專利名稱：：治療性多肽,其同源物、其片段及其在調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集方面的應(yīng)用的制作方法治療性多肽，其同源物、其片段及其在調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集方面的應(yīng)用本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)日為2004年1月9日，國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/BE2004/000002，中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?00480002090.2，發(fā)明名稱為"治療性多肽，其同源物、其片段及其在調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集方面的應(yīng)用"的分案申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
：血管受損時(shí)，內(nèi)皮下結(jié)構(gòu)裸露，其通過(guò)與馮德勒布蘭德因子(vWF)相互作用介導(dǎo)血小板粘附。VWF在受損血管壁內(nèi)的膠原蛋白與血小板受體糖蛋白Ib(gplb)間形成橋，該相互作用在高切應(yīng)力(shear)狀態(tài)下尤其重要，導(dǎo)致形成止血栓，因而防止流血過(guò)多(BennettS,ThrombHaemost(2001)Mar;85(3):395-400)。正常止血過(guò)程中，這些過(guò)程導(dǎo)致受損血管壁的傷口愈合。而在病理情況下，過(guò)分的血小板功能可導(dǎo)致形成血栓。vWF亞基由幾個(gè)同源結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)具有不同功能。vWF通過(guò)其A3結(jié)構(gòu)域與纖維狀膠原蛋白纖維相互作用，通過(guò)其Al結(jié)構(gòu)域與血小板受體gplb作用。正常情況下，血小板和vWF不相互作用。然而，當(dāng)vWF在高切應(yīng)力速率下與膠原蛋白結(jié)合時(shí)，認(rèn)為其經(jīng)歷構(gòu)象改變，允許其與血小板受體gplb結(jié)合。該可逆的粘附使血小板翻越受損區(qū)，然后通過(guò)血小板上的膠原蛋白受體(gpla/lla,gpVI,gpIV,p65,TIIICBP)形成穩(wěn)定粘附，導(dǎo)致血小板活化。這導(dǎo)致gpllb/nia受體活化，纖維蛋白原結(jié)合，最終產(chǎn)生血小板聚集。已經(jīng)從吸血生物體如水蛭中分離出血小板聚集抑制劑。源自^"^廈^^水蛭的乳清酸在WO02/15919A2和CruzCP等人文獻(xiàn)中描述。乳清酸作為馮德勒布蘭德因子依賴的血小板粘附抑制劑，減少大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除模型中的血小板聚集和內(nèi)膜增生。JournalofVascularSurgery,2001,34:724-729禾口SmithTP等人文獻(xiàn)，乳清酸，膠原蛋白-血小板相互作用抑制劑，在犬透析通路模型中減少靜脈吻合內(nèi)膜增生，VaseEndovascularSurg，2003Jul-Aug;37(4):259-69?；诳贵w的治療已得到發(fā)展，其中有些已用于當(dāng)前治療。阿昔單抗(嵌合7E3Fab;ReoPro;US6,071,514,EP0882453),抑制配體結(jié)合血小板gpIIb/IIIa受體的小鼠人嵌合抗體7E3的Fab片段，于1994年12月獲準(zhǔn)作為輔助治療應(yīng)用于人類，以防止經(jīng)皮冠脈介入的局部缺血并發(fā)癥。gpnb/IIIa抑制劑的主要安全問(wèn)題是流血風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)檫@些藥物強(qiáng)烈的抗血小板效應(yīng)可能不利于影響止血。開(kāi)發(fā)了抗vWFA1結(jié)構(gòu)域(US2002/0028204Al;US6,280,731和WO00/10601)和抗其活性構(gòu)象(US6,251,393)的鼠源單克隆抗體。體內(nèi)效應(yīng)見(jiàn)KageyamaS等人所述"Effectofahumanizedmonoclonalantibodyto馮維勒布蘭4惠因子inacaninemodelofcoronaryarterialthrombosis",五zi7'J"P/zwmaco/.2002May17;443(l-3):143-9，禾卩"Anti-humanvWFmonoclonalantibody,AjvW-2Fab,Inhibitsrepretitivecoronaryarterythrombosiswithoutbleedingtimeprolongationindogs"，J7z,'om62001Marl;101(5):395-404及"Anti-human馮維勒布蘭德因子monoclonalantibodyAJvW-2preventsthrombusdepositionandneointimaformationafterballooninjuryinguineapigs"，Jrto'Zosc/erZ7z7'麵6Fasc歷o/,2000Oct;20(10):2303-8。AJvW-2抑制高切應(yīng)力誘導(dǎo)的人血小板聚集，對(duì)低切應(yīng)力誘導(dǎo)的血小板聚集沒(méi)有作用。，抗人vWPA3結(jié)構(gòu)域的鼠源抗體82D6A3在狒狒內(nèi)的效應(yīng)公開(kāi)于WO02/051351及DongmeiWu等人，"InhibitionofthevonWillebrand(VWF)-collageninteractionbyanantihumanVWFmonoclonalantibodyresultsinabolitionofinvivoarterialplateletthrombusformationinbaboons"，i^e歸加57、f/z7'簡(jiǎn)6os7'51(mivascw/a7'67:o/ogy,2002,99:3623-3628?？贵w6B4是抗純化的人gpIb的單克隆抗體(MoAb)。MoAb6B4能夠抑制利托菌素和美洲矛頭蝮毒蛋白誘導(dǎo)的依賴vWF的人血小板凝集。MoAb6B4還能阻止切應(yīng)力誘導(dǎo)的人血小板與膠原蛋白I的粘附。注射入狒狒體內(nèi)時(shí)，完整IgG和其F(ab')(2)片段幾乎立即導(dǎo)致血小板減少，原因是二價(jià)F(ab')(2)介導(dǎo)血小板交聯(lián)，或Fc:Fc受體相互作用介導(dǎo)血小板聚集活化(WO0110911;CauwenberghsN.等人，Jrtehosc/eros^J7w'函6cw'51FascM/i2TZ)z'o/ogy,2000,20:1347，及見(jiàn)如CadroyY等人，Blood,1994,83:3218-3224,BeckerBH等人，S/oo《1989,74:690-694，RavanatC.等人，J7ww"Aiifoe77w"1999,82:528a摘要)。在血栓產(chǎn)生前將Fab片段注射入狒狒體內(nèi)，能夠抑制血小板在膠原蛋白富集的牛心包上沉積。但當(dāng)在允許血栓形成后注射Fab片段，看不到進(jìn)一歩的血栓抑制。所述Fab分子表達(dá)產(chǎn)量很低，產(chǎn)生方法耗費(fèi)巨大人力。發(fā)明目的本發(fā)明目標(biāo)是提供多肽、所述多肽同源物和/或所述多肽功能部分，該多肽包括針對(duì)vWF、vWFAl結(jié)構(gòu)域、活化vWF的Al結(jié)構(gòu)域、vWFA3結(jié)構(gòu)域、gpIb和/或膠原蛋白的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體，用于治療需要對(duì)血小板介導(dǎo)的聚集進(jìn)行調(diào)節(jié)的疾病并克服現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明另一目標(biāo)是提供產(chǎn)生所述多肽的方法、用多肽包被用于醫(yī)學(xué)程序(如PCTA，放置斯坦特印模)的的裝置的方法、篩選調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集的試劑的方法和試劑盒，以及診斷與血小板介導(dǎo)的聚集相關(guān)的疾病的試劑盒。發(fā)明概述'已經(jīng)制備出特異性識(shí)別參與血小板聚集的第一步及隨后步驟的靶分子的單結(jié)構(gòu)域抗體。這使得抗血栓形成試劑更有效、更安全。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案是多肽構(gòu)建體，包括至少一種針對(duì)vWF、vWFAl結(jié)構(gòu)域、活化的vWFAl結(jié)構(gòu)域、vWFA3結(jié)構(gòu)域、gplb或膠原蛋白的任一種的單結(jié)構(gòu)域抗體。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體，其中針對(duì)活化vWPAl結(jié)構(gòu)域的單結(jié)構(gòu)域抗體特異性識(shí)別血栓形成部位活化的vWF構(gòu)象，而不結(jié)合循環(huán)的非活化形式的vWF。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體，還包括至少一種針對(duì)一種或多種血清蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體，其中所述至少一種血清蛋白是任一血清清蛋白、血清免疫球蛋白、曱狀腺素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferring)或纖維蛋白原或其片段。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體，其中針對(duì)一種或多種血清蛋白的至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體對(duì)應(yīng)SEQIDNO:16到19和49到61任一個(gè)所示序列。本發(fā)明另一實(shí)施方案是對(duì)應(yīng)SEQIDNO:13到15和42到45任一個(gè)所示序列的上述多肽構(gòu)建體。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體是人源化的序列。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體對(duì)應(yīng)SEQIDNO:38到41和42到45任一個(gè)所示序列。本發(fā)明另一實(shí)施方案是對(duì)應(yīng)SEQIDNO:8到12、20到22、32到34和42到47任一個(gè)所示序列的上述多肽構(gòu)建體。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體是駱駝科VHH抗體。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體對(duì)應(yīng)SEQIDNO:1到7、23到31、35到37和62到65任一個(gè)所示序列。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體，其中所述單結(jié)構(gòu)域抗體是全長(zhǎng)單結(jié)構(gòu)域抗體的同源序列、功能部分或同源序列的功能部分。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體，其中所述多肽構(gòu)建體是所述多肽構(gòu)建體同源序列、其功能部分或其功能部分的同源序列。本發(fā)明另一實(shí)施方案是編碼上述多肽構(gòu)建體的核酸。本發(fā)明另一實(shí)施方案是組合物，其包括上述多肽構(gòu)建體和至少一種溶解血栓試劑，用于同時(shí)、分別或順序向受試者給藥。本發(fā)明另一實(shí)施方案是組合物，其中所述溶解血栓試劑是蔔萄球菌激酶、組織纖溶酶原激活物、鏈激酶、單鏈鏈激酶、尿激酶和?；w溶酶原鏈激酶復(fù)合物的任何一種。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體，或上述核酸或上述組合物，用于治療、預(yù)防和/或緩解與血小板介導(dǎo)的聚集或其功能失調(diào)相關(guān)的疾病。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體，或上述核酸或上述組合物的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或緩解與血小板介導(dǎo)聚集或其功能失調(diào)相關(guān)的疾病的藥物。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體、核酸或組合物，或上述多肽構(gòu)建體、核酸或組合物的用途，其中所述疾病是短暫腦局部缺血性發(fā)作、不穩(wěn)定或穩(wěn)定型心絞痛、心絞痛、腦梗塞、心肌梗塞、周圍動(dòng)脈閉塞性疾病、再狹窄.、冠脈旁路移植，或冠狀動(dòng)脈瓣膜換置和冠脈介入如血管成形術(shù)、放置斯坦特印模、頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)或粥樣斑切除術(shù)(atherectomy)的任何一種。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體、核酸或組合物，或上述多肽構(gòu)建體、核酸或組合物的用途，其中所述疾病是非閉塞性血栓形成、閉塞性血栓形成、動(dòng)脈血栓形成、急性冠脈閉塞、再狹窄、PCTA或放置斯坦特印模后再狹窄、狹窄的動(dòng)脈內(nèi)血栓形成、血管成形術(shù)、粥樣斑切除術(shù)或動(dòng)脈斯坦特印模后的增生、血管系統(tǒng)的閉塞綜合征或患病動(dòng)脈的開(kāi)放缺陷中的任何一種。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體、核酸或組合物，或上述多肽構(gòu)建體、核酸或組合物的用途，其中所述疾病是高切應(yīng)力環(huán)境中斑塊或血栓形成。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述多肽構(gòu)建體、核酸或組合物，或上述多肽構(gòu)建體的用途，其中所述多肽構(gòu)建體是靜脈內(nèi)、皮下、口服、舌下、局部、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)或吸入給藥。本發(fā)明另一實(shí)施方案是一種組合物，其包括上述多肽構(gòu)建體或編碼所述多肽構(gòu)建體的核酸，或上述組合物和藥用載體。本發(fā)明另一實(shí)施方案是生產(chǎn)上述多肽的方法，包括(a)在允許所述多肽表達(dá)的條件下，培養(yǎng)包括能編碼上述多肽的核酸的宿主細(xì)胞，和(b)從培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的多肽。本發(fā)明另一實(shí)施方案是上述方法，其中所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌或酵母。本發(fā)明另一實(shí)施方案是處理侵入性醫(yī)療裝置的方法，以防止在侵入部位周圍形成血小板介導(dǎo)的積聚，包括用上述多肽構(gòu)建體包被所述裝置。本發(fā)明另一實(shí)施方案是防止在侵入部位周圍形成血小板介導(dǎo)的積聚的侵入性醫(yī)療裝置，其中所述裝置包被有上述多肽構(gòu)建體。本發(fā)明另一實(shí)施方案是鑒定調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集的試劑的方法，包括(a)在允許所述多肽間結(jié)合的條件下，在存在和不存在候選調(diào)節(jié)劑的條件下，使上述多肽構(gòu)建體與對(duì)應(yīng)其靶目標(biāo)的多肽接觸，和(b)測(cè)量(a)步驟的多肽間的結(jié)合，相對(duì)于不存在所述候選調(diào)節(jié)劑，存在所述候選調(diào)節(jié)劑時(shí)結(jié)合的降低將所述候選調(diào)節(jié)劑鑒定為調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集的試劑。本發(fā)明另一實(shí)施方案是試劑盒，其短于根據(jù)上述方法篩選調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集的試劑。本發(fā)明另一實(shí)施方案是根據(jù)上述方法鑒定的未知試劑，其調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集。本發(fā)明另一實(shí)施方案是診斷疾病或病癥的方法，所述疾病或病癥的特征在于血小板介導(dǎo)的聚集的機(jī)能障礙，所述方法包含步驟(a)使樣品與上述多肽構(gòu)建體接觸，和(b)檢測(cè)所述多肽構(gòu)建體與所述樣品的結(jié)合，和(c)將步驟(b)中檢測(cè)的結(jié)合與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，其中相對(duì)于所述樣品而言結(jié)合的差異診斷為以血小板介導(dǎo)的聚集的機(jī)能障礙為特征的疾病或病癥。本發(fā)明另一實(shí)施方案是篩選試劑盒，其用于根據(jù)上述方法，對(duì)以血小板介導(dǎo)的聚集的機(jī)能障礙為特征的疾病或疾患進(jìn)行診斷。本發(fā)明另一實(shí)施方案是包括上述多肽構(gòu)建體的上述試劑盒。詳述本發(fā)明涉及包括一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的多肽構(gòu)建體，每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體針對(duì)IE目標(biāo)，涉及所述構(gòu)建體對(duì)血小板介導(dǎo)的聚集具有調(diào)節(jié)作用的發(fā)現(xiàn)。耙目標(biāo)根據(jù)本發(fā)明，靶目標(biāo)是任一vWF、vWFAl結(jié)構(gòu)域、活化的vWF的Al結(jié)構(gòu)域、vWFA3結(jié)構(gòu)域、gplb或膠原蛋白。所述靶目標(biāo)是哺乳動(dòng)物的，源自物種如兔、山羊、小鼠、大鼠、奶牛、小牛、駱駝、美洲駝、猴子、驢、豚鼠、豬、雞、綿羊、狗、貓、馬，和優(yōu)選地人。人vWF序列見(jiàn)表30，SEQIDNO:48。靶目標(biāo)也是能夠引發(fā)免疫反應(yīng)的vWP、vWFAl結(jié)構(gòu)域、活化的vWF的Al結(jié)構(gòu)域、vWFA3結(jié)構(gòu)域、gplb或膠原蛋白的片段。靶目標(biāo)也是能夠與抗"親本"全長(zhǎng)耙目標(biāo)的產(chǎn)生的單結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)合的vWF、vWFAl結(jié)構(gòu)域、活化的vWFAl結(jié)構(gòu)域、vWFA3結(jié)構(gòu)域、gplb或膠原蛋白的片段。此處應(yīng)用的片段指少于100%序列(如99%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%等)。但包括5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多氨基酸。片段應(yīng)足夠長(zhǎng)。使得感興趣的相互作用維持在親和力lx10—6M或更高水平。此處應(yīng)用的片段還指任選插入、缺失和替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，其不實(shí)質(zhì)上改變?cè)摪心繕?biāo)與針對(duì)野生型靶目標(biāo)產(chǎn)生的單結(jié)構(gòu)域抗體的結(jié)合能力。插入、缺失和替換的氨基酸數(shù)目?jī)?yōu)選為高達(dá)l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個(gè)氨基酸。