(fā)明所得的產(chǎn)品作為活性成分配以醫(yī)學(xué)上接受的溶解液構(gòu)成組合物的產(chǎn)品，直接 用于美容、護膚方面的用途，包括除皺、美容、祛斑、修復(fù)疤痕等。
本發(fā)明所得的產(chǎn)品作為活性成分可以添加到各種制劑的美容護膚產(chǎn)品中。用于美 容、護膚方面的用途，包括除皺、芙容、祛斑、修復(fù)疤痕等。
本發(fā)明所得產(chǎn)品可以用于美容、護膚產(chǎn)品中的針劑、面霜、乳液、水液或常用化妝 品中的各種制劑，以及按照用途分類的護膚及關(guān)容的各類產(chǎn)品，包括但不限于清潔霜、 清潔乳、清潔皂、面膜、化妝水、按摩膏、乳液、營養(yǎng)霜、美容霜、粉底或粉餅等。
本發(fā)明所得的干細胞活性因子體系中不含外來的培養(yǎng)液成分，也不含有死細胞裂解成分。并可以長期保存而維持組織和細胞修復(fù)活性。本發(fā)明利用干細胞多向分化和強大 的自我復(fù)制能力，體外大量擴增干細胞。依據(jù)干細胞復(fù)合因子體系具有促進表皮干細胞 增殖、促進皮膚新陳代謝，增強皮膚細胞的活力，促進細胞物質(zhì)成分交換的作用，來增 強皮膚對其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，以及機體內(nèi)代謝廢物的排放。采用干細胞在無血清條件 下的分泌效應(yīng)，得到不含細胞培養(yǎng)基和細胞組分的干細胞因子復(fù)合體系。由于本發(fā)明不 含外來培養(yǎng)基和細胞組分，從而避免了外來添加劑和細胞裂解毒素對皮膚造成的傷害。 使干細胞美容真正從理想走向了現(xiàn)實。在生物醫(yī)學(xué)的深度對傳統(tǒng)美學(xué)觀念進行了提升。 同時該發(fā)明簡單易行，適宜于大規(guī)模生產(chǎn)，為干細胞細胞服務(wù)于美麗事業(yè)提供了一條捷 徑。
具體實施方式
實施例l
小鼠胚胎干細胞來源于南丌大學(xué)生物中心
ES細胞的培養(yǎng)與擴增:取lml胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES)，細胞濃度約 為1X10"個細胞A)]，注射器或吸管吹打數(shù)次，以保證為單細胞懸液，將細胞鋪于有原代 小鼠胚胎成纖維細胞(Mt:F)的培養(yǎng)瓶中，ES維持培養(yǎng)基(天津聯(lián)呈生物技術(shù)有限公司) 10inl培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)后更換培養(yǎng)液，2-3天后，消化、傳代，再培養(yǎng)。反復(fù)以上操作，以 得到足夠數(shù)量的ES。
干細胞活牲因子的制備在ES細胞生長最旺盛時(約長滿培養(yǎng)瓶70-80%面積)，棄 去培養(yǎng)基，用PBS (或生理鹽水)清洗2-3次，然后加入10mlPBS，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。取上 清，離心，得富含干細胞因子體系。
細胞消化、計數(shù)用磷酸緩沖溶液(PBS)輕輕沖洗培養(yǎng)瓶中細胞1一2次，添加3ral 消化液(025%胰蛋白酶、002%RDTA)， 37。C保溫2-3分鐘，顯微鏡下觀察細胞己經(jīng)分離， 加入含血清DMEM培養(yǎng)基，吹散細胞，1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清，加入5mlPBS，充 分吹散細胞，進行細胞計數(shù)，按lml上清液/lX10"個細胞的濃度濃縮上清液。
干細胞復(fù)合活性因子的保存將以上濃縮后的上清液(一次或多次合并)，置-2(TC 冰箱，可長期保存，備用。
實施例2
本實施實例提供了骨髓來源的干細胞因子體系的制備過程，具體如下 1.原代骨髓干細胞的獲取取健康人骨髓10ml， PBS稀釋至20ml，通過Ficoll密 度梯度離心獲得骨髓單核細胞，根據(jù)MSCs具有傾向于粘附在聚苯乙烯表面上的特性，使 MSCs與造血細胞分離。培養(yǎng)3天以后開始出現(xiàn)小的細胞集落。約7-9天后細胞達到飽和， 此時進行傳代。傳代3h后細胞即完全貼壁，2天后，細胞呈現(xiàn)典型的成纖維細胞樣形態(tài)， 均勻分布在培養(yǎng)瓶內(nèi)。3 — 4天后細胞密度即達到80 — 90%。2. 細胞的擴增細胞密度達到80 —90%時，用磷酸緩沖溶液(PBS)輕輕沖洗培養(yǎng) 瓶中細胞1 一 2次，添加3ml消化液(025%胰蛋白酶、002%RDTA) ， 37。C保溫2-3分鐘， 顯微鏡下觀察細胞已經(jīng)分離，加入含血清a -MEM培養(yǎng)基，吹散細胞，按1瓶細胞傳代3 瓶的比例進行傳代，2天后更歡培養(yǎng)液，再細胞密度達到80_90%時，反復(fù)以上操作， 以得到足夠數(shù)量的骨髓干細胞。
3. 干細胞活性因子的制備在骨髓間充質(zhì)干細胞生長最旺盛時(約長滿培養(yǎng)瓶 70-80%面積)，棄去培養(yǎng)基，PBS或生理鹽水清洗2-3次，然后加入10mlPBS，繼續(xù)培養(yǎng)24 小時。取上清，離心，得富含千細胞因子體系。消化細胞，進行細胞計數(shù)，按lml上清液 /1 X IO"個細胞的濃度濃縮上清液。