針對(duì)耙目標(biāo)的單結(jié)構(gòu)域抗體是指與其靶目標(biāo)結(jié)合的親和力超過(guò)10—6M的單結(jié)構(gòu)域抗體。單結(jié)構(gòu)域抗體單結(jié)構(gòu)域抗體是指其互補(bǔ)決定區(qū)為部分單結(jié)構(gòu)域多肽的抗體。實(shí)施例包括但不限于，重鏈抗體、天然缺乏輕鏈的抗體、源自常規(guī)四鏈抗體的單結(jié)構(gòu)域抗體、工程抗體和不同于那些源自抗體的單結(jié)構(gòu)域支架。單結(jié)構(gòu)域抗體可以是現(xiàn)有技術(shù)的任何抗體，或任何未來(lái)的單結(jié)構(gòu)域抗體。單結(jié)構(gòu)域抗體可以來(lái)自任何物種，包括但不限于，小鼠、人、駱駝、美洲駝、山羊、兔和牛。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面，此處所應(yīng)用的單結(jié)構(gòu)域抗體是天然存在的單結(jié)構(gòu)域抗體，已知為無(wú)輕鏈的重鏈抗體。此類單結(jié)構(gòu)域抗體公開(kāi)于如WO9404678。為清楚起見(jiàn)，源自天然無(wú)輕鏈的重鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域在此稱為或郎;wZ)o辦，以便與四鏈免疫球蛋白的常規(guī)VH區(qū)別開(kāi)。此類VHH分子可源自在駱駝科物種中產(chǎn)生的抗體，例如，在駱駝、美洲駝、單峰駱駝、羊駝和駝馬中。除駱-蛇科外其他物種可產(chǎn)生天然無(wú)輕鏈的重鏈抗體；此類VHHs也屬于本發(fā)明范圍。VHHs，根據(jù)本發(fā)明，正如技術(shù)人員所知，是源自天然無(wú)輕鏈的免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，如WO9404678所述的源自駱-蛇科的那些(下文稱為VHH結(jié)構(gòu)域或nanobody)。VHH分子比IgG分子約小10倍。其為單一多肽，非常穩(wěn)定，耐受極端pH和溫度條件。另外，它們抗蛋白酶的作用，常規(guī)抗體沒(méi)有這個(gè)能力。此外，VHHs體外表達(dá)產(chǎn)生高產(chǎn)量、正確折疊的功能VHHs。另外，Came/ZA產(chǎn)生的抗體識(shí)別的表位與體外通過(guò)使用抗體文庫(kù)或通過(guò)免疫非Camelids的哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的抗體所識(shí)別表位不同(WO9749805)。同樣，抗清蛋白VHHs可以更有效的方式與己知作為載體蛋白的血清清蛋白相互作用。作為載體蛋白，血清清蛋白的一些表位難以被結(jié)合的蛋白、多肽和小的化合物接近。由于已知VHHs結(jié)合"不尋常"或非常規(guī)表位如腔(WO9749805)，此類VHHs與循環(huán)清蛋白的結(jié)合親和力得以提高。VHH的類別本發(fā)明還涉及多肽構(gòu)建體，其中單結(jié)構(gòu)域抗體是針對(duì)此處所提靶目標(biāo)的VHH，其中VHH屬于具有類似人的序列的類別。按照Kabat編號(hào)，其類別特征在于VHHs在第45位攜帶的氨基酸選自由甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺組成的組，例如L45群體。結(jié)合vWF的SEQIDNO:l和SEQIDNO:3所示VHH序列屬于這種類似人的類別的VHH多肽。同樣，屬于此類的肽與人VH框架區(qū)氨基酸序列高度同源，所述肽可以向人類直接給藥而不預(yù)期由此產(chǎn)生不需要的免疫反應(yīng)，而且無(wú)需進(jìn)一步人源化的負(fù)擔(dān)。因此，本發(fā)明一方面允許直接向所需受試者給予多肽構(gòu)建體，所述多肽構(gòu)建體包括一個(gè)或多個(gè)對(duì)應(yīng)SEQIDNO:l和3任一個(gè)所示序列的單結(jié)構(gòu)域抗體。SEQIDNO:16和18所示另一類類似人的駱駝科單結(jié)構(gòu)域抗體已描述于WO03/035694，包含人源或其他物種來(lái)源的常規(guī)抗體中典型發(fā)現(xiàn)的疏水FR2殘基，但通過(guò)在103位以一些殘基如帶電荷的精氨酸殘基、絲氨酸或不帶電殘基如甘氨酸替換雙鏈抗體VH上的保守色氨酸殘基，彌補(bǔ)了其親水性損失。同樣，屬于這兩類的肽與人VH框架區(qū)氨基酸序列高度同源，將所述肽向人類直接給藥無(wú)預(yù)期的不需要的免疫反應(yīng)，并且無(wú)進(jìn)一步人源化的負(fù)擔(dān)。本發(fā)明應(yīng)用的任一VHHs可以是傳統(tǒng)類別或類似人的駱3&^^C體類別。所述抗體可以針對(duì)整個(gè)靶目標(biāo)或其片段。這些多肽包括全長(zhǎng)駱駝科抗體，即Fc和VHH結(jié)構(gòu)域，駱游科抗體重鏈與人Fc結(jié)構(gòu)域的嵌合形式。針對(duì)耙目標(biāo)的多肽構(gòu)建體的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體可以是相同序列。備選地，它們不都具有相同序列。多肽構(gòu)建體包括不都具有相同序列、但針對(duì)相同耙目標(biāo)的抗靶目標(biāo)單結(jié)構(gòu)域抗體，或其片段、其一個(gè)或多個(gè)抗原，這也隸屬本發(fā)明范圍。'本發(fā)明另一方面是包括兩個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的多肽構(gòu)建體，其中任何兩個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體針對(duì)不同耙目標(biāo)，即針對(duì)vWF、vWFAl結(jié)構(gòu)域、活化的vWF的Al結(jié)構(gòu)域、vWFA3結(jié)構(gòu)域、gplb和膠原蛋白任何一種。本發(fā)明另一方面是雙特異性多肽構(gòu)建體，包括抗vWFAl結(jié)構(gòu)域、活化的vWP的Al結(jié)構(gòu)域的單結(jié)構(gòu)域抗體，及抗vWFA3結(jié)構(gòu)域的另一單結(jié)構(gòu)域抗體。該雙特異性多肽構(gòu)建體抑制vWF與膠原蛋白之間及vWF與血小板之間的相互作用。依照本發(fā)明另一方面，可包括兩個(gè)或多個(gè)己連接的單結(jié)構(gòu)域抗體的多肽構(gòu)建體。該單結(jié)構(gòu)域抗體可以具有相同序列，針對(duì)相同靶目標(biāo)或抗原。根據(jù)連接的VHHs數(shù)量，多價(jià)VHHs可以是二價(jià)(2VHHs)、三價(jià)(3VHHs)、四價(jià)(4VHHs)或具有更高效價(jià)的分子。本發(fā)明也涉及一種發(fā)現(xiàn)，即此處公開(kāi)的還包括一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體，每個(gè)針對(duì)受試者的血清蛋白的多肽構(gòu)建體，與非所述構(gòu)建體部分的抗靶目標(biāo)單結(jié)構(gòu)域抗體的半衰期相比，在所述受試者循環(huán)中的半衰期令人驚訝地顯著延長(zhǎng)。此外，發(fā)現(xiàn)所述構(gòu)建體顯示相同的VHHs優(yōu)良性質(zhì)，如在小鼠內(nèi)保持完整的高穩(wěn)定性，耐受極端pH、高溫穩(wěn)定性和高的靶目標(biāo)親和力。此類構(gòu)建體的實(shí)例由SEQIDNO.13至U15所示，其包括抗vWPVHH和抗小鼠血清清蛋白VHH。因此，本發(fā)明另一實(shí)施方案是對(duì)應(yīng)SEQIDNO.13到15任一個(gè)所示序列的多肽構(gòu)建體。此類構(gòu)建體的其他實(shí)例由SEQIDNO.42到45所示，其包括人源化抗vWFVHH和抗小鼠血清清蛋白VHH。因此，本發(fā)明另一實(shí)施方案是對(duì)應(yīng)SEQIDNO.42到45任一個(gè)所示序列的多肽構(gòu)建體。血清蛋白可以是受試者血清內(nèi)發(fā)現(xiàn)的任一合適蛋白，或其片段。在本發(fā)明一個(gè)方面，該血清清蛋白是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或纖維蛋白原。按照意向用途例如進(jìn)行有效治療所需的半衰期和/或靶抗原的區(qū)分，VHH配偶體可以針對(duì)上述血清蛋白中的一種。針對(duì)血清清蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體的實(shí)例是由對(duì)應(yīng)于SEQIDNOs:16到19和SEQIDNOs:49到61任一個(gè)的序列所示的序列。因此，本發(fā)明另一方面是還包括一個(gè)或多個(gè)抗血清單結(jié)構(gòu)域抗體的多肽構(gòu)建體，其中抗血清單結(jié)構(gòu)域抗體的序列對(duì)應(yīng)于SEQIDNOs:16妾ljl9和49到61任一個(gè)所示序列。此類構(gòu)建體可以在受試者血清內(nèi)循環(huán)數(shù)日，減少治療頻率和給受試者帶來(lái)的不便，使得降低治療成本。此外，本發(fā)明一個(gè)方面是，此處公開(kāi)的多肽構(gòu)建體的半衰期可以通過(guò)構(gòu)建體中抗血清蛋白單結(jié)構(gòu)域抗體的數(shù)目來(lái)控制。在幾種情況下可控的半衰期是理想的，如采用定時(shí)給藥治療性多肽構(gòu)建體的情況。本發(fā)明另一實(shí)施方案是此處提及的多肽構(gòu)建體，還包括溶解血栓試劑。該溶解血栓試劑可以通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)方式而非共價(jià)或共價(jià)結(jié)合到單結(jié)構(gòu)域抗體上。此類共價(jià)方式見(jiàn)下述。非共價(jià)方式包括通過(guò)蛋白相互作用如生物素/鏈親和素，或通過(guò)免疫綴合物。備選地，溶解血栓試劑可以與本發(fā)明多肽構(gòu)建體同時(shí)、分別或順序給藥。本發(fā)明另一方面是組合物，其包括至少一種此處公開(kāi)的多肽構(gòu)建體和至少一種溶解血栓試劑，用于同時(shí)、分別或順序向受試者給藥。本發(fā)明一個(gè)方面是治療自身免疫疾病的方法，包括向個(gè)體同時(shí)、分別或順序給予有效劑量的至少一種本發(fā)明多肽構(gòu)建體和至少一種溶解血栓試劑。本發(fā)明另一方面是試劑盒，其包含至少一種本發(fā)明的多肽構(gòu)建體和至少一種溶解血栓試劑，用于同時(shí)、分別或順序向受試者給藥。本發(fā)明一個(gè)方面是該試劑盒可按照本發(fā)明來(lái)使用。本發(fā)明一個(gè)方面是該試劑盒可用于治療此處所提及的疾病。同時(shí)給藥意味著將多肽和溶解血栓試劑在相同時(shí)間給予受試者。例如，作為混合物或包括該成分的組合物。實(shí)例包括，但不限于，靜脈給藥的溶液、片劑、液體、外用霜?jiǎng)┑?，其中每一制劑包括目的組分。分別給藥意味著將多肽和溶解血栓試劑同時(shí)或?qū)嵸|(zhì)上同時(shí)給藥。組分在試劑盒中作為分開(kāi)的、未混合的制劑存在。例如，多肽和溶解血栓試劑作為單獨(dú)的片劑存在于試劑盒內(nèi)?？赏ㄟ^(guò)同時(shí)吞咽片劑或一個(gè)片劑接著另一個(gè)片劑吞咽對(duì)受試者給藥。順序給藥意味著將多肽和溶解血栓試劑依次給予受試者。多肽和溶解血栓試劑在試劑盒中作為分開(kāi)的、未混合的制劑存在。劑量之間有時(shí)間間隔。例如，一種組分可在另一組分給藥后高達(dá)336、312、288、264、240、216、192、168、144、120、96、72、48、24、20、16、12、8、4、2、1或0.5小時(shí)給藥。順序給藥時(shí)，在給予另一組分之前和/或之后，可以一次或多次以不同劑量給藥一種組分。順序給藥可以與同時(shí)或順序給藥聯(lián)合應(yīng)用。下述多肽構(gòu)建體的醫(yī)學(xué)用途，也適用于包括此處公開(kāi)的多肽構(gòu)建體和至少一種多肽溶解血栓試劑的組合物，用于如上所述同時(shí)、分別或順序向受試者給藥。根據(jù)本發(fā)明溶解血栓試劑可包括，例如葡萄球菌激酶、組織纖溶酶原激活物、鏈激酶、單鏈鏈激酶、尿激酶和?；w溶酶原鏈激酶復(fù)合物。采用本領(lǐng)域已知方法或任何未來(lái)方法，可以將單結(jié)構(gòu)域抗體連接起來(lái)形成此處公開(kāi)的包括多于一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的任一多肽構(gòu)建體。例如，可以通過(guò)氨基酸殘基與有機(jī)衍生劑反應(yīng)通過(guò)化學(xué)交聯(lián)使之融合，如Blatter等人，Biochemistry,24，1517—1524;EP294703所述。備選地，利用遺傳方法在DNA水平使單結(jié)構(gòu)域抗體發(fā)生融合，即形成多核苷酸構(gòu)建體，其編碼包括一個(gè)或多個(gè)抗靶目標(biāo)單結(jié)構(gòu)域抗體和一個(gè)或多個(gè)抗血清蛋白單結(jié)構(gòu)域抗體的完整多肽構(gòu)建體。產(chǎn)生二價(jià)或多價(jià)VHH多肽構(gòu)建體的方法公開(kāi)于PCT專利申請(qǐng)WO96/34103。連接多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的一個(gè)方法是通過(guò)遺傳途徑直接或利用肽連接物連接單結(jié)構(gòu)域抗體編碼序列。例如，第一單結(jié)構(gòu)域抗體C末端可以連接至下一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的N末端。如要連接額外的單結(jié)構(gòu)域抗體來(lái)構(gòu)建和生產(chǎn)三聯(lián)、四聯(lián)等功能性構(gòu)建體，也可擴(kuò)展該連接模式?？砂凑毡绢I(lǐng)域已知方法或任一未來(lái)方法，由技術(shù)人員制備此處公開(kāi)的多肽構(gòu)建體。例如，VHHs可利用本領(lǐng)域已知方法獲得，比如通過(guò)免疫駱駝然后從其獲得雜交瘤，或通過(guò)利用本領(lǐng)域已知的分子生物學(xué)技術(shù)克隆單結(jié)構(gòu)域抗體文庫(kù)然后利用噬菌體展示進(jìn)行篩選。本發(fā)明一個(gè)方面涉及一種發(fā)現(xiàn)，即表30中SEQIDNOs:1到7所示源自駱茶科VHHs的多肽結(jié)合vWF并抑制其與膠原蛋白相互作用。因此，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案是多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體對(duì)應(yīng)于SEQIDNOs:1到7任一個(gè)所示序列。本發(fā)明另一實(shí)施方案是對(duì)應(yīng)于SEQIDNOs:8至i」12任一個(gè)所示序列的多肽構(gòu)建體。該序列對(duì)應(yīng)于針對(duì)vWP的單特異性多肽構(gòu)建體(如SEQIDNO:8和11)或包括不同序列VHHs的異種特異性多肽構(gòu)建體(如SEQIDNO:9，10和12)。本發(fā)明另一實(shí)施方案是包括針對(duì)vWF的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的多肽構(gòu)建體。血小板聚集是非常復(fù)雜的現(xiàn)象，體內(nèi)環(huán)境下，vWF和膠原蛋白的相互作用只在小動(dòng)脈內(nèi)高切應(yīng)力狀態(tài)下觀察得到。為評(píng)估高切應(yīng)力狀態(tài)下血小板聚集情況，發(fā)明者進(jìn)行了灌注試驗(yàn)。實(shí)施例16代表利用特異性vWF-A3結(jié)合物SEQIDNO:1到12獲得的切應(yīng)力數(shù)據(jù)。該實(shí)驗(yàn)代表了小動(dòng)脈內(nèi)血管壁受損時(shí)(如血管成形術(shù)過(guò)程中)發(fā)生的相互作用。令人驚訝的是，在高切應(yīng)力下單價(jià)VHHs在血小板聚集實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)良好在0.08至0.3pg/ml之間的濃度對(duì)血小板聚集的抑制率達(dá)50X。相比而言，抑制與膠原蛋白的相互作用的IgGvWF特異性抗體，82D6A3，對(duì)血小板聚集抑制50%則需要約20倍更高的濃度(VanhoorelbekeK.等人，/owma/q/"所o/og/ca/C7化,m'對(duì)0;,2003,278:37815-37821)。在ELISA中單價(jià)VHHs的IC50比82D6A3IgG的IC50差高達(dá)7倍的條件下，這些結(jié)果出人意料。這清楚證明，該大分子量抗體不適合與啟動(dòng)聚集或在其過(guò)程中的大分子發(fā)生相互作用，比如那些參與血小板介導(dǎo)的聚集的大分子。vWF形成多達(dá)60個(gè)單體的多聚體(最終多聚體分子量高達(dá)兩千萬(wàn)道爾頓)。事實(shí)上，已發(fā)現(xiàn)不是所有的A3結(jié)構(gòu)域都易于接近82D6A3(DongmeiWU,Blood,2002,99,3623一362S)。另外，大分子量常規(guī)抗體的限制組織滲透，例如在受損血管壁部位發(fā)生血小板介導(dǎo)的聚集過(guò)程中。Nanobody具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)，由單可變結(jié)構(gòu)域組成。源自駱駝科抗體的VHH分子是已知最小的完整抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一(約15kDa，或比常規(guī)IgG小IO倍)，因此非常適于運(yùn)送至致密組織，及進(jìn)入到參與或啟動(dòng)血小板介導(dǎo)的聚集過(guò)程的大分子之間的有限空間內(nèi)。據(jù)我們所知，這是首次實(shí)驗(yàn)表明，小分子iianobody對(duì)此類大分子之間相互作用的抑制優(yōu)于大分子完整抗體。盡管Nanobody分子量小、因而有利于滲透，還令人驚訝地是，這種小分子能夠抑制大的多聚體例如vWF(高達(dá)60個(gè)單體)與膠原蛋白之間的相互作用，并具有很高效率。已描述了只有大的多聚體形式的vWF具有止血活性(Furlan,M,.1996,j朋.7/e,船to/.72:341-348)。與單聚體vWF片段相比，多聚體vWF與膠原蛋白結(jié)合的親和力高100倍。高切應(yīng)力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，可以給患者更低劑量。因此，期待副作用更低(例如免疫原性或出血問(wèn)題)。本發(fā)明還涉及一種發(fā)現(xiàn)，即來(lái)自美洲駝單結(jié)構(gòu)域抗體的對(duì)應(yīng)SEQIDNOs23到31任一個(gè)所示序列的多肽，與vWFAl結(jié)構(gòu)域結(jié)合。因此，本發(fā)明另一實(shí)施方案是包括一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體對(duì)應(yīng)SEQIDNOs23到31任一個(gè)所示序列。本發(fā)明另一實(shí)施方案是對(duì)應(yīng)SEQIDNOs:32到34任一個(gè)所示序列的多肽構(gòu)建體。該序列對(duì)應(yīng)包括同樣序列的VHHs的二價(jià)多肽構(gòu)建體，二者都抗vWFAl結(jié)構(gòu)域。發(fā)明者進(jìn)行了在流腔中的灌注實(shí)驗(yàn)，研究高切應(yīng)力條件下，包括SEQIDNOs:23到31所示序列的多肽構(gòu)建體對(duì)血小板聚集的效應(yīng)。實(shí)施例25提供了利用特異性vWF-Al結(jié)合物SEQIDNOs23到31獲得的切應(yīng)力數(shù)據(jù)。本發(fā)明還涉及一種發(fā)現(xiàn)，即來(lái)自美洲駝單結(jié)構(gòu)域抗體的對(duì)應(yīng)SEQIDNOs62到65任一個(gè)所示序列的多肽，選擇性結(jié)合vWF活性構(gòu)象(比如與膠原蛋白結(jié)合后)的A1結(jié)構(gòu)域，而不是自由循環(huán)的非活性vWF。這使得抗血栓形成試劑更安全有效。此處應(yīng)用的"選擇性結(jié)合'VWFAl結(jié)構(gòu)域是指美洲駝抗體對(duì)vWP活性構(gòu)象的親和力比非活性構(gòu)象高至少10倍，優(yōu)選100倍。因此，本發(fā)明另一實(shí)施方案是包括一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體對(duì)應(yīng)SEQIDNOs:62到65任一個(gè)所示序列。本發(fā)明另一實(shí)施方案中，多肽構(gòu)建體包括針對(duì)相同靶目標(biāo)的一個(gè)或多個(gè)單域抗體，還包括針對(duì)相同靶目標(biāo)但是相同結(jié)構(gòu)域的不同表位的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體。例如，SEQIDNOs:9、10和12所示序列是異種特異性多肽構(gòu)建體，包括針對(duì)vWFA3結(jié)構(gòu)域不同表位的VHHs。因此，本發(fā)明另一實(shí)施方案是對(duì)應(yīng)SEQIDNOs:9、10和12任一個(gè)所示序列的多肽構(gòu)建體。本發(fā)明另一實(shí)施方案是多肽構(gòu)建體，其中針對(duì)相同靶目標(biāo)的單結(jié)構(gòu)域抗體數(shù)是兩個(gè)或更多。SEQIDNOs:8和ll所示序列是包括針對(duì)vWFA3結(jié)構(gòu)域中相同表位的VHHs的多肽構(gòu)建體，其中VHH均具有相同序列。因此，本發(fā)明另一實(shí)施方案是對(duì)應(yīng)SEQIDNOs:8和11任一個(gè)所示序列的多肽構(gòu)建體。本發(fā)明另一實(shí)施方案中，多肽構(gòu)建體包括針對(duì)相同靶目標(biāo)的一個(gè)結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體，及針對(duì)相同靶目標(biāo)但是相同靶目標(biāo)的另一個(gè)結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體。不同結(jié)構(gòu)域的實(shí)例可以是vWF的A1和A3結(jié)構(gòu)域。另一實(shí)施例中，SEQIDNOs:20、21和22所示序列是異種特異性多肽構(gòu)建體，包括針對(duì)vWF不同結(jié)構(gòu)域，艮PvWF的Al和A3結(jié)構(gòu)域上表位的VHHs。因此，本發(fā)明另一實(shí)施方案是對(duì)應(yīng)SEQIDNOs:20、21和22任一個(gè)所示序列的多肽構(gòu)建體。本發(fā)明一個(gè)方面是，異種特異性多肽構(gòu)建體中至少一種抗A1結(jié)構(gòu)域的VHH識(shí)別vWF活性構(gòu)象。該VHH對(duì)應(yīng)SEQIDNOs:62到65任一個(gè)所示序列。與單聚VHHs相比，該多肽構(gòu)建體可具有優(yōu)越的抗血栓形成效應(yīng)。在流腔中進(jìn)行灌注實(shí)驗(yàn)，研究高切應(yīng)力下血小板聚集狀況，來(lái)研究這些多肽構(gòu)建體的效應(yīng)。實(shí)施例30表示利用包括抗vWF-AlVHH和抗vWF-A3VHH的異種特異性多肽構(gòu)建體獲得的切應(yīng)力數(shù)據(jù)。本發(fā)明還涉及一種發(fā)現(xiàn)，即來(lái)自美洲駝單結(jié)構(gòu)域抗體的對(duì)應(yīng)SEQIDNOs35到37所示序列的多肽，與I型和/或III型膠原蛋白結(jié)合。因此，本發(fā)明另一實(shí)施方案是多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體對(duì)應(yīng)SEQIDNOs:35到37任一個(gè)所示序列。本發(fā)明另一實(shí)施方案中，多肽構(gòu)建體包括針對(duì)I型和/或III型膠原蛋白的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體，及針對(duì)相同靶目標(biāo)但是相同結(jié)構(gòu)域中不同表位的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體。3P1-31—3P2-31和3L-41—3P2-31所示序列是異種特異性多肽構(gòu)建體，包括針對(duì)I型膠原蛋白中不同表位的VHHs。因此，本發(fā)明另一實(shí)施方案是對(duì)應(yīng)SEQIDNOs:46和47任一個(gè)所示序列的多肽構(gòu)建體。本發(fā)明另一方面是包括針對(duì)血小板糖蛋白Ib的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的多肽構(gòu)建體。開(kāi)發(fā)了鼠抗人vWF單抗，AJvW-2(lgG)，其抑制利托菌素或美洲矛頭蝮毒蛋白誘導(dǎo)的人血小板聚集過(guò)程中血小板糖蛋白Ib(gplb)和馮維勒布蘭德因子(vWF)之間的相互作用(PCT申請(qǐng)?zhí)朩O00/10601)。AJvW-2Fab，抑制狗冠狀動(dòng)脈反復(fù)性血栓形成而不延長(zhǎng)流血時(shí)間(KageyamaS等人，ThrombRes.,2001Mar1;101(5):395-404)，防止豚鼠泡沫化損傷后血栓沉積和neointima形成(KageyamaS.等，^rtehosc/erT7ww打6)^wc說(shuō)o/)2000Oct;20(10):2303-8)。6B4抗體是抗純化的人gpIb的單克隆抗體(MoAb)(PCT申請(qǐng)?zhí)朩O01/10911A2)。注射入狒狒體內(nèi)時(shí)，完整IgG和其F(ab，)(2)片段幾乎立即導(dǎo)致血小板減少，原因是二價(jià)F(ab')(2)介導(dǎo)血小板交聯(lián)，或Fc:Fc受體相互作用介導(dǎo)血小板聚集的活化(CauwenberghsN等人，^由'/osc/e7'c^，77z7'07726o57'51￡m<iFa"w/ar2000,20:1347，及見(jiàn)如CadroyY等人，Blood,1994,83:3218-3224,BeckerBH等人，B/oo夂1989,74:6卯-694,RavanatC.等人，7Vom6./^emo"1999，82:528a摘要)。在血栓產(chǎn)生前，將Fab片段注射入狒狒體內(nèi)，抑制血小板在膠原蛋白富集的牛心包上沉積。但在血栓形成后注射Fab片段，看不到進(jìn)一步的血栓形成抑制。發(fā)現(xiàn)Fab片段對(duì)血小板上gpIb受體的親和力比完整IgG或F(ab，)2弱10倍(KD分別是49.2nM,4.7nM和6.4nM)。同樣，對(duì)利托菌素誘導(dǎo)的血小板聚集IC50值，對(duì)于Fab而言比IgG或F(ab')2差高達(dá)10倍(IC50分別是40nM，4.5nM和7.7nM)?？梢灶A(yù)料的是，當(dāng)利用完整IgG或F(ab')2進(jìn)行體內(nèi)治療所觀察到的Fc:Fc受體介導(dǎo)的血小板聚集的活化和/或F(ab，)2介導(dǎo)的血小板交聯(lián)所致的意外的血小板減少，可通過(guò)應(yīng)用VHH加以避免，因?yàn)閂HH不含F(xiàn)c，也不是二價(jià)。如用6B4的Fab片段所觀察的一樣，不會(huì)損失親和力和活性，因?yàn)閚anobody已經(jīng)是單結(jié)構(gòu)域分子。人源化抗體在美洲駝、單峰駱駝和駱駝體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的天然存在的單結(jié)構(gòu)域抗體展示了一類新型治療用分子，它們既具有單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)如特異性、低毒性，又具備小分子的優(yōu)點(diǎn)如組織滲透和穩(wěn)定性。不幸的是，基于這些蛋白開(kāi)發(fā)合適的治療用產(chǎn)品時(shí)遇到了麻煩，因?yàn)檫@些產(chǎn)品源自駱^^科而非人類。非人類蛋白質(zhì)所含的氨基酸殘基注射入人患者體內(nèi)時(shí)具有免疫原性。雖然研究已表明，源自駱游科的VHH注射入小鼠體內(nèi)沒(méi)有免疫原性，但優(yōu)選用人類殘基替代駱l&科殘基。這些人源化多肽在人體內(nèi)應(yīng)實(shí)質(zhì)上沒(méi)有免疫原性，但仍保持野生多肽的親和力與活性。人源化是指突變，這樣向人類患者給藥時(shí)免疫原性達(dá)最小或消失。根據(jù)本發(fā)明，將多肽人源化包括將一個(gè)或多個(gè)l多多&科氨基酸由人類共有序列中發(fā)現(xiàn)的人類相對(duì)應(yīng)物所置換的步驟，多肽不會(huì)喪失其典型特性，即人源化不會(huì)顯著影響所產(chǎn)生多肽的抗原結(jié)合能力。發(fā)明者已確定可修飾的抗體可變區(qū)(VHH)的氨基酸殘基，而不減小結(jié)構(gòu)域與抗原的天然親和力但降低其對(duì)異源種系的免疫原性；在確定殘基發(fā)生修飾的VHH的應(yīng)用，其用于對(duì)異源種系給藥；如此修飾的VHH。更具體而言，本發(fā)明涉及經(jīng)過(guò)修飾用于人類給藥的VHHs的制備，所產(chǎn)生的VHH自身，及此類"人源化"VHHs在治療人類疾病中的用途。發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)VHH多肽的人源化需在單個(gè)多肽鏈中插入或誘變僅有限數(shù)量的氨基酸，而不顯著喪失結(jié)合和/或抑制活性。這與scFv、Fab、(Fab)2和IgG的人源化相反，后者需要在雙鏈，輕鏈和重鏈中導(dǎo)入氨基酸變化，并保留二條鏈的組裝。人源化技術(shù)可通過(guò)一種方法實(shí)施，包括單獨(dú)或聯(lián)合置換以下任一殘基FRJ的1、5、28和30位、FR2中37、44、45和47位標(biāo)志氨基酸、FR3的殘基74、75、76、83、84、93和94及FR4中103、104、108和111位;按照Kabat編號(hào)法進(jìn)行編號(hào)。此類人源化序列的實(shí)例見(jiàn)表30，SEQIDN0.2、38到41。實(shí)例63和64所示多肽與人種系VHDP-47高度同源。進(jìn)一步的人源化需要在單個(gè)多肽鏈中導(dǎo)入和誘變有限數(shù)量的氨基酸。這不同于scFv、Fab、(Fab)2和IgG的人源化，后者需要在雙鏈，輕鏈和重鏈中導(dǎo)入氨基酸變化，并保留二條鏈的組裝。該多肽在FR2中包含與人類似的殘基。人源化需要對(duì)FR1的1和5位殘基進(jìn)行誘變，該誘變通過(guò)利用所有組成成分克隆的引物插入，天然美洲鴕序列不存在該突變。那些殘基突變不導(dǎo)致喪失結(jié)合和/或抑制活性。FR1人源化也需要28和30位發(fā)生誘變。那些殘基的突變同樣不導(dǎo)致喪失結(jié)合和/或抑制活性。人源化也需要FR3中的74、75、76、83、84、93、94位殘基發(fā)生突變。那些殘基的突變不導(dǎo)致喪失結(jié)合和/或抑制活性。人源化也需要FR4中104、108和111位殘基發(fā)生突變。Q108L突變導(dǎo)致在大腸桿菌中更低的生產(chǎn)水平。CamdidVHH108位是暴露于溶劑的，而在人抗體中該位置隱藏于VH-VL界面(Spinelli，1996;Nieba，1997)。在分離的VH中，108位是暴露于溶劑的。插入非極性疏水Leu而不是極性不帶電Gln對(duì)分子固有的可折疊性/穩(wěn)定性有重大影響。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案是人源化VHH的方法，包括步驟(a)單獨(dú)或聯(lián)合置換以下任一殘基FR1的1、5、28和30位,FR2中37、44、45和47位標(biāo)志氨基酸，F(xiàn)R3的參見(jiàn)74、75、76、83、84、93和94，及FR4中103、104、108和111位;按照Kabat編號(hào)法進(jìn)行編號(hào)。該人源化序列的實(shí)例見(jiàn)表30，SEQIDN02，38到41。應(yīng)用源自如小鼠、綿羊、山羊、兔等來(lái)源的抗體及其人源化衍生物來(lái)治療需對(duì)血小板相關(guān)聚集進(jìn)行調(diào)節(jié)的疾病時(shí)，因幾個(gè)原因而存在問(wèn)題。傳統(tǒng)抗體室溫下不穩(wěn)定，對(duì)于制備和儲(chǔ)存、儲(chǔ)存和運(yùn)輸必須冷藏，需要必需的冷凍實(shí)驗(yàn)設(shè)備、這導(dǎo)致費(fèi)時(shí)費(fèi)錢。有時(shí)在發(fā)展中國(guó)家冷凍不是切實(shí)可行的。該Fab分子表達(dá)產(chǎn)量很低，生產(chǎn)方法耗費(fèi)大量人力。而且，制造或小規(guī)模生產(chǎn)所述抗體非常昂貴，因?yàn)楸磉_(dá)完整和活性抗體所需的哺乳細(xì)胞系統(tǒng)需要時(shí)間和設(shè)備的高水平支撐，且產(chǎn)量很低。另外，傳統(tǒng)抗體結(jié)合活性依賴于pH，因此不適用于一般生理pH范圍以外的環(huán)境應(yīng)用，例如，在治療胃出血、胃外科手術(shù)的情況下。此外，傳統(tǒng)抗體在低或高pH下不穩(wěn)定，因此不適于口服。然而已證實(shí)，Camelid抗體耐受苛刻條件，如極端pH、變性劑和高溫(EwertS等人，Biochemistry,2002，Mar19;41(II):3628—36)，因此使得它們適于口服遞送。另外，傳統(tǒng)抗體結(jié)合活性依賴于溫度，因此不適用于在生物活性溫度范圍外的溫度下(如37士20。C)用于分析或試劑盒。SEQIDNOs:l到47和49到65所示多肽構(gòu)建體及其衍生物不僅具有傳統(tǒng)抗體的優(yōu)良特性，如低毒性和高選擇性，而且它們還顯示其他特性。它們的可溶性更佳，意味著與傳統(tǒng)抗體相比，它們可以以更高的濃度儲(chǔ)存和/或給藥。它們?cè)谑覝叵路€(wěn)定，意味著它們無(wú)需使用冷凍設(shè)備而制備、儲(chǔ)存和/或運(yùn)輸，節(jié)省成本、時(shí)間，也環(huán)保(如實(shí)施例61所述)。與常規(guī)抗體相比，其他優(yōu)越的特性包括循環(huán)半衰期短，這一點(diǎn)可以按照本發(fā)明進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如通過(guò)清蛋白偶聯(lián)，一種雙特異性nanobody，其具有針對(duì)清蛋白的一個(gè)特異性，另一個(gè)針對(duì)IE目標(biāo)、Fc偶聯(lián)、VHH偶聯(lián)(二價(jià)VHHs)或通過(guò)pegylation(如實(shí)施例41到54所述)。對(duì)于外科手術(shù)程序需要短且能夠控制的半衰期，例如，需要在有限時(shí)間內(nèi)抑制血小板介導(dǎo)的聚集。同樣，出現(xiàn)出血問(wèn)題或其他并發(fā)癥時(shí)，可立即降低劑量。本發(fā)明多肽在通常生理范圍之外的pH和溫度下仍保持結(jié)合活性，這意味著其可在調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集需要的極端pH和溫度條件下進(jìn)行應(yīng)用，如胃外科手術(shù)、胃出血控制，室溫進(jìn)行的分析等。本發(fā)明多肽還在極端pH下顯示延長(zhǎng)的穩(wěn)定性，意味著其適于口服遞送。本發(fā)明多肽可通過(guò)在方便的重組宿主生物體如大腸桿菌和酵母這發(fā)酵來(lái)成本有效的生產(chǎn)，可獲得高的表達(dá)水平，不像常規(guī)抗體還需要昂貴的哺乳細(xì)胞培養(yǎng)裝置。本發(fā)明多肽產(chǎn)量的實(shí)例是l到10mg/ml(大腸桿菌)和高達(dá)lg/1(酵母)。本發(fā)明多肽與廣譜的不同抗原類型具有高結(jié)合親和力，結(jié)合常規(guī)抗體無(wú)法識(shí)別的表位的能力；例如，它們具有基于長(zhǎng)CDR的環(huán)形結(jié)構(gòu)，具有滲透到腔中的潛能，顯示酶抑制功能。另外，由于結(jié)合常常僅通過(guò)CDR3環(huán)路發(fā)生，可以設(shè)想源自CDR3的月太可用于治療(Desmyter等人，JBiolChem,2001,276:26285-90)。該肽制備方法見(jiàn)實(shí)施例65所述。本發(fā)明多肽還保持與'酶或毒素作為融合蛋白的完全的結(jié)合能力。另外，可以預(yù)料的是，當(dāng)利用完整IgG或F(ab')2進(jìn)行體內(nèi)治療時(shí)所觀察到的，F(xiàn)c:Fc受體介導(dǎo)的血小板聚集的活化和/或F(ab，)2介導(dǎo)的血小板交聯(lián)所致的意外的血小板減少(見(jiàn)CauwenberghsN等人，A'ten'osc/eTO^s,77vom6ow'sa/W)4wra/a/'6Zo/ogy，2000,20:1347)，可通過(guò)應(yīng)用VHH加以避免，因?yàn)閂HH不含F(xiàn)c，也不是二價(jià)。因此，SEQIDNOs:1到15、20到47、62到65所示多肽、其同源物或功能部分提供了治療和診斷與血小板介導(dǎo)的聚集相關(guān)疾病時(shí)相當(dāng)可觀的節(jié)省成本和時(shí)間，并且需要該多肽的患者會(huì)較少遇到與常規(guī)試劑有關(guān)的問(wèn)題。在血小板介導(dǎo)的聚集過(guò)程中，結(jié)合有vWF的膠原蛋白粘附到血小板和/或血小板受體(二者的實(shí)例是gpla/lla、gplb或膠原蛋白)上，最后導(dǎo)致血小板活化。血小板活化導(dǎo)致纖維蛋白原結(jié)合，最后血小板聚集。本發(fā)明范圍涵蓋提供多肽，其調(diào)節(jié)包括血小板介導(dǎo)的聚集的過(guò)程，比如vWF-膠原蛋白結(jié)合、vWF-血小板受體粘附、膠原蛋白-血小板受體粘附、血小板活化、纖維蛋白原結(jié)合和/或血小板聚集。該多肽源自駱駝科抗體，針對(duì)vWF、vWFAl、活化vWPAl結(jié)構(gòu)域或A3結(jié)構(gòu)域、gplb或膠原蛋白，并如上所述具備與SEQIDNOs:1到15、20到47和62到65所示多肽相同的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面，多肽構(gòu)建體可以是全長(zhǎng)多肽構(gòu)建體的同源序列。根據(jù)本發(fā)明另一方面，多肽構(gòu)建體可以是全長(zhǎng)多肽構(gòu)建體的功能部分。根據(jù)本發(fā)明另一方面，多肽構(gòu)建體可以是全長(zhǎng)多肽構(gòu)建體的同源序列。根據(jù)本發(fā)明另一方面，多肽構(gòu)建體可以是全長(zhǎng)多肽構(gòu)建體的同源序列的功能部分。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面，多肽構(gòu)建體可包括多肽構(gòu)建體序列。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面，用于形成多肽構(gòu)建體的單結(jié)構(gòu)域抗體可以是完整的單結(jié)構(gòu)域抗體(如VHH)或其同源序列。根據(jù)本發(fā)明另一方面，用于形成多肽構(gòu)建體的單結(jié)構(gòu)域抗體可以是完整單結(jié)構(gòu)域抗體的功能部分。根據(jù)本發(fā)明另一方面，用于形成多肽構(gòu)建體的單結(jié)構(gòu)域抗體可以是完整單結(jié)構(gòu)域抗體的同源序列。根據(jù)本發(fā)明另一方面，用于形成多肽構(gòu)建體的單結(jié)構(gòu)域抗體可以是完整單結(jié)構(gòu)域抗體的同源序列的功能部分。本發(fā)明另一方面是對(duì)應(yīng)SEQIDNOs:l到7、16到19、23到31、35到41和49到65任一個(gè)的單結(jié)構(gòu)域抗體、其同源序列、和/或其功能部分。根據(jù)本發(fā)明另一方面，多肽構(gòu)建體可以是親本序列的同源序列。根據(jù)本發(fā)明另一方面，多肽構(gòu)建體可以是親本序列的功能部分。根據(jù)本發(fā)明另一方面，多肽構(gòu)建體可以是親本序列的同源序列的功能部分。