4. 干細胞復(fù)合活性因子的保存將以上濃縮后的上清液(一次或多次合并)，置-20 'C冰箱，可長期保存，備用。
實施例3
本實施例提供了表皮干細胞活性因子體系的制備過程，具體如下
細胞來源來源于健康人的皮片(或新生兒包皮)。
細胞的分離培養(yǎng)方法按常規(guī)方法進行培養(yǎng)，具體可參照(參見張卓然主編的《培 養(yǎng)細胞學(xué)與細胞培養(yǎng)技術(shù)》)。
干細胞活性因子的制備在表皮干細胞生長最旺盛時(約長滿培養(yǎng)瓶70-80%面積)， 棄去培養(yǎng)基，PBS或生理鹽水清洗2-3次，然后加入10m:lPBS，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。取上清， 離心，得富含干細胞因子的上清液。消化細胞，進行細胞計數(shù)，按lml上清液/lXl(T個 細胞的濃度濃縮上清液。
干細胞復(fù)合活性因子的保存將以上濃縮后的上清液(一次或多次合并)，置-2(TC 冰箱，可長期保存，備用。
實施例4
實施例4 、干細胞分泌因子在化妝品中的應(yīng)用，將干細胞因子體系濃縮液，以1-10:
IOO(干細胞因子體系化妝品原液)的比例加入到化妝品的配方中，均質(zhì)處理，制得富
含干細胞因子體系的化妝品。該類含有干細胞因子體系的化妝品具有美容、抗衰老、修 復(fù)細胞損傷、增強皮膚彈性的功能，使皮膚變得更柔嫩、靚麗、更富有彈性。
權(quán)利要求
1、一種用于美容護膚的干細胞分泌因子的制備方法，其特征在于包括的步驟1)分離干細胞從人或哺乳動物相應(yīng)組織中分離出干細胞；2)干細胞的擴增，用相應(yīng)干細胞的常規(guī)培養(yǎng)方法，包括a-MEM培養(yǎng)基，加入10％的胎牛血清，5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)，定期換液，傳代，進而得到所需數(shù)量的干細胞；3)干細胞因子體系的獲取在干細胞分裂最旺盛的時期，棄去正常培養(yǎng)基，用PBS緩沖液(磷酸緩沖液，pH＝7.4左右)清洗1-3次，然后加入PBS或生理鹽水，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-24小時，收集上清液，即可得到富含干細胞生長因子體系的溶液；4)濃縮、貯存所得液體離心，除去散落細胞，濃縮，按1×106個細胞/毫升的濃度進行濃縮，得產(chǎn)品，可于-20℃長期保存，以備使用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的來源于干細胞所分泌的干細胞 因子體系，該體系包括該體系包括干細胞因子、內(nèi)皮細胞生長因子、表皮細胞生長因子、 腫瘤壞死因子肝細胞生長因子、神經(jīng)生長因子、纖維母細胞生長因子、胰島素樣成長因 子、粒細胞集落刺激因子、白細胞介素；此外，干細胞分泌因子中還含各型膠原蛋白， 包括I、 II、 III、 IV型膠原蛋白，以及各種溶菌酶。
3、 根據(jù) 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的千細胞因子體系是指來源于 人或哺乳動物胚胎干細胞、臍血干細胞、骨'髓千細胞、表皮干細胞、內(nèi)皮干細胞、外周 血干細胞、脂肪干細胞，也可泛指所有的干細胞。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所得的產(chǎn)品作為活性成分配以醫(yī)學(xué)上 接受的溶解液構(gòu)成組合物的產(chǎn)品，直接用于美容、護膚，包括、美容、祛斑、修復(fù)疤痕。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所得的產(chǎn)品作為活性成分可以添加到 各種制劑的美容護膚產(chǎn)品中，包括除皺、美容、祛斑、修復(fù)疤痕。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所得的產(chǎn)品用于美容、護膚產(chǎn)品中的 針劑、面霜、乳液、水液制劑，包括清潔霜、清潔乳、清潔皂、面膜、化妝水、按摩膏、 乳液、營養(yǎng)霜、關(guān)容霜、粉底或粉餅。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可用于美容、護膚的干細胞分泌因子的制備方法。包括細胞分離、干細胞的擴增、干細胞因子體系的獲取和濃縮、貯存得到含有干細胞活性因子體系。該體系包括目前已鑒定的各型干細胞所分泌的活性因子。本發(fā)明所得的干細胞活性因子體系中不含外來的培養(yǎng)液成分，也不含有死細胞裂解成分。并可以長期保存而維持組織和細胞修復(fù)活性。使干細胞美容真正從理想走向了現(xiàn)實。在生物醫(yī)學(xué)的深度對傳統(tǒng)美學(xué)觀念進行了提升。同時該發(fā)明簡單易行，適宜于大規(guī)模生產(chǎn)，為干細胞服務(wù)于美麗事業(yè)提供了一條捷徑。
文檔編號A61K8/98GK101461772SQ20091006763
公開日2009年6月24日 申請日期2009年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月7日
發(fā)明者李文忠, 歐來良 申請人:天津歐瑞生物科技有限公司