正如此處應(yīng)用的，同源序列可包括添加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，而實(shí)質(zhì)上不改變?cè)摱嚯牡墓δ芴匦?。缺失和替換的氨基酸數(shù)目?jī)?yōu)選為高達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個(gè)氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的同源序列包括通過(guò)添加氨基酸以形成人重鏈抗體和人單個(gè)結(jié)構(gòu)域重鏈抗體而擴(kuò)展的多肽，其不實(shí)質(zhì)上改變未修飾多肽的功能特性。本發(fā)明的同源序列可包括SEQIDNOs:l到47和49到65任一個(gè)所示已被人源化的多肽(如實(shí)施例63和64所述)。本發(fā)明的同源序列可包括對(duì)應(yīng)SEQIDNOs:l到47和49到65任一個(gè)所示序列的序列，其存在于其他駱駝科物種比如駱駝、美洲駝、單峰駱駝、羊駝、駝馬等。同源序列表示序列的一致性，表示與親本序列具有高度序列一致性(超過(guò)70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%序列一致)的序列，優(yōu)選特征在于與親本序列的類似特性，即親和力，所述一致性利用已知方法計(jì)算。備選地，同源序列還可以是根據(jù)下式在親本序列的任何數(shù)目位置進(jìn)行允許的替換所產(chǎn)生的任一氨基酸序列絲氨酸由絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸和天冬酰胺取代；精氨酸由精氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸和谷氨酸之一取代；亮氨酸由亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和纈氨酸之一取代；脯氨酸由脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和蘇氨酸之一取代；蘇氨酸由蘇氨酸、脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、組氨酸和谷氨酰胺之一取代；丙氨酸由丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和脯氨酸之一取代；纈氨酸由纈氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸之一取代；甘氨酸由甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和絲氨酸之一取代；異亮氨酸由異亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸之一取代；苯丙氨酸由苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸之一取代；酪氨酸由酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸之一取代；組氨酸由組氨酸、谷氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸和精氨酸之一取代；谷氨酰胺由谷氨酰胺、谷氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、組氨酸、蘇氨酸和精氨酸之一取代；天冬酰胺由天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和絲氨酸之一取代-,賴氨酸由賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸和精氨酸之一取代；天冬氨酸由天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺之一取代；谷氨酸由谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸和精氨酸之一取代；蛋氨酸由蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸和酪氨酸之一取代。根據(jù)本發(fā)明，同源物可指超過(guò)50、100、200、300、400、500、600、800或1000個(gè)核苷酸、在嚴(yán)格雜交條件下(比如SAMBROOK等人所述，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，紐約)能與編碼多肽的核苷酸序列的反向互補(bǔ)鏈雜交的核苷酸序列。正如此處應(yīng)用的，功能部分指足夠長(zhǎng)度的單結(jié)構(gòu)域抗體使得感興趣的相互作用的親和力保持在lxl(^M或更高。備選地，本發(fā)明單結(jié)構(gòu)域抗體的功能部分包括完整氨基酸序列的部分缺失，但仍保持結(jié)合靶目標(biāo)并與之相互作用所需的結(jié)合位點(diǎn)和蛋白結(jié)構(gòu)域。備選地，SEQIDNO:l到7任一個(gè)的功能部分是多肽，包括完整氨基酸序列的部分缺失，仍保持抑制vWP與膠原蛋白結(jié)合所需的結(jié)合位點(diǎn)和蛋白結(jié)構(gòu)域。備選地，SEQIDNOs:23到31和62到65任一個(gè)的功能部分是多肽，包括完整氨基酸序列的部分缺失，仍保持結(jié)合vWPAl結(jié)構(gòu)域并與之相互作用所需的結(jié)合位點(diǎn)和蛋白結(jié)構(gòu)域。備選地，SEQIDNOs:35到37任一個(gè)的功能部分是多肽，包括完整氨基酸序列的部分缺失，仍保持結(jié)合膠原蛋白并與之相互作用所需的結(jié)合位點(diǎn)和蛋白結(jié)構(gòu)域。備選地，功能部分包括多肽的完整氨基酸序列的部分缺失，仍保持結(jié)合其所針對(duì)的抗原并與之相互作用所需的結(jié)合位點(diǎn)和蛋白結(jié)構(gòu)域。其包括但不限于VHH結(jié)構(gòu)域。正如此處應(yīng)用的，表示多肽序列的功能部分是指少于100%序列(如99%、90%、80%、70%、60%、50%等)，但包括5個(gè)或更多個(gè)氨基酸。如同其表示編碼多肽序列的核苷酸序列的部分是指少于100%序列(如99%、90%、80%、70%、60%、50%等)，但包括15個(gè)或更多個(gè)核苷酸。本發(fā)明一個(gè)方面是根據(jù)本發(fā)明多肽構(gòu)建體的給藥可避免注射?；诔Ｒ?guī)抗體進(jìn)行的治療具有作為藥物的顯著效力，因?yàn)樗鼈儗?duì)其靶目標(biāo)有精確的特異性且很低固有毒性，但它們有一個(gè)重要的缺點(diǎn)相對(duì)不穩(wěn)定，對(duì)蛋白酶降解敏感。這意味著常規(guī)抗體藥物不能通過(guò)口服、舌下、局部、經(jīng)鼻、陰道、直腸或通過(guò)吸入給藥，因?yàn)樗鼈儫o(wú)法耐受這些部位的低pH及這些部位和血液內(nèi)蛋白酶的作用，和/或者它們分子量太大。必須通過(guò)注射給藥(靜脈內(nèi)、皮下等)才能克服部分這些問(wèn)題。注射給藥需要專業(yè)訓(xùn)練以便正確并安全使用皮下注射器或針。還需要無(wú)菌設(shè)備、治療性多肽的液體制劑、該多肽的無(wú)菌且穩(wěn)定形式的安剖包裝及，對(duì)受試者而言，合適的入針部位。另外，受試者在注射前和接受注射時(shí)一般會(huì)有生理和心理壓力。本發(fā)明一個(gè)方面通過(guò)提供本發(fā)明多肽構(gòu)建體，克服了這些現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。該構(gòu)建體足夠小、耐受力強(qiáng)并穩(wěn)定，可以口服、舌下、局部、經(jīng)鼻、陰道、直腸或吸入給藥而實(shí)質(zhì)上不喪失活性。本發(fā)明多肽構(gòu)建體避免了注射，不僅省錢省時(shí)，而且更方便和使受試者更舒適。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案是此處公開(kāi)的多肽構(gòu)建體，用于治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀，所述疾病的癥狀易受一種物質(zhì)調(diào)節(jié)，所述物質(zhì)控制血小板介導(dǎo)的聚集，其可通過(guò)胃環(huán)境而該物質(zhì)不被滅活。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，一旦擁有該多肽構(gòu)建體，可應(yīng)用制劑技術(shù)以在合適部位(如胃、結(jié)腸等)釋放最大量多肽。這種遞送方法對(duì)治療、預(yù)防和/或緩解靶目標(biāo)位于腸道系統(tǒng)的疾病的癥狀非常重要。本發(fā)明一個(gè)方面是通過(guò)給受傷者口服此處公開(kāi)的多肽構(gòu)建體來(lái)治療、預(yù)防和/或緩解疾病癥狀的方法，該疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)調(diào)節(jié)，該物質(zhì)可通過(guò)胃環(huán)境而不被滅活。本發(fā)明另一實(shí)施方案是在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體的用途，用以制備治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀的藥物，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)調(diào)節(jié)，該物質(zhì)可通過(guò)胃環(huán)境而不被滅活。本發(fā)明一個(gè)方面是，通過(guò)給受試者口服在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體來(lái)遞送物質(zhì)到腸道系統(tǒng)而不被滅活的方法，所述物質(zhì)控制血小板介導(dǎo)的聚集。本發(fā)明一個(gè)方面是，通過(guò)給受試者口服在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體來(lái)遞送物M到受試者的血液而不被滅活的方法，所述物質(zhì)控制血小板介導(dǎo)的聚集。本發(fā)明另一實(shí)施方案是在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體，用來(lái)治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)調(diào)節(jié)，該物質(zhì)被遞送到陰道和/或直腸道。一個(gè)非限制性實(shí)施例是，根據(jù)本發(fā)明的制劑，其包含在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體，所述制劑是凝膠、霜?jiǎng)?、栓劑、薄膜的形式，或海綿狀的形式，或作為陰道環(huán)，其隨著時(shí)間緩慢釋放活性成分(此類制劑見(jiàn)EP707473,EP684814,US5629001所述)。本發(fā)明一個(gè)方面是，通過(guò)向受試者陰道和/或直腸給予在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體來(lái)治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀的方法，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)的調(diào)節(jié)，所述該物質(zhì)被遞送到陰道和/或直腸道。本發(fā)明另一實(shí)施方案是在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀的藥物的方法，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)的調(diào)節(jié)，所述該物質(zhì)被遞送到陰道和/或直腸道。本發(fā)明一個(gè)方面是，通過(guò)向受試者陰道和/或直腸道給予在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體將物質(zhì)遞送到陰道和/或直腸道而所述物質(zhì)不被滅活的方法，所述物質(zhì)控制血小板介導(dǎo)的聚集。本發(fā)明一個(gè)方面是，通過(guò)向受試者陰道和/或直腸道給予在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體將物質(zhì)遞送到受試者的血液而所述物質(zhì)不被滅活的方法，所述物質(zhì)控制血小板介導(dǎo)的聚集。本發(fā)明另一實(shí)施方案是在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體，用于治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)調(diào)節(jié)，所述物質(zhì)被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺。在非限制性實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的制劑，其包含在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體，所述制劑是鼻噴霧劑(如氣溶膠)或吸入劑的形式。由于該多肽構(gòu)建體很小，它可以比治療性IgG分子更有效地到達(dá)其耙目標(biāo)。本發(fā)明一個(gè)方面是通過(guò)經(jīng)口或鼻吸入向受試者給予在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體來(lái)治療、預(yù)防和/或緩解疾病癥狀的方法，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)調(diào)節(jié)，所述物質(zhì)被遞送到上呼吸道和肺。本發(fā)明另一實(shí)施方案是在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀的藥物，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)調(diào)節(jié)，所述物質(zhì)被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺而所述多肽不被滅活。本發(fā)明一個(gè)方面是通過(guò)向受試者鼻、上呼吸道和/或肺給予在此公開(kāi)的多肽將物質(zhì)遞送到鼻、上呼吸道和肺而不滅活的方法，所述物質(zhì)控制血小板介導(dǎo)的聚集。本發(fā)明一個(gè)方面是通過(guò)向受試者鼻、上呼吸道和/或肺給予在此公開(kāi)的多肽將物質(zhì)遞送到受試者的血液而不滅活的方法，所述物質(zhì)控制血小板介導(dǎo)的聚集。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案是在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體，用于治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)調(diào)節(jié)，所述物質(zhì)被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加了腸粘膜通透性。由于它們分子量小，在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體可更有效地通過(guò)受試者腸粘膜，到達(dá)血液，這些受試者患有導(dǎo)致腸粘膜通透性增加的疾患。本發(fā)明一個(gè)方面是通過(guò)給受試者口服在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體來(lái)治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀的方法，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)調(diào)節(jié)，所述物質(zhì)被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加了腸粘膜通透性。還可通過(guò)本發(fā)明另一方面-應(yīng)用活性轉(zhuǎn)運(yùn)載體促進(jìn)該過(guò)程。在本發(fā)明該方面，VHH與載體融合，后者可促進(jìn)從腸壁到血液的轉(zhuǎn)移過(guò)程。在非限制性實(shí)施例中，該"載體"是融合到治療性VHH上的第二個(gè)VHH。應(yīng)用本領(lǐng)域已知方法制備該融合構(gòu)建體。該"載體"VHH與腸壁上的受體特異性結(jié)合，后者誘導(dǎo)經(jīng)腸壁的活性轉(zhuǎn)移。本發(fā)明另一實(shí)施方案是在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀的藥物，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)調(diào)節(jié)，所述物質(zhì)被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加了腸粘膜通透性。本發(fā)明一個(gè)方面是通過(guò)受試者口服本發(fā)明的多肽構(gòu)建體，將控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)遞送到腸粘膜而不使之失活的方法。本發(fā)明一個(gè)方面是通過(guò)受試者口服本發(fā)明多肽構(gòu)建體，將控制血小板介導(dǎo)聚集的物質(zhì)運(yùn)送到受試者的血液而不使之失活的方法。還可通過(guò)本發(fā)明另一方面-應(yīng)用活性轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)一步促進(jìn)該過(guò)程。在本發(fā)明該方面，此處描述的多肽構(gòu)建體與載體融合，后者可促進(jìn)從腸壁到血液的轉(zhuǎn)移過(guò)程。在非限制性實(shí)施例中，該"載體"是融合到該多肽上的VHH。應(yīng)用本領(lǐng)域已知方法制備該融合構(gòu)建體。該"載體"VHH與腸壁上的受體特異性結(jié)合，后者誘導(dǎo)經(jīng)腸壁的活性轉(zhuǎn)移。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案是此處描述的多肽構(gòu)建體，用于治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)調(diào)節(jié)，該物質(zhì)能有效通過(guò)舌下組織。將在此公開(kāi)的該多肽構(gòu)建體制劑，例如片劑、噴霧劑、滴劑置于舌下，經(jīng)粘膜吸收到舌下毛細(xì)血管網(wǎng)。本發(fā)明一個(gè)方面是，通過(guò)舌下給予受試者在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體來(lái)治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀的方法，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)調(diào)節(jié)，該物質(zhì)能有效通過(guò)舌下組織。本發(fā)明另一實(shí)施方案是在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀的藥物，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)調(diào)節(jié)，該物質(zhì)能通過(guò)舌下組織。本發(fā)明一個(gè)方面是通過(guò)舌下給予受試者在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體，遞送控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)到舌下組織而不使之失活的方法。本發(fā)明一個(gè)方面是通過(guò)給受試者口服在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體，遞送控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)到受試者血液而不使之失活的方法。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案是在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體，用于治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)調(diào)節(jié)，該物質(zhì)能有效通過(guò)皮膚。將所述多肽構(gòu)建體的制劑例如，霜?jiǎng)?、薄膜、噴霧劑、滴劑、貼片劑置于皮膚，經(jīng)皮吸收。本發(fā)明一個(gè)方面是通過(guò)局部給予受試者此處公開(kāi)的多肽構(gòu)建體來(lái)治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀的方法，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)的控制，所述物質(zhì)能有效通過(guò)皮膚。本發(fā)明另一實(shí)施方案是在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀的藥物，所述疾病的癥狀易受控制血小板介導(dǎo)的聚集的物質(zhì)調(diào)節(jié)，該物質(zhì)能有效通過(guò)皮膚。本發(fā)明一個(gè)方面是通過(guò)對(duì)受試者局部給予在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體，將物質(zhì)遞送到皮膚而不被滅活的方法，所述物質(zhì)控制血小板介導(dǎo)的聚集。本發(fā)明一個(gè)方面是通過(guò)對(duì)受試者具有給予在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體，將物質(zhì)遞送到受試者的血液的方法，所述物質(zhì)控制血小板介導(dǎo)的聚集。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體還包括載體單結(jié)構(gòu)域抗體(如VHH)，其作為活性轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)該多肽構(gòu)建體經(jīng)肺腔至血液。多肽構(gòu)建體還包括特異性結(jié)合粘膜表面(支氣管上皮細(xì)胞)上存在的受體的載體，導(dǎo)致該多肽從肺腔到血液活性轉(zhuǎn)移。該載體單結(jié)構(gòu)域抗體可與該多肽構(gòu)建體融合。應(yīng)用本領(lǐng)域已知及本文描述的方法制備該融合構(gòu)建體。"載體"單結(jié)構(gòu)域抗體與粘膜表面上的受體特異性結(jié)合，后者誘導(dǎo)經(jīng)表面的活性轉(zhuǎn)移。本發(fā)明另一方面是確定哪種單結(jié)構(gòu)域抗體(如VHHs)經(jīng)鼻給藥活性轉(zhuǎn)運(yùn)到血液內(nèi)的方法。類似地，將首次用于實(shí)驗(yàn)或免疫VHH噬菌體文庫(kù)經(jīng)鼻給藥，并于給藥后不同的時(shí)間點(diǎn)，分離血液或器官，拯救(rescue)已被活性轉(zhuǎn)移到血液中的噬菌體。用于從肺腔到血液活性轉(zhuǎn)移的受體的非限制性實(shí)例是Fc受體N(FcRn)。本發(fā)明一個(gè)方面包括根據(jù)該方法鑒別的VHH分子。隨后該VHH可用作載體VHH，用于經(jīng)鼻給藥將治療性VHH轉(zhuǎn)運(yùn)到血液內(nèi)相應(yīng)靶目標(biāo)。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案是在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體，用于治療、預(yù)防和/或緩解疾病的癥狀，所述疾病的癥狀涉及血小板介導(dǎo)的聚集或其機(jī)能障礙。所述疾病包括血栓形成血小板減少性紫癜(TTP)，短暫腦局部缺血性發(fā)作、不穩(wěn)定或穩(wěn)定型心絞痛、腦梗塞、心肌梗塞、周圍動(dòng)脈閉塞性疾病、再狹窄。該疾患還包括冠脈旁路移植、或冠狀動(dòng)脈瓣膜換置和冠脈介入治療如血管成形術(shù)、放置斯坦特印模、或動(dòng)脈粥樣斑塊旋切引發(fā)的癥狀。其他疾病為非閉塞性血栓形成、閉塞性血栓形成、動(dòng)脈血栓形成、急性冠脈閉塞、再狹窄、PCTA或放置斯坦特印模后再狹窄、狹窄的動(dòng)脈內(nèi)血栓形成、血管成形術(shù)、動(dòng)脈粥樣斑塊旋切或動(dòng)脈斯坦特印模后的增生、血管系統(tǒng)的閉塞綜合征或患病的動(dòng)脈開(kāi)放缺陷中的任何一種。本發(fā)明一個(gè)方面是在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體，用于治療、預(yù)防和/或緩解疾病或病癥，所述疾病或病癥與血小板介導(dǎo)的聚集或其機(jī)能障礙相關(guān)，其中該多肽構(gòu)建體被靜脈內(nèi)、皮下、口服、舌下、局部、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)或吸入給藥。本發(fā)明另一方面是在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體用途，用于制備治療、預(yù)防和/或緩解疾病或病癥的藥物，所述疾病或病癥與血小板介導(dǎo)的聚集或其機(jī)能障礙相關(guān)，其中該多肽構(gòu)建體被靜脈內(nèi)、皮下、口服、舌下、局部、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)或吸入給藥。本發(fā)明另一方面是治療、預(yù)防和/或緩解疾病或病癥的方法，所述疾病或病癥與血小板介導(dǎo)的聚集或其機(jī)能障礙相關(guān)，包括將在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體給予受試者，其中該異種特異性多肽構(gòu)建體被靜脈內(nèi)、皮下、口服、舌下、局部、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)或吸入給藥。本發(fā)明另一方面是在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體，用于治療、預(yù)防和/或緩解疾病或病癥，所述疾病或病癥與血小板介導(dǎo)的聚集或其機(jī)能障礙相關(guān)。本發(fā)明另一方面是在此公開(kāi)的多肽的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或緩解與血小板介導(dǎo)的聚集或其機(jī)能障礙相關(guān)的疾病或病癥。利用本發(fā)明多肽構(gòu)建體篩選調(diào)節(jié)多肽與vWF(或gplb或膠原蛋白)結(jié)合的試劑。在測(cè)量結(jié)合力或該多肽單獨(dú)置換的分析中一旦確定試劑，對(duì)試劑進(jìn)行功能測(cè)試，以確定其是否為血小板介導(dǎo)的聚集的調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)置換實(shí)驗(yàn)的實(shí)施例中，表達(dá)vWF或其片段的噬菌體或細(xì)胞在結(jié)合緩沖液中與例如，已被標(biāo)記的SEQIDNO:l所示多肽溫育，加上或不加濃度升高的候選調(diào)節(jié)劑。為了驗(yàn)證和校準(zhǔn)測(cè)試，可利用濃度升高的未標(biāo)記的該多肽進(jìn)行對(duì)照競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。溫育后，充分洗滌細(xì)胞，根據(jù)標(biāo)記物用恰當(dāng)方法測(cè)量結(jié)合的標(biāo)記多肽(如閃爍計(jì)數(shù)、熒光等)。有候選調(diào)節(jié)劑的情況下結(jié)合的標(biāo)記多肽量減少至少10%，說(shuō)明候選調(diào)節(jié)劑置換了結(jié)合。若候選調(diào)節(jié)劑在lpM或更低濃度置換50%標(biāo)記多肽(亞飽和多肽劑量)，則認(rèn)為其在本文描述的該測(cè)試和其它測(cè)試中結(jié)合是特異性的。當(dāng)然，可輕松利用上述方法篩選候選調(diào)節(jié)劑，所述候選調(diào)節(jié)劑改變SEQIDNOs:2到15、20到47和62到65所示多肽或在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體與參與血小板介導(dǎo)的聚集的大分子比如vWF、gplb或膠原蛋白或其片段之間的結(jié)合。備選地，結(jié)合或結(jié)合置換可通過(guò)表面胞質(zhì)團(tuán)共振(SPR)監(jiān)測(cè)。表面胞質(zhì)團(tuán)共振分析可作為定量方法測(cè)量?jī)煞N分子之間的結(jié)合，所述測(cè)量是通過(guò)固定的傳感器附近質(zhì)量的變化進(jìn)行，所述質(zhì)量的變化是由來(lái)自液相的例如SEQIDNO:1所示多肽與固定于傳感器膜上的vWF或其片段之間的結(jié)合或結(jié)合損失所致。該質(zhì)量變化被測(cè)量為在注射或去除所述多肽或候選調(diào)節(jié)劑后相對(duì)于時(shí)間的共振單位，用Biacore生物傳感器測(cè)量(BiocoreAB)。根據(jù)Salamon等人(Salamon等人，1996，BiophysJ.71:283-294;Saiamon等人，2001，BiophysJ.80:1557-1567;Ssalamon等人，1999，TrendsBiochem.Sci.24:213-219,每一篇都在此引用以供參考)所述方法，可將如vWP或其片段固定在薄膜脂質(zhì)膜中的傳感器芯片上(例如，研究級(jí)CM5芯片；BiocoreAB)。Sarrio等人證明SPR可用于檢測(cè)結(jié)合固定到芯片上脂質(zhì)層內(nèi)的GPCRA(l)腺苷受體的配體(SaiTio等人，2000，Mol.Cell.Biol.20:5164-5174，在此引用以供參考)。本發(fā)明多肽構(gòu)建體在SPR分析中的結(jié)合條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用Sarrio等人報(bào)道的條件作為起點(diǎn)進(jìn)行精調(diào)。當(dāng)然，可輕松利用上述方法篩選候選調(diào)節(jié)劑，其改變?cè)诖斯_(kāi)的多肽構(gòu)建體與參與血小板介導(dǎo)的聚集的大分子比如vWF、gplb或膠原蛋白或其片段之間的結(jié)合。SPR至少有兩種方式分析結(jié)合的調(diào)節(jié)劑。首先，例如，可將SEQIDNO:1所示多肽與固定的vWP或其片段預(yù)結(jié)合，然后注射候選調(diào)節(jié)劑，濃度范圍是0.1nM到lpM?？梢远克Y(jié)合多肽的置換，允許檢測(cè)調(diào)節(jié)劑結(jié)合。備選地，膜結(jié)合的vWF或其片段可與候選調(diào)節(jié)劑預(yù)溫育，并被例如SEQIDNO:1所示多肽競(jìng)爭(zhēng)。與不加調(diào)節(jié)劑的所述多肽和vWF或其片段之間的結(jié)合親和力相比，所述多肽和預(yù)溫育了調(diào)節(jié)劑的vWF或其片段的結(jié)合親和力的差別證明，有調(diào)節(jié)劑情況下所述多肽的結(jié)合或置換。另一個(gè)分析中，與不加候選調(diào)節(jié)劑所結(jié)合的所述多肽量相比，加上候選調(diào)節(jié)劑所結(jié)合的該多肽量減少10%或更多，說(shuō)明候選調(diào)節(jié)劑抑制vWF或其片段與該多肽之間的相互作用。當(dāng)然，可輕松利用上述方法篩選候選調(diào)節(jié)劑，其改變SEQIDNOs:2到15、20到47和62到65所示多肽或在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體與參與血小板介導(dǎo)的聚集的大分子比如vWF、gplb或膠原蛋白或其片段之間結(jié)合。另一種檢測(cè)抑制如SEQIDNOs:1到15、20到34、38到45或62到65所示多肽與vWF或其片段結(jié)合的方法采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)。FRET是一種量子力學(xué)現(xiàn)象，其發(fā)生在彼此緊密接近(一般〈100A)的熒光供體(D)和熒光受體(A)之間，條件是D發(fā)射光譜和A的激發(fā)光譜重疊。待測(cè)分子如SEQIDNO:1所示多肽和vWF或其片段用供體和受體的互補(bǔ)熒光團(tuán)對(duì)進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)通過(guò)VWF:多肽相互作用一起緊密結(jié)合時(shí)，供體熒光團(tuán)受激發(fā)而發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與當(dāng)所述多肽未與vWF或其片段結(jié)合時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射的波長(zhǎng)不同，準(zhǔn)備通過(guò)測(cè)量每一波長(zhǎng)的發(fā)射強(qiáng)度可以對(duì)結(jié)合與未結(jié)合的分子進(jìn)行定量。標(biāo)記vWF或其片段的供體熒光團(tuán)為本領(lǐng)域熟知。特別引起人們興趣的是A的變異體。維多利亞GFP已知為青色FP(CFP,供體(D))和黃色FP(YFP,受體(A))。作為一個(gè)實(shí)例，YPP變體可與vWF或其片段形成融合蛋白。GFP變體作為融合物的表達(dá)載體(CIontech)以及熒光團(tuán)標(biāo)記試劑(MolecularProbes)為本領(lǐng)域熟知。將候選調(diào)節(jié)劑加入到熒光標(biāo)記的多肽與YFP-vWF混合物中可抑制能量轉(zhuǎn)移，這通過(guò)如，相對(duì)沒(méi)有候選調(diào)節(jié)劑的樣品，YFP熒光減弱得到證明。在用FRET檢測(cè)vWF:多肽相互作用的分析中，相對(duì)不含候選調(diào)節(jié)劑的樣品而言，含有該候選調(diào)節(jié)劑的樣品中在受體波長(zhǎng)發(fā)射的熒光強(qiáng)度減弱10%或更多，說(shuō)明該候選調(diào)節(jié)劑抑制vWF:多肽相互作用。當(dāng)然，可輕松利用上述方法篩選候選調(diào)節(jié)劑，其改變SEQIDNOs:2到15、20到47和62到65所示多肽或在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體與參與血小板介導(dǎo)的聚集的大分子比如vWF、gplb或膠原蛋白或其片段之間的結(jié)合。FRET的變體利用熒光淬滅來(lái)監(jiān)測(cè)分子相互作用。相互作用對(duì)中的一個(gè)分子用熒光團(tuán)標(biāo)記，另一個(gè)用當(dāng)緊密靠近時(shí)能淬滅熒光團(tuán)熒光的分子標(biāo)記。激發(fā)時(shí)熒光的變化提示標(biāo)記有熒光團(tuán)淬滅劑對(duì)的分子聯(lián)系的變化。一般而言，標(biāo)記vWF或其片段熒光增強(qiáng)說(shuō)明攜帶淬滅劑的多肽分子(如本發(fā)明多肽構(gòu)建體)已被置換。對(duì)于淬滅分析，相對(duì)于沒(méi)有候選調(diào)節(jié)劑的樣品而言，含有該候選調(diào)節(jié)劑的樣品熒光發(fā)射強(qiáng)度增加10%或更多，說(shuō)明該候選調(diào)節(jié)劑抑制vWF:多肽相互作用。當(dāng)然，可輕松利用上述方法篩選候選調(diào)節(jié)劑，其改變?cè)诖斯_(kāi)的多肽構(gòu)建體與參與血小板介導(dǎo)的聚集的大分子比如vWF、gplb或膠原蛋白或其片段之間的結(jié)合。除表面胞質(zhì)團(tuán)共振和FRET方法外，熒光偏振測(cè)量可用于定量結(jié)合。熒光標(biāo)記分子的熒光偏振值有賴于轉(zhuǎn)動(dòng)相關(guān)時(shí)間(rotationalcorrelationtime)或翻轉(zhuǎn)率(tumblingrate)。復(fù)合體，比如那些通過(guò)vWF或其片段與熒光標(biāo)記的多肽(如熒光標(biāo)記的SEQIDNOs:1至ljl5、20到34、38到45和62到65任一個(gè)所示多肽)所形成的復(fù)合體，偏振值要高于未復(fù)合的標(biāo)記多肽。若候選抑制劑破壞或抑制vWF或其片段與所述多肽之間的相互作用，那么相對(duì)于無(wú)候選抑制劑的混合物而言，vWR多肽相互作用的包含候選抑制劑導(dǎo)致熒光偏振值降低。熒光偏振充分適合于鑒定破壞vWP:多肽復(fù)合體形成的小分子。與沒(méi)有候選調(diào)節(jié)劑的樣品的熒光偏振相比，含有該候選調(diào)節(jié)劑的樣品的熒光偏振下降10%或更多，說(shuō)明該候選調(diào)節(jié)劑抑制vWF:多肽相互作用。當(dāng)然，可輕松利用上述方法篩選候選調(diào)節(jié)劑，其改變?cè)诖斯_(kāi)的多肽構(gòu)建體與參與血小板介導(dǎo)的聚集的大分子比如vWF、gplb或膠原蛋白或其片段之間的結(jié)合。另一種監(jiān)測(cè)vWF:多肽相互作用的備選方案采用生物傳感器分析。ICS生物傳感器已在本領(lǐng)域有述(澳大利亞膜生物技術(shù)研究所；CornellB,Braach-MaksvytisV,KingL,OsmanP,RaguseB,WieczorekL,禾口PaceR."Abiosensorthatusesion-channelswitches"Nature,1997，387，580)。在該技術(shù)中，將vWF或其片段與多肽(如SEQIDNOs:1到15、20到34、38到45和62到65任一個(gè)所示多肽)的聯(lián)系，與懸浮的雙層膜內(nèi)gramacidin促進(jìn)的離子通道閉合偶聯(lián)一起，并從而與生物傳感器的導(dǎo)納(admittance)(類似于impedence)的可測(cè)量的變化偶聯(lián)。該方法在導(dǎo)納變化的6個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)是線性的并且非常適于小分子組合文庫(kù)的大規(guī)模、高通量篩選。相對(duì)于沒(méi)有候選調(diào)節(jié)劑的樣品的導(dǎo)納，含有候選調(diào)節(jié)劑的樣品中導(dǎo)納的10%或更大的變化(增加或減小)表明候選調(diào)節(jié)劑抑制vWF或其片段與所述多肽的相互作用。重要的是注意到在檢測(cè)vWF或其片段與多肽(比如，SEQIDNOs:1到15、20到34、38到45和62到65任一個(gè)所示多肽)的相互作用的測(cè)定中，可能相互作用的調(diào)節(jié)劑不必一定直接與在生理上與所述多肽相互作用的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域相互作用。還可能調(diào)節(jié)劑在從相互作用部位除去的位置相互作用并導(dǎo)致，例如，vWF中的構(gòu)象變化。以該方式作用的調(diào)節(jié)劑(抑制劑或激動(dòng)劑)仍然可以作為調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集。當(dāng)然，可輕松利用上述方法篩選候選調(diào)節(jié)劑，其改變于在此公開(kāi)的多肽構(gòu)建體與參與血小板介導(dǎo)的聚集的大分子比如vWF、gplb或膠原蛋白或其片段之間結(jié)合。所描述的任一種結(jié)合測(cè)定法都可用于確定樣品(例如，組織樣品)中試劑的存在，該試劑結(jié)合vWF或其片段，或者影響例如SEQIDNO:1到15、20到34、38到45或62到65任一個(gè)所示多肽與vWF結(jié)合。為此，在樣品的存在或缺乏時(shí)，將vWP或其片段與所述多肽反應(yīng)，并且用對(duì)所使用的結(jié)合測(cè)定適宜的方法測(cè)量多肽結(jié)合。所述多肽的結(jié)合減小10%或者更多表明該樣品含有調(diào)節(jié)所述多肽與vWF或其片段結(jié)合的試劑。當(dāng)然，上面的一般化方法可容易地應(yīng)用于篩選候選調(diào)節(jié)劑，該候選調(diào)節(jié)劑改變此處公開(kāi)的多肽構(gòu)建體與參與血小板介導(dǎo)的聚集的大分子比如vWF、gpIb或膠原蛋白或其片段之間結(jié)合。細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明有用的細(xì)胞優(yōu)選選自細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌、酵母細(xì)胞例如，釀酒酵母(S.cerevisiae)、畢赤巴斯德酵母(P.pastors)、昆蟲(chóng)細(xì)胞，或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明使用的細(xì)胞可以是任一細(xì)胞，依照本發(fā)明編碼含有SEQIDNOs:1到47和49到65任一個(gè)的多肽，或根據(jù)本發(fā)明的多肽構(gòu)建體的核酸序列可被導(dǎo)入該細(xì)胞，從而該多肽可以以如文中定義的天然水平或者高于天然水平表達(dá)。優(yōu)選地，在細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明的多肽顯示出如文中定義的正常的或者接近正常的藥理學(xué)。最優(yōu)選地，在細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明的多肽包括核苷酸序列，該核苷酸序列能夠編碼表30中給出的氨基酸序列或者能夠編碼與表30中給出的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，細(xì)胞選自COS7-細(xì)胞、CHO細(xì)胞、LM(TK-)細(xì)胞、NIH-3T3細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞、K-562細(xì)胞或者1321Nl星形細(xì)胞瘤細(xì)胞(astrocytomacell)以及其他可被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。通常，"治療有效量"、"治療有效劑量"和"有效量"指實(shí)現(xiàn)所希望的一個(gè)或多個(gè)結(jié)果(治療或預(yù)防血小板聚集)所需的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到潛能和因此"有效量"將隨著用于本發(fā)明中抑制血小板聚集的多種化合物而變。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易評(píng)估該化合物的潛能。如文中所用的，術(shù)語(yǔ)"化合物"指此處公開(kāi)的多肽構(gòu)建體、或能夠編碼所述多肽的核酸、或者依照此處描述的篩選方法鑒定的試劑或包含一個(gè)或多個(gè)衍生化的氨基酸的所述多肽。"藥學(xué)上可接受的"指不是生物學(xué)上的材料或者不是不希望的材料，即，該材料可以與該化合物一起施用于個(gè)體而不導(dǎo)致任何不希望的生物學(xué)效應(yīng)或不與藥物組合物中所含有的其他組分的任一種以有害的方式相互作用。在此公開(kāi)的發(fā)明對(duì)受試者有助于治療或預(yù)防血小板介導(dǎo)的聚集的疾病，包括給予藥物有效量的化合物或組合物，抑制BTK及抑制血小板介導(dǎo)的聚集。在此公開(kāi)的發(fā)明對(duì)受試者有助于治療或預(yù)防血栓形成的第一步，包括給予藥物有效量的根據(jù)本發(fā)明的化合物或組合物。在此公開(kāi)的發(fā)明對(duì)受試者有助于治療或預(yù)防再狹窄，包括給予藥物有效量的根據(jù)本發(fā)明的化合物或組合物。本發(fā)明一個(gè)方面是本發(fā)明化合物的用途，用于治療或預(yù)防受試者血小板介導(dǎo)的聚集的疾病，包括聯(lián)合另一種例如阿司匹林給予藥物有效量的化合物。本發(fā)明一個(gè)方面是本發(fā)明化合物的用途，用于治療或預(yù)防受試者血小板介導(dǎo)的聚集的疾病，包括聯(lián)合另一種例如溶解血栓試劑給予藥物有效量的化合物。本發(fā)明另一方面是本發(fā)明化合物的用途，用于治療或預(yù)防個(gè)體斑塊或血栓。所述斑塊或血栓可在高切應(yīng)力條件下形成。在血栓形成和再閉塞中，血小板在高切應(yīng)力速率下發(fā)生可逆的粘附或栓縛，然后通過(guò)血小板上的膠原蛋白受體形成牢固粘附，導(dǎo)致血小板活化；血小板通過(guò)vWF栓縛到受損血管壁內(nèi)裸露的膠原蛋白上，這在高切應(yīng)力條件下尤為重要。本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的多肽構(gòu)建體在高切應(yīng)力條件下出人意料的表現(xiàn)良好(例如，實(shí)施例16)。本發(fā)明并不限于給藥包括本發(fā)明單一化合物的制劑。本發(fā)明范圍還包括聯(lián)合治療，其中將包括超過(guò)一種本發(fā)明化合物的制劑給予所需患者。血小板介導(dǎo)的聚集的疾病包括，但不限于，不穩(wěn)定型心絞痛、穩(wěn)定型心絞痛、心絞痛、栓子形成、深靜脈血栓形成、溶血性尿毒癥綜合征、溶血性貧血、急性腎衰竭、溶解血栓并發(fā)癥、血栓形成血小板減少性紫癜、彌散性血管內(nèi)comgelopathy、血栓癥、冠心病、血栓栓塞并發(fā)癥、心肌梗塞、再狹窄和心房纖維性顫動(dòng)中的血栓形成、慢性不穩(wěn)定型心絞痛、短暫局部缺血性發(fā)作和中風(fēng)、周圍血管疾病、動(dòng)脈血栓形成、子癇前期、栓塞、再狹窄和/或血管成形術(shù)、頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)、血管移植物的接合及慢性接觸心血管裝置后的血栓形成。該疾病也可產(chǎn)生自溶栓治療過(guò)程中和治療后、血管成形術(shù)后及冠脈旁路(術(shù))后的血栓栓塞和再閉合。如何應(yīng)用本文所述標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試或應(yīng)用其他類似測(cè)試方法確定血小板介導(dǎo)的聚集的抑制，為本領(lǐng)域熟知。優(yōu)選地，該方法導(dǎo)致血小板介導(dǎo)的聚集減少至少10%，包括，例如，15%，20%,25%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%,或任何中間數(shù)值，最優(yōu)選90%。類似地，該方法導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員下降至少10%，包括，例如，15%，20%,25%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%。類似地，該方法導(dǎo)致磷酸化PLCg2水平下降至少10。/。，包括，例如，15%，20%,25%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%。例如可通過(guò)比較時(shí)序血小板凝集計(jì)(chronologyplateletaggregometer)中的光阻(opticalimpedence)來(lái)測(cè)量這種減少。也可使用任何其他己知測(cè)量方法。例如，(1)膠原蛋白刺激時(shí)，膠原蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員的水平隨時(shí)間增加，因此測(cè)量可包括測(cè)量膠原蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣水平，或(2)膠原蛋白刺激時(shí)，磷酸化PLCg2水平隨時(shí)間增加，因此測(cè)量可包括測(cè)量磷酸化PLCg2水平。可體外接觸細(xì)胞，例如通過(guò)將本發(fā)明化合物加到培養(yǎng)基中(通過(guò)持續(xù)輸注、通過(guò)丸劑運(yùn)送或通過(guò)將培養(yǎng)基更換為含有化合物的培養(yǎng)基)，或?qū)⒒衔锛拥襟w內(nèi)細(xì)胞外流體(通過(guò)局部運(yùn)送、全身運(yùn)送、吸入、靜脈內(nèi)注射、丸劑運(yùn)送或持續(xù)輸注)進(jìn)行。根據(jù)化合物在浸泡細(xì)胞或細(xì)胞群的培養(yǎng)基或胞外流體中以有效生理水平或推斷的有效生理水平存在的時(shí)間，來(lái)確定與細(xì)胞或細(xì)胞群"接觸"的持續(xù)時(shí)間。優(yōu)選地，接觸的持續(xù)時(shí)間是l-96小時(shí)，更優(yōu)選地，是24小時(shí)，但該時(shí)間會(huì)隨化合物的半衰期而變，本領(lǐng)域技術(shù)人員可應(yīng)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化?？蓪⒂糜诒景l(fā)明的化合物配制成藥用組合物，并通過(guò)適于選擇的給藥途徑的各種形式施用于哺乳動(dòng)物宿主，如人類患者或家畜，所述給藥途徑即口服或胃腸外，通過(guò)鼻內(nèi)或吸入、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、局部或皮下路徑。本發(fā)明化合物也可應(yīng)用運(yùn)送的基因治療方法給藥。見(jiàn)如美國(guó)專利號(hào)No5,399,346，在此全文引用以供參考。應(yīng)用運(yùn)送的基因治療方法，轉(zhuǎn)染有本發(fā)明化合物的基因的原代細(xì)胞還可另外轉(zhuǎn)染組織特異性啟動(dòng)子以定位特異性器官、組織、移植物、腫瘤或細(xì)胞。因此，本發(fā)明化合物可聯(lián)合藥用載體如惰性稀釋液或可同化的食用載體全身給藥，如口服。它們可封入硬或軟殼明膠膠囊內(nèi)，可壓縮成片劑或直接摻入到患者食物內(nèi)?？诜o藥治療的話，活性化合物可聯(lián)合一種或多種賦形劑，以可吸收的片劑、口含片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸液、糖漿、糯米紙囊劑等等形式使用。此類組合物和制劑應(yīng)包含至少0.1%活性化合物。當(dāng)然，組合物和制劑的百分比可發(fā)生變化，可便利地介于所給單位劑量形式的約2%到約60%重量之間。該治療有用組合物中活性化合物的數(shù)量應(yīng)獲得有效劑量水平。片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等等還可以含有下面的結(jié)合劑，如黃蓍樹(shù)膠、阿拉伯樹(shù)膠、玉米淀粉或者明膠；賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等等；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂；和甜味劑如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦或者增香劑如歐薄荷、冬青油，或者櫻桃香料。當(dāng)單位劑型是膠囊劑時(shí)，其除了上面類型的物質(zhì)，還可以含有液態(tài)載體，如植物油或者聚乙二醇?？梢源嬖诙喾N其他材料作為包衣或者另外改變固態(tài)單位劑型的物理形式。例如，用明膠、蠟、蟲(chóng)膠或者糖等等可以將片劑、丸劑或者膠囊劑包衣。糖漿劑或者酏劑可以含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖或者果糖、作為防腐劑的對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯、染料和香料如櫻桃或者桔子香料。當(dāng)然，用制備任一單位劑型中的任一材料都應(yīng)該是藥學(xué)上可接受的并且在用量?jī)?nèi)實(shí)質(zhì)上無(wú)毒。此外，活性化合物可被摻入緩釋制劑和裝置?；钚曰衔镆部赏ㄟ^(guò)輸注或注射而靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)給藥?；钚曰衔锶芤夯蚱潲}可在水中制備，并隨意與無(wú)毒表面活性劑混和。分散相也可在甘油、液體聚乙二醇、醋酸甘油和其混合物以及油中制備。在普通儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑，防止細(xì)菌滋生。還可以通過(guò)灌注或注射，靜脈內(nèi)或者腹膜內(nèi)地施用活性化合物?？梢栽谒兄苽浠钚曰衔锘蛘咂潲}的溶液，其任選與無(wú)毒表面活性劑混合。還可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇、三醋精，和它們的混合物和油中制備分散劑。在保存和使用的通常條件下，這些制劑含有用于防止微生物生長(zhǎng)的防腐劑。適于注射或灌注的藥學(xué)劑型可包括含有活性成分的無(wú)菌水性溶液或者分散劑或者無(wú)菌粉劑，其適于臨時(shí)制備無(wú)菌注射液或者灌注液或分散劑，任選封裝在脂質(zhì)體中。在所有情況中，最終劑型在生產(chǎn)和保存條件下必須是無(wú)菌的、液態(tài)和穩(wěn)定的。液態(tài)載體或賦形劑可以是溶劑或者液態(tài)分散介質(zhì)，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇，等等)、植物油、無(wú)毒甘油酯，和它們的適宜的混合物。通過(guò)例如，形成脂質(zhì)體，對(duì)于分散劑的情況，通過(guò)保持所需要的顆粒大小或者通過(guò)使用表面活性劑可以保持適當(dāng)流動(dòng)性。通過(guò)多種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞，等等可以防止微生物的作用。在許多情況中，優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖、緩沖劑或者氯化鈉。通過(guò)在組合物中使用延遲吸收的試劑，例如，單硬脂酸鋁和明膠可以延長(zhǎng)可注射組合物的吸收。將適當(dāng)溶劑中的所需要的量的活性化合物與上面列舉的多種其他成分(如果需要)合并，然后過(guò)濾除菌可以制備無(wú)菌注射液。對(duì)于用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉劑的情況，優(yōu)選制備方法是真空干燥和冰凍干燥技術(shù)，這些技術(shù)產(chǎn)生前面無(wú)菌過(guò)濾溶液中存在的活性成分加上額外的所希望的成分的粉末。對(duì)于局部施用，本化合物可以以純的形式應(yīng)用(即，當(dāng)它們是液體時(shí))。然而，通常希望將它們作為組合物或者制劑，聯(lián)合皮膚病學(xué)上可接受的載體施用于皮膚，這些載體可以是固體或者液體?？捎玫墓虘B(tài)載體包括細(xì)分的固體，如滑石、粘土、微晶纖維素、硅土、礬土，等等?？捎玫囊簯B(tài)載體包括水、羥烷基或二元醇或者水-乙醇/二元醇摻合物，其中本化合物可以任選通過(guò)無(wú)毒表面活性劑的幫助以有效水平溶解或者分散?？梢约尤胱魟┲T如芳香劑或者抗微生物劑以優(yōu)化給定用途的性質(zhì)。所得液態(tài)組合物可以從吸收墊應(yīng)用，用于浸漬繃帶或者其他包扎用品，或者使用泵型或者氣溶膠噴霧器噴到受侵襲的區(qū)域。增稠劑如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯、脂肪醇、改性纖維素或者改性礦物材料可以與液態(tài)載體一起使用以形成可涂抹的膏劑、凝膠劑、軟膏劑、皂劑，等等，以直接應(yīng)用于使用者的皮膚?？捎糜趯⒃摶衔镞f送到皮膚的有用的皮膚病學(xué)組合物的實(shí)例是本領(lǐng)域中公知的；例如，見(jiàn)Jacquet等人(美國(guó)專利號(hào)4,608,392)、Geria(美國(guó)專利號(hào)4,992,478)、Sndth等人(美國(guó)專利號(hào)4,559，157)和Wortzman(美國(guó)專利號(hào)4,820,508)。通過(guò)比較化合物的體外活性和動(dòng)物模型中的體內(nèi)活性可以確定該化合物的有用劑量。將小鼠，和其他動(dòng)物中的有效劑量外推到人的方法是本領(lǐng)域中公知的；例如，見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,938，949。通常，液態(tài)組合物如洗劑中化合物的濃度將為約0.1-25wt-%，優(yōu)選約0.5-10wt-%。半固態(tài)或者固態(tài)組合物如凝膠劑或者粉劑中的濃度將為約0.1-5wt-%，優(yōu)選約0.5-2.5wt-%。用于治療所需的化合物，或者其活性鹽或者衍生物的量將不僅隨著所選的具體鹽而且隨著施用途徑、被治療的病癥的性質(zhì)和患者的年齡和狀況而變，并且將最終由主治醫(yī)生或者臨床醫(yī)生的判斷決定。而且該化合物的劑量將根據(jù)耙細(xì)胞、腫瘤、組織、移植物，或者器官而變。所希望的劑量可便利地作為單劑給出或者作為分開(kāi)的劑量給出，該分開(kāi)的劑量以適宜的間隔施用，例如，作為每天2、3、4或多個(gè)亞劑量。該亞劑量本身還可以被分成例如，許多離散的松散隔開(kāi)的施用；諸如吹入器的多次吸入或者通過(guò)應(yīng)用于眼睛的多次滴劑。施用方案可以包括長(zhǎng)期的、每日治療。"長(zhǎng)期"指至少兩周，優(yōu)選數(shù)周、數(shù)月或者數(shù)年持續(xù)時(shí)間。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅使用此處教導(dǎo)中的常規(guī)實(shí)驗(yàn)法就可以確定該齊'J量范圍中必要的修飾。見(jiàn)Remington'sPharmaceuticalSciences(Martin,E.W.,第四版)，MackPublishingCo.,Easton,PA。如果發(fā)生任何并發(fā)癥，個(gè)別醫(yī)生還可以調(diào)節(jié)劑量。本發(fā)明提供血小板介導(dǎo)的聚集的調(diào)節(jié)劑。候選試劑可以是合成試劑，或者試劑的混合物，或者可以是天然產(chǎn)物(例如，植物提取物或者培養(yǎng)上清液)。根據(jù)本發(fā)明的候選試劑包括可以合成的小分子、天然提取物、肽、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)等?？梢詮暮铣傻幕蛱烊辉噭┑拇笪膸?kù)中篩選候選調(diào)節(jié)劑。當(dāng)前利用多種方法隨機(jī)和定向合成糖、肽、和基于核酸的試劑?？梢酝ㄟ^(guò)商業(yè)途徑從許多公司得到合成試劑文庫(kù)，這些公司包括MaybridgeChemicalCo.(Trevillet,Cornwall,UK)、Comgenex(Princeton,NJ)、BrandonAssociates(Merrimack,NH)、禾口Microsource(NewMilford,CT)。從Aldrich(Milwaukee,WI)可以得到稀有化學(xué)品文庫(kù)。可以得到并且可以制備組合文庫(kù)。備選地，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然試劑的文庫(kù)可以從例如，PanLaboratories(Bothell,WA)或MycoSearch(NC)得到，或者通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的方法容易地制備。此外，通過(guò)常規(guī)化學(xué)、物理和生物化學(xué)方法容易修飾天然的和合成產(chǎn)生的文庫(kù)和試劑。在多種化學(xué)品類別中可以發(fā)現(xiàn)有用的試劑。有用的試劑可以是有機(jī)試劑，或者小有機(jī)試劑。小有機(jī)試劑的分子量大于50但是小于約2,500道爾頓，優(yōu)選小于約750，更優(yōu)選小于約350道爾頓。代表性類別包括雜環(huán)類、肽、糖、類固醇，等等?？梢孕揎椷@些試劑以增強(qiáng)效能、穩(wěn)定性、藥物相容性，等等。試劑的結(jié)構(gòu)鑒定可用于鑒定、產(chǎn)生或者篩選額外試劑。例如，當(dāng)鑒定了肽試劑時(shí)，可將它們以各種方法修飾以增強(qiáng)它們的穩(wěn)定性，諸如使用非天然氨基酸，如D-氨基酸，尤其D-丙氨酸，通過(guò)功能化氨基或者羧基末端，例如，對(duì)于氨基，酰化或者烷基化，對(duì)于羧基，酯化或者酰胺化，等等。對(duì)于初步篩選，根據(jù)本發(fā)明的候選試劑的有用濃度為約10mM到約100pM或以上(即，lmM、10mM、100mM、1M等)。初步篩選濃度將用作上限，以及9種額外的濃度，其中通過(guò)將初步篩選濃度以半對(duì)數(shù)間隔(例如，對(duì)于9種額外的濃度)減小用于二次篩選或者用于產(chǎn)生濃度曲線來(lái)確定額外的濃度。高通量篩選試劑盒根據(jù)本發(fā)明的高通量篩選試劑盒含有實(shí)施試劑的檢測(cè)所有必要的方法和介質(zhì)，該試劑通過(guò)在存在多肽(例如，SEQIDNOs:1到15、20到34、38到45、62到65所示多肽或多肽構(gòu)建體)，優(yōu)選濃度范圍為lpM到lmM，與本發(fā)明靶目標(biāo)例如vWF或其片段發(fā)生相互作用來(lái)調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集。該試劑盒包括下列組分。本發(fā)明的重組細(xì)胞，包括和表達(dá)編碼vWF或其片段的核苷酸序列，根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法，特別如WO00/02045所述，根據(jù)試劑盒在固體載體上，例如微量滴定板，更優(yōu)選96孔微量滴定板上生長(zhǎng)細(xì)胞。備選地，以純化形式提供vWF或其片段，由本領(lǐng)域技術(shù)人員將其固定于例如96孔微量滴定板上。備選地，提供試劑盒內(nèi)預(yù)固定于，例如96孔微量滴定板上的vWF或其片段。備選地，在進(jìn)行針對(duì)gplb、gpla/lla或膠原蛋白的大分子篩選時(shí)，上述實(shí)施方案可分別用gplb、gpla/lla或膠原蛋白多肽或多聚核酸來(lái)取代vWF。試劑盒中可含有一個(gè)以上的大分子(例如vWF、gplb或膠原蛋白大分子和/或多聚核酸)。將濃度約為l[iM-lmM或更高的本發(fā)明調(diào)節(jié)劑加入到存在適宜濃度多肽構(gòu)建體的特定孔中，所述多肽的所述濃度優(yōu)選范圍是1^VI到1mM。試劑盒可含有一個(gè)以上的多肽。根據(jù)在此已公開(kāi)的方法進(jìn)行結(jié)合分析，將此結(jié)果與例如沒(méi)有加入調(diào)節(jié)劑時(shí)vWF或其片段與多肽的結(jié)合的基線水平進(jìn)行比較，該多肽是例如，SEQIDNo:2到15、20到34、38到45或62到65任一個(gè)所示多肽。選擇與不存在調(diào)節(jié)劑的活性水平相比，vWF-多肽結(jié)合能力(例如)升高或降低至少2倍、優(yōu)選5倍、更優(yōu)選10倍、最優(yōu)選100倍或更高的培養(yǎng)孔進(jìn)行進(jìn)一步的分析。根據(jù)本發(fā)明使用的其它試劑盒本發(fā)明提供用于篩選血小板介導(dǎo)的聚集的調(diào)節(jié)劑的試劑盒，以及用于診斷以血小板介導(dǎo)的聚集失調(diào)為特征的疾病或疾患的試劑盒。本發(fā)明采用的試劑盒可包括分離的vWF或其片段。備選地，或另外，試劑盒可包括表達(dá)vWF或其片段的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒可包括編碼vWF或其片段的多聚核苷酸。在更進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒可包括用于擴(kuò)增vWF或其片段的特異引物。備選地，在進(jìn)行針對(duì)gplb或膠原蛋白的大分子篩選時(shí)，上述實(shí)施方案可分別采用gplb、gpla/lla或膠原蛋白多肽或多聚核酸或其片段來(lái)取代vWF。試劑盒可含有一個(gè)以上的大分子(例如，vWF、gplb或膠原蛋白大分子或多聚核酸或其片段)。本發(fā)明所采用的試劑盒可包括SEQIDNOs:1到15、20到47或62到65任一個(gè)所示分離的多肽，其同源物，或其功能部分，或本發(fā)明的多肽構(gòu)建體。本發(fā)明試劑盒可包括表達(dá)所述多肽的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。試劑盒可包含一種以上的多肽。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒可包括編碼大分子，例如vWF、gplb或膠原蛋白，或其片段的多聚核苷酸。在更進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒可包括用于擴(kuò)增大分子，例如vWF、gplb或膠原蛋白、或其片段的特異引物。根據(jù)本發(fā)明的所有試劑盒將含有所陳述的物品或者物品的組合和包裝材料。試劑盒將還包括使用說(shuō)明書(shū)。醫(yī)學(xué)裝置本發(fā)明還提供由本發(fā)明多肽構(gòu)建體或根據(jù)本發(fā)明篩選方法所得試劑包被的侵入性醫(yī)學(xué)裝置，所述多肽構(gòu)建體或試劑用于需要其的裝置。非限制性裝置實(shí)例包括外科導(dǎo)管、閉塞裝置、假體裝置(prostheticdevices)。上述裝置的應(yīng)用包括需要在侵入部位周圍調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集的外科手術(shù)程序。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案是處理侵入性醫(yī)學(xué)裝置的方法，以防止在侵入部位周圍的血小板介導(dǎo)的聚集，所述方法包括用本發(fā)明多肽構(gòu)建體或試劑包被該裝置的步驟。本發(fā)明另一實(shí)施方案是防止侵入部位周圍發(fā)生血小板介導(dǎo)的聚集的侵入性醫(yī)學(xué)裝置，其中所述裝置包被有本發(fā)明多肽構(gòu)建體或試劑。實(shí)施例通過(guò)下列非限制性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)施例圖例實(shí)施例1.免疫美洲駝002實(shí)施例2.所有組成成分的克隆實(shí)施例3.文庫(kù)拯救，噬菌體制備抑制與膠原蛋白相互作用的vWF結(jié)合物的篩選-實(shí)施例4.抑制與膠原蛋白相互作用的vWF結(jié)合物的篩選，第一輪和第二輪淘洗實(shí)施例5.vWF結(jié)合物通過(guò)VHH抑制vWF與膠原蛋白結(jié)合的功能特征實(shí)施例6.VHH的表達(dá)及純化實(shí)施例7.vWF結(jié)合性ELISA實(shí)施例8.VHHs的特異性實(shí)施例9.純化的VHH抑制ELISA實(shí)施例10.克隆的測(cè)序?qū)嵤├?1.表位作圖實(shí)施例12.二價(jià)和雙特異性VHHs的表達(dá)及純化實(shí)施例13.在ELISA中結(jié)合vWF實(shí)施例14.純化的VHH抑制ELISA實(shí)施例15.人類血漿中二價(jià)或雙特異性構(gòu)建體的穩(wěn)定性實(shí)施例16.在高切應(yīng)力下評(píng)估VHH的抑制作用抑制與血小板相互作用的vWF結(jié)合物的選擇實(shí)施例17.抑制與血小板相互作用的vWF結(jié)合物的選擇淘洗實(shí)施例18.與vWF的Al結(jié)構(gòu)域結(jié)合的篩選實(shí)施例19.抑制與血小板相互作用的vWF結(jié)合物的選擇MATCHM實(shí)施例20.純化的VHH與vWF結(jié)合性ELISA實(shí)施例21.純化的VHH的抑制性ELISA實(shí)施例22.克隆的測(cè)序?qū)嵤├?3.評(píng)估高切應(yīng)力條件下VHH的抑制作用實(shí)施例24.二價(jià)Vlffl的表達(dá)和純化實(shí)施例25.評(píng)估高切應(yīng)力條件下VHH的抑制作用制備vWF-特異性VHH的雙特異性構(gòu)建體實(shí)施例26.雙特異性構(gòu)建體的構(gòu)建及序列實(shí)施例27.雙特異性構(gòu)建體的表達(dá)及純化實(shí)施例28.vWF結(jié)合試驗(yàn)實(shí)施例29.通過(guò)雙特異性構(gòu)建體抑制vWF與膠原蛋白的結(jié)合，并與單價(jià)VHH的作用進(jìn)行比較實(shí)施例30.評(píng)估高切應(yīng)力下VHH的抑制作用篩選I型和III型膠原蛋白的結(jié)合物實(shí)施例31.I型膠原蛋白結(jié)合物的選擇實(shí)施例32.應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)VHH與I型和III型膠原蛋白的結(jié)合實(shí)施例33.克隆的測(cè)序?qū)嵤├?4.純化VHH與I型和III型膠原蛋白的結(jié)合實(shí)施例35.抑制與vWF相互作用的I型膠原蛋白結(jié)合物的選擇實(shí)施例36.應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)VHH與I型和III型膠原蛋白的結(jié)合實(shí)施例37.克隆的測(cè)序?qū)嵤├?8.純化的VHH與I型和III型膠原蛋白的結(jié)合實(shí)施例39.應(yīng)用EL.ISA方法檢測(cè)膠原蛋白-特異性VHH抑制vWF與膠原蛋白的結(jié)合實(shí)施例40.檢測(cè)低和高切應(yīng)力下膠原蛋白-特異性VHH抑制血小板聚集改良的VHH半衰期實(shí)施例41.免疫美洲駝(llamas)實(shí)施例.42.所有組成成分的克隆實(shí)施例43.文庫(kù)拯救,噬菌體制備實(shí)施例44.噬菌體ELISA實(shí)施例45.第一和第二輪生物淘洗的選擇實(shí)施例46.篩選生物淘洗后的單個(gè)克隆實(shí)施例47.Hinfl圖譜及測(cè)序?qū)嵤├?8.檢測(cè)不同物種清蛋白的交叉反應(yīng)性實(shí)施例49.表達(dá)及純化實(shí)施例50.純化的nanobodies在MSA上的ELISA實(shí)施例51.雙特異性構(gòu)建體的構(gòu)建及序列實(shí)施例52.雙特異性構(gòu)建體的表達(dá)及純化實(shí)施例53.雙特異性構(gòu)建體中兩種VHH的功能作用實(shí)施例54.比較單價(jià)VHH及雙特異性構(gòu)建體抑制vWF與膠原蛋白的結(jié)合抑制與vWF相互作用的gplb結(jié)合物的選擇實(shí)施例55.rgplb結(jié)合物的選擇實(shí)施例56.應(yīng)用ELISA篩選結(jié)合物實(shí)施例57.純化的VHH與rgplb的結(jié)合實(shí)施例58.克隆的測(cè)序?qū)嵤├?9.檢測(cè)gplb特異性的VHH的抑制性能實(shí)施例60.評(píng)估高切應(yīng)力下VHH的抑制作用應(yīng)用VHH包被斯坦特印模、套管、氣囊、導(dǎo)管和移植材料實(shí)施例61.VHH的穩(wěn)定性實(shí)施例62.VHH固定于聚合物上C37的人源化實(shí)施例63.進(jìn)行C37與DP-47的比對(duì)實(shí)施例64.C37的誘變抗VWFVHHs的片段實(shí)施例65.vWF-C37的VHH-CDR3.片段的表達(dá)實(shí)施例66.通過(guò)第一和第二輪生物淘洗進(jìn)行重組體Al(rAl)的選擇實(shí)施例67.生物淘洗后進(jìn)行單個(gè)克隆的篩選實(shí)施例68.Hinfl圖譜及測(cè)序?qū)嵤├?9.抑制性ELISA實(shí)施例實(shí)施例1:免疫美洲駝002應(yīng)用vWF和I型和III型膠原蛋白混合物對(duì)一只美洲駝進(jìn)行免疫。那些抗原均參與了第一次相互作用，導(dǎo)致血小板聚集(圖1)。在表1中對(duì)免疫方案進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹。實(shí)施例2:所有組成成分的克隆通過(guò)密度梯度離心方法(FicoII-PaquePlusAmershamBiosciences)分離外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)。將PBLs用于提取總RNA(ChomczynskiandSacchi1987)。用IOO嗎總RNA及MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(GibcoBRL)和寡聚d(T)寡核苷酸制備cDNA。應(yīng)用苯酚/氯仿進(jìn)行cDNA純化，然后進(jìn)行乙醇沉淀，隨后用作擴(kuò)增VHH所有組成成分的模板。在首輪PCR反應(yīng)中，用特異性先導(dǎo)引物(5，一GGCTGAGCTCGGTGGTCCTGGCT-3，)(SEQIDNO:66)及寡聚d(T)引物(SEQIDNO:67)擴(kuò)增保守(1.6kb)及重鏈(1.3kb)抗體基因片段的所有組成成分。應(yīng)用瓊脂糖膠電泳分離所產(chǎn)生的DNA片段，從瓊脂糖凝膠中純化編碼重鏈抗體片段的1.3kb片段。應(yīng)用FRI反向引物及相同寡聚d(T)正向引物的混合物進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)。應(yīng)用S//(加入FR1引物內(nèi))和&￡//(FIl4中天然存在)消化PCR產(chǎn)物。進(jìn)行凝膠電泳后，從凝膠中純化長(zhǎng)度約為400個(gè)堿基對(duì)的DNA片段，并連接到噬菌粒pAX004相應(yīng)限制性酶切位點(diǎn)，電穿孔大腸桿菌TG1后獲得VHHs克隆文庫(kù)。文庫(kù)大小為1.4xl07cfu，且所有克隆均含有正確大小的插入片段。實(shí)施例3:文庫(kù)拯救，噬菌體制備該文庫(kù)在37°(:、含有2%葡萄糖及100pg/ml氨芐青霉素的10ml2xTY培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)，直到OD600nm值達(dá)到0.5。加入M13K07噬菌體(1012)，37r條件下溫育混合物2x30分鐘，開(kāi)始時(shí)不進(jìn)行振蕩，然后以100rpm振蕩。室溫下4500rpm離心細(xì)胞10分鐘。將細(xì)菌沉淀重懸于含有100嗎/ml氨芐青霉素及25^ig/ml卡那霉素的50ml2xTY培養(yǎng)基，37°C、250rpm劇烈振蕩條件下溫育過(guò)夜。過(guò)夜培養(yǎng)物在4。C下10000rpm離心15分鐘。PEG(20%聚乙二醇和1.5MNaCl)沉淀噬菌體，10000rpm離心30分鐘。用20mlPBS重懸沉淀物。再次進(jìn)行噬菌體PEG沉淀，4°C，20000rpm離心30分鐘。用5mlPBS-1%酪蛋白溶解沉淀物。通過(guò)感染OD600nm=0.5的TG1細(xì)胞，將其接種于含100嗎/ml氨節(jié)青霉素和2%葡萄糖的LB瓊脂平板上，進(jìn)行噬菌體滴定。轉(zhuǎn)化體的數(shù)目表示噬菌體的數(shù)目(=pfo)。用15%甘油-80'〇保存噬菌體。抑制與膠原蛋白相互作用的vWF結(jié)合物的選擇(圖2)實(shí)施例4:抑制與膠原蛋白相互作用的vWF結(jié)合物選擇第一輪及第二輪淘洗用2嗎/mlvWF或含有1%酪蛋白的PBS包被微量滴定板上的孔。4。C溫育過(guò)夜后，在室溫條件下應(yīng)用含有1^酪蛋白的PBS對(duì)孔封閉3小時(shí)。將200)il噬菌體加入孔中。室溫溫育2小時(shí)后，用PBS-吐溫及PBS分別沖洗10次培養(yǎng)孔。用10(^1濃度為lOOpg/ml的III型膠原蛋白進(jìn)行噬菌體的特異性洗脫。在室溫過(guò)夜條件下進(jìn)行洗脫。將洗脫的噬菌體感染指數(shù)生長(zhǎng)的TG1細(xì)胞，然后將其接種到含有100嗎/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖的LB瓊脂平皿上。如上在上述相同條件下，重復(fù)進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第二輪淘洗。淘洗結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)施例5:vWF結(jié)合物的功能表征通過(guò)VHH抑制vWF與膠原蛋白的結(jié)合用含25|ig/mlIII型膠原蛋白的PBS4'C下包被微量滴定板過(guò)夜。應(yīng)用PBS-吐溫沖洗培養(yǎng)板5次，用含有1%酪蛋白的PBS室溫下封閉2小時(shí)。PBS-吐溫漂洗平板5次。將100[d濃度為2|ig/ml的vWF(vWF于37。C預(yù)溫育15分鐘)與20^含有VHH抗體(如實(shí)施例6所述)的胞質(zhì)提取物混合，在微量滴定板培養(yǎng)孔中室溫下溫育90分鐘。用PBS-吐溫沖洗平板5次。用PBS將抗-vWF-HRP單克隆抗體(DAKO)稀釋3,000-倍并溫育1小時(shí)。用PBS-吐溫沖洗平板5次，用ABTS/H202進(jìn)行vWTF-結(jié)合的檢測(cè)。30分鐘后405nm波長(zhǎng)下進(jìn)行信號(hào)的測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3，顯示經(jīng)過(guò)第一輪和第二輪淘洗后獲得的抑制劑。實(shí)施例6:VHH的表達(dá)及純化制備抑制與III型膠原蛋白相互作用的vWF的結(jié)合物的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到WK6電穿孔細(xì)胞。選取單個(gè)集落，用于起始在含有2X葡萄糖及100嗎/ml氨芐青霉素的LB中培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜培養(yǎng)物用含有100嗎/ml氨芐青霉素的300mlTB培養(yǎng)液稀釋100倍，并在37"C條件下進(jìn)行溫育直到OD600nm二0.5。加入lmMIPTG，37。C溫育培養(yǎng)物3個(gè)多小時(shí)或28。C過(guò)夜。培養(yǎng)物于10000rpm4'C離心20分鐘。在-20'C條件下冰凍沉淀過(guò)夜或1小時(shí)。然后，室溫下解凍沉淀40分鐘，用20mlPBS再懸沉淀，冰上振蕩1小時(shí)。通過(guò)4。C，20000rpm離心20分鐘分離胞質(zhì)級(jí)分。將含VHH的上清液上樣到Ni-NTA進(jìn)行純化至同質(zhì)。根據(jù)消光系數(shù)計(jì)算VHH產(chǎn)量。結(jié)果歸納于表4。實(shí)施例7:ELISA:vWF結(jié)合試驗(yàn)用2pg/mlvWF包被微量滴定板，4力C過(guò)夜。用300pl含有1%酪蛋白的PBS室溫下封閉微量滴定板2小時(shí)。用PBS-吐溫沖洗滴定板3次。所有純化樣品的系列稀釋物在室溫下溫育2小時(shí)。用PBS-吐溫沖洗滴定板6次，然后檢測(cè)VHH結(jié)合，方法是與用PBS1/2000稀釋的小鼠抗-mycmAB室溫溫育1小時(shí)，再用PBS1/1000稀釋的抗小鼠-HRP結(jié)合物室溫下再溫育1小時(shí)。用底物ABTS/H202進(jìn)行染色，30分鐘后在405nm波長(zhǎng)檢測(cè)信號(hào)。作為純化的VHH濃度的函數(shù)的結(jié)合力見(jiàn)圖3所示。實(shí)施例8:VHHs的特異性用2嗎/mlvWF和其它3種不參與血小板聚集但還在美洲駝002中免疫的抗原包被微量滴定板。根據(jù)實(shí)施例7所述方法采用670，67及6.7nMVHH進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。結(jié)果簡(jiǎn)要總結(jié)于表5。該結(jié)果顯示VHH具有特異性抑制vWP的作用。實(shí)施例9:應(yīng)用純化的VHH的抑制ELISA試驗(yàn)根據(jù)實(shí)施例5所述方法進(jìn)行抑制性ELISA試驗(yàn)，不同點(diǎn)是VHH濃度遞減并采用1/60稀釋的人類血漿替代純化vWF或人類非稀釋血漿。結(jié)果見(jiàn)圖4。抑制50。/^IC50)的VHH濃度見(jiàn)表6。實(shí)施例10:克隆的測(cè)序應(yīng)用M13通用反向引物進(jìn)行克隆測(cè)序。氨基酸序列見(jiàn)表30(SEQID號(hào)1、3、4、5、6禾口7)。實(shí)施例11:表位作圖在pBAD-Oprl-ss中克隆vWF的A3結(jié)構(gòu)域?qū)BAD-Oprl-strep-spec載體用于在UT5600大腸桿菌細(xì)胞表面上展示作為與Oprl的融合物的vWPA3結(jié)構(gòu)域(F-ara-14IeuB6azi-6kcYlproC14tsx-67entA403trpE38rfbDlrpsL109xyl-5mtl-1thilDompTfepC266)(Cote-Sierra等人，1998,C簡(jiǎn),221:25-34)。應(yīng)用A3for及A3backPCR引物通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增編碼vWFA3結(jié)構(gòu)域(201個(gè)氨基酸)的基因。A3for:CTGGTGCTGCAGAGGTGAAGCTTCGGAGAGGGGCTGCAGATC(SEQIDNO:68)A3back:ATCCATGCAAATCCTCTAGAATCCAGAGCACAGTTTGTGGAG(SEQIDNO:69)應(yīng)用HindIII及Xbal消化片段及載體，將其連接并轉(zhuǎn)化UT5600(=pBAD-vWFAl/pBAD-vWFA3)。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種于含有20嗎/ml鏈霉素、50卩g/ml壯觀霉素的LB瓊脂板上。在UT5600F-細(xì)胞中轉(zhuǎn)化pBAD-vWFA3質(zhì)粒并接種含有20^g/ml鏈霉素、50嗎/ml壯觀霉素的LB瓊脂平板中。將單個(gè)集落接種于含有20pg/ml鏈霉素、50嗎/ml壯觀霉素的LB培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37'C200rpm條件下生長(zhǎng)過(guò)夜。次日，應(yīng)用0.2%阿拉伯糖進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)，并在37匸150rpm條件下溫育l個(gè)多小時(shí)?？偧?xì)胞裂解液在還原性樣品緩沖液中煮沸，上樣于12XSDS-PAGE膠中，硝基纖維膜轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western印跡。轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)應(yīng)用抗-OprI單克隆抗體(SH2.2)(CoteSierra等人，1998，221:25-34)檢測(cè)。采用綴合堿性磷酸酶的抗小鼠IgG(Sigma)，印跡釆用BCIP/NBT進(jìn)行顯影(圖5)。將pBAD-vWFA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化UT5600F-細(xì)胞并接種于含有20嗎/ml鏈霉素、50嗎/ml壯觀霉素的LB瓊脂平板中。將單個(gè)集落接種于含有20(ig/ml鏈霉素、5C^g/ml壯觀霉素的LB培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37X:200rpm條件下生長(zhǎng)過(guò)夜。次日，應(yīng)用0.2°/。阿拉伯糖進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)，并在37'C150rpm條件下溫育1個(gè)多小時(shí)。應(yīng)用PBS1/1000稀釋的抗-OprI單克隆抗體(SH2.2)4。C包被微量滴定板過(guò)夜，并在室溫下用含有1X酪蛋白的PBS封閉2小時(shí)。誘導(dǎo)后，室溫下使所有細(xì)胞與該滴定板結(jié)合1小時(shí)。用PBS-吐溫沖洗滴定板5次。室溫下使單個(gè)集落的噬菌體制品結(jié)合2小時(shí)。用PBS-吐溫沖洗滴定板5次?？筂13-HRP綴合物用于檢測(cè)結(jié)合表達(dá)A3結(jié)構(gòu)域的大腸桿菌細(xì)胞或它們表面上無(wú)關(guān)抗原的噬菌體。應(yīng)用PBS-吐溫沖洗滴定板5次。采用ABTS/H202進(jìn)行染色，30分鐘后在405nm檢測(cè)信號(hào)。結(jié)果歸納于表7。實(shí)施例12:二價(jià)和雙特異性VHH:表達(dá)及純化設(shè)計(jì)了大腸桿菌生成載體pAXll(圖6),其可以兩步克隆二價(jià)或雙特異性VHH。應(yīng)用Pstl和BstEII首先克隆VHH羧基端，第二步通過(guò)Sfil和Notl插入其它VHH，其在第一基因片段中不切割。該程序避免了通過(guò)擴(kuò)增所致新位點(diǎn)的產(chǎn)生，因此避免了插入性PCR錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)。序列見(jiàn)表30(SEQID號(hào)8、9、10、11和12)。根據(jù)實(shí)施例6所述方法進(jìn)行蛋白的表達(dá)和純化。需要在superdex75上進(jìn)行額外的純化步驟以去除某些單價(jià)降解產(chǎn)物(5-10%)。每升大腸桿菌中表達(dá)和純化的二價(jià)蛋白的產(chǎn)量歸納于表8。實(shí)施例13:vWF結(jié)合的ELISA檢測(cè)應(yīng)用實(shí)施例7所述的方法在ELISA中進(jìn)行vWF結(jié)合的檢測(cè)，并與單價(jià)VHH的結(jié)合進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)圖7。結(jié)果明顯顯示二價(jià)和雙特異性VHH與單價(jià)VHH相比顯示對(duì)vWF的結(jié)合能力更強(qiáng)。實(shí)施例14:純化VHH的抑制性ELISA根據(jù)實(shí)施例5中所述的方法，與二價(jià)VHHs相比，檢測(cè)單價(jià)VHH對(duì)vWF與膠原蛋白結(jié)合的抑制。應(yīng)用1/60稀釋的人、狒狒和豬血漿替代純化的vWF進(jìn)行平行試驗(yàn)。IC50值歸納于表9。實(shí)施例15:二價(jià)或雙特異性構(gòu)建體在人血漿中的穩(wěn)定性通過(guò)37t:條件下在人類血漿中溫育來(lái)檢測(cè)二價(jià)構(gòu)建體的穩(wěn)定性。將濃度為38嗎/ml的AM-4-15-3/AM2-75在人類血漿中于37。C溫育。溫育后1、2、3、6和24小時(shí)移除樣品。將樣品稀釋10倍，進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果歸納于圖8，顯示二價(jià)構(gòu)建體在人類血漿中37"C下至少保持24小時(shí)的穩(wěn)定性。實(shí)施例16:評(píng)估高切應(yīng)力條件下VHH的抑制作用應(yīng)用chromosulfuricacid(2。/。三氧化鉻)溶液清洗玻璃蓋玻片(18x18mm,MenzelG但ser)過(guò)夜，在噴灑前用蒸餾水沖洗。III型膠原蛋白單體溶于50mmol/L乙酸中,用retouchingairbmsh(Badgermodel100,BadgerBrushGo)以30pg/cn^的密度向玻璃蓋玻片上進(jìn)行噴灑。噴灑程序后，用含有1%人清蛋白的PBS(10mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4,和0.15mol/LNaCl)封閉該膠原蛋白表面1小時(shí)，以防止在后續(xù)灌注過(guò)程中結(jié)合非特異性蛋白質(zhì)。在特殊設(shè)計(jì)的小型平行板灌注腔內(nèi)進(jìn)行m型膠原蛋白的灌注研究，該灌注腔具有很好設(shè)計(jì)的流變學(xué)特征，能容納一張玻璃蓋玻片。通過(guò)靜脈穿刺方法獲取志愿者全血。在Harvard輸注泵(泵22,型號(hào)2400-004;哈佛大學(xué),Natick,MA)的作用下血液流經(jīng)灌注腔。灌注時(shí)間為5分鐘。將三重蓋玻片插入灌注腔內(nèi)。5ml全血37。C預(yù)熱5分鐘，加入或不加VHH，然后在5分鐘內(nèi)使血液重新流過(guò)灌注腔，壁面切變率(wallshearrate)為300s'1或1600s"。去除并沖洗蓋玻片，0.05%戊二醛固定，甲醇脫水，May-Griinwald/Giemsa染色。通過(guò)連接到計(jì)算機(jī)圖像分析儀(AMS40-10,SaffronWalden,UK)的光學(xué)顯未鏡(放大倍數(shù)，1，000x)進(jìn)行血小板粘附的定量分析。血小板粘附用表面血小板覆蓋百分比表示。結(jié)果歸納于表10和表11。抑制與血小板相互作用的vWF結(jié)合物的選擇(圖9)。實(shí)施例17:抑制與血小板相互作用的vWF結(jié)合物的選擇:淘洗用2嗎/mlvWF或含有1%酪蛋白的PBS包被免疫管。4'C溫育過(guò)夜后，用含有1%酪蛋白的PBS室溫封閉管3小時(shí)。將200W噬菌體加入免疫管中，在PBS中終體積為2ml。室溫溫育2小時(shí)后，用PBS-吐溫和PBS沖洗免疫管各10次。用2ml0.2MpH=2.4的甘氨酸緩沖液洗脫結(jié)合的噬菌體。在室溫下洗脫20分鐘。用洗脫噬菌體感染指數(shù)生長(zhǎng)的TG1細(xì)胞，然后將細(xì)胞鋪到含有100嗎/ml氨芐青霉素和2X葡萄糖的LB瓊脂平板中。淘洗結(jié)果見(jiàn)表12。實(shí)施例18:與vWF的Al結(jié)構(gòu)域結(jié)合的篩選將pBAD-Oprl-strep-spec載體用于在UT5600大腸桿菌細(xì)胞表面上展示作為與Oprl融合物的vWFAl結(jié)構(gòu)域(F-am-14leuB6azi-6IacYlproC14tsx-67entA403trpE38ribDlrpsL109xyl-5mtl-lthilDompTfepC266)(Cote-Sierra等人，1998,G麼,221:25-34)。應(yīng)用Alfor和AlbackPCR引物通過(guò)PCR進(jìn)行vWFAl結(jié)構(gòu)域(219個(gè)氨基酸)編碼基因的擴(kuò)增。Alfor:CCGGTGAGCCCCACCACTCTAAGCTTGGAGGACATCTCGGAACCG(SEQIDNO:70)Alback:CCCCAGGGTCGAAACCCTCTAGAGCCCCGGGCCCACAGTGAG(SEQIDNO:71)應(yīng)用HindIII和Xbal消化片段和載體，連接并轉(zhuǎn)化UT5600(=pBAD-vWFAl/pBAD-vWFA3)。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪到含有20pg/ml鏈霉素、50嗎/ml壯觀霉素的LB瓊脂平板中。將pBAD-vWTFAl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化UT5600F-細(xì)胞，將其鋪于含有20pg/ml鏈霉素、50pg/ml壯觀霉素的LB瓊脂平板中。挑選單集落接種于含有20pg/ml鏈霉素、50pg/ml壯觀霉素的LB培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37°C、200rpm條件下生長(zhǎng)過(guò)夜。次日，應(yīng)用0.2%阿拉伯糖誘導(dǎo)細(xì)胞，37'C、150rpm溫育1個(gè)多小時(shí)。將總細(xì)胞裂解物在還原性樣品緩沖液中煮沸，上樣于12%SDS-PAGE膠中，轉(zhuǎn)移到硝基纖維膜，進(jìn)行Western印跡。轉(zhuǎn)移蛋白用抗-OprI單克隆抗體(SH2.2)(Cote-Sierra等人，1998,Ge"e，221:25-34)檢測(cè)。施用綴合堿性磷酸酶的抗小鼠IgG(Sigma)，印跡用BCIP/NBTas顯影，結(jié)果見(jiàn)圖10。根據(jù)實(shí)施例11所述方法進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。結(jié)果歸納于表13。結(jié)果表明得到了vWF-Al結(jié)構(gòu)域特異性VHH。實(shí)施例19:抑制與血小板相互作用的vWF結(jié)合物的選擇MATCHM表達(dá)vWFAl結(jié)構(gòu)域的大腸桿菌細(xì)胞(實(shí)施例18)用于MATCHM試驗(yàn)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有pBAD-Oprl-Al的UT5600細(xì)胞，并用0.2%阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)。沖洗細(xì)胞，在常溫下將細(xì)胞與噬菌體一起溫育1小時(shí)。用PBS-吐溫沖洗混合物7次，用指數(shù)生長(zhǎng)的TG1細(xì)胞洗脫噬菌體。我們進(jìn)行了第一輪和第二輪篩選。結(jié)果歸納于表14。實(shí)施例20:ELISA:純化的VHH與vWF的結(jié)合采用實(shí)施例6所述方法進(jìn)行vWFAl結(jié)構(gòu)域特異性VHH的表達(dá)和純化。采用實(shí)施例7所述方法進(jìn)行ELISA中與vWF的結(jié)合的檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖11。實(shí)施例21:純化的VHH的抑制ELISA4。C條件下用在PBS中的5嗎/ml血小板受體gplb的特異抗體包被微量滴定板過(guò)夜。PBS-吐溫沖洗滴定板5次，用30(^1PBS-l。/。酪蛋白室溫下封閉2小時(shí)。PBS-吐溫沖洗滴定板3次。將濃度為lpg/ml的血小板受體gplb(gplb)施加到微量滴定板的孔中，室溫結(jié)合2小時(shí)。PBS-吐溫沖洗滴定板5次。加入遞減濃度的VHH(A38(陰性對(duì)照)及A50(vWFAl結(jié)合物))。在37'C條件下預(yù)溫1/128稀釋的含vWF的血漿5分鐘。加入終濃度為76(Hig/ml的利托菌素(Risto)并加至VHH。室溫下將此混合物溫育30分鐘。然后將100nl該混合物加到微量滴定板孔中，并在室溫下溫育90分鐘。PBS-吐溫沖洗滴定板5次。在PBS中將抗vWF-HRP單克隆抗體稀釋3000倍，溫育1小時(shí)。用PBS-吐溫沖洗滴定板5次，并用ABTS/H202檢測(cè)vWF—結(jié)合。30分鐘后在405nm波長(zhǎng)檢測(cè)信號(hào)。結(jié)果歸納于圖12。實(shí)施例22:克隆的測(cè)序應(yīng)用M13通用反向引物進(jìn)行克隆測(cè)序。氨基酸序列見(jiàn)表30(SEQID號(hào)碼23、24、25、26、27、28、29、30禾卩31)。實(shí)施例23:評(píng)估高切應(yīng)力條件下VHH的抑制作用按照實(shí)施例16所述方法進(jìn)行切應(yīng)力實(shí)驗(yàn)。血小板粘附被表示為血小板覆蓋表面的百分比。結(jié)果歸納于表15和表16。實(shí)施例24:二價(jià)VHHs:表達(dá)及純化根據(jù)實(shí)施例12所述的方法構(gòu)建二價(jià)分子。序列見(jiàn)表30(SEQID號(hào)碼32、33和34)。根據(jù)實(shí)施例6所述方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化。需要在superdex75上進(jìn)行額外的純化步驟以去除一些單價(jià)降解產(chǎn)物(5-10%)。實(shí)施例25:評(píng)估高切應(yīng)力條件下VHH的抑制作用根據(jù)實(shí)施例16所述方法進(jìn)行切應(yīng)力實(shí)驗(yàn)。將血小板粘附表示為血小板覆蓋的表面百分比。結(jié)果歸納于表17和表18。制備vWF特異性VHH的雙特異性構(gòu)建體(圖13)實(shí)施例26:雙特異性構(gòu)建體的構(gòu)建和序列根據(jù)實(shí)施例12所述方法制備構(gòu)建體，其中一個(gè)vWF特異性的VHH，抑制與膠原蛋白的相互作用，另一個(gè)VHH同樣對(duì)vWF特異性但抑制與血小板受體gplb相互作用序列見(jiàn)表30(SEQID號(hào)碼20、21和22)。實(shí)施例27:雙特異性構(gòu)建體的表達(dá)及純化根據(jù)實(shí)施例6所述方法表達(dá)和純化蛋白質(zhì)。需要在superdex75上進(jìn)行額外的純化步驟以去除一些單價(jià)降解產(chǎn)物(5-10%)。每升大腸桿菌中雙特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)及純化產(chǎn)量歸納于表19。實(shí)施例28:與vWF結(jié)合根據(jù)實(shí)施例7所述方法在ELISA中檢測(cè)與vWP的結(jié)合。結(jié)果見(jiàn)圖14。實(shí)施例29:與單價(jià)VHHs相比，雙特異性構(gòu)建體對(duì)vWF與膠原蛋白結(jié)合的抑制根據(jù)實(shí)施例5所述方法，與雙特異性構(gòu)建體相比，檢測(cè)單價(jià)構(gòu)建體對(duì)vWF與膠原蛋白結(jié)合的抑制。IC50值歸納于表20。實(shí)施例30:評(píng)估高切應(yīng)力條件下VHH的抑制根據(jù)實(shí)施例16所述方法進(jìn)行切應(yīng)力實(shí)驗(yàn)。將血小板粘附表示為覆蓋血小板的表面積百分比。結(jié)果歸納于表21和22。I型和ni型膠原蛋白結(jié)合物的篩選(圖15)實(shí)施例31:I型膠原蛋白結(jié)合物的選擇應(yīng)用25|_ig/mll型膠原蛋白包被微量滴定板。根據(jù)實(shí)施例3所述方法制備噬菌體，使其與封閉的微量滴定板孔結(jié)合2小時(shí)。經(jīng)過(guò)沖洗后，用pH-4.5的O.IM甘氨酸緩沖液洗脫噬菌體。結(jié)果歸納于表23。實(shí)施例32:在ELISA中檢測(cè)VHH與I型和III型膠原蛋白的結(jié)合根據(jù)實(shí)施例7所述方法，但在用溶解于PBS中的25pg/ml的I型或III型膠原蛋白包被的孔中檢測(cè)在ELISA中的結(jié)合克隆。結(jié)果歸納于表24。實(shí)施例33:克隆的測(cè)序應(yīng)用M13通用反向引物進(jìn)行克隆測(cè)序。氨基酸序列見(jiàn)表30(SEQID號(hào)碼35、36和37)。實(shí)施例34:純化的VHH與I型和m型膠原蛋白的結(jié)合根據(jù)實(shí)施例6所述方法，表達(dá)和純化VHH。用25pg/mll型或in型膠原蛋白包被微量滴定板并將其封閉。2倍稀釋結(jié)合物，根據(jù)實(shí)施例7所述方法檢測(cè)結(jié)合。結(jié)果歸納于圖16。實(shí)施例35:抑制與vWF相互作用的I型膠原蛋白結(jié)合物的選擇用25pg/mll型膠原蛋白包被微量滴定板。根據(jù)實(shí)施例3所述的方法制備噬菌體，使其與封閉的微量滴定板上的孔結(jié)合2小時(shí)。經(jīng)過(guò)沖洗后，應(yīng)用300嗎/mlvWF洗脫噬菌體。采用同樣方法進(jìn)行第2輪和第3輪篩選。實(shí)施例36:在ELISA中檢測(cè)VHH與I型和III型膠原蛋白的結(jié)合根據(jù)實(shí)施例34所述方法在ELISA中檢測(cè)克隆與I型和III型膠原蛋白的么士A^口n。實(shí)施例37:克隆的測(cè)序應(yīng)用M13通用反向引物進(jìn)行克隆的測(cè)序。實(shí)施例38:純化的VHH與I型和III型膠原蛋白的結(jié)合根據(jù)實(shí)施例6所述方法表達(dá)和純化VHH。用25|ig/mlI型或III型膠原蛋白包被微量滴定板并進(jìn)行封閉。2倍稀釋結(jié)合物，根據(jù)實(shí)施例34所述方法進(jìn)行結(jié)合的檢測(cè)。實(shí)施例39:在ELISA中檢測(cè)膠原蛋白特異性VHH對(duì)vWF與膠原蛋白結(jié)合的抑制根據(jù)實(shí)施例5所述方法檢測(cè)抑制作用。實(shí)施例40:檢測(cè)低切應(yīng)力及高切應(yīng)力條件下膠原蛋白特異性VHH對(duì)血小板聚集的抑制根據(jù)實(shí)施例16所述方法進(jìn)行切應(yīng)力實(shí)驗(yàn)。將血小板粘附表示為覆蓋血小板的表面百分比。改良的VHH半衰期實(shí)施例41:免疫美洲駝?dòng)萌搜迩宓鞍?HSA)對(duì)一只美洲駝進(jìn)行免疫。免疫方案歸納于表25。實(shí)施例42:所有組成成分的克隆根據(jù)實(shí)施例2所述方法制備文庫(kù)。文庫(kù)大小為2xl07cfU，所有克隆均含有正確大小的插入片段。實(shí)施例43:文庫(kù)拯救，噬菌體制備根據(jù)實(shí)施例3所述方法制備噬菌體。實(shí)施例44:噬菌體ELISA在4。C條件下，應(yīng)用PBS-l。/。酪蛋白或5嗎/mlHSA(人血清清蛋白)包被微量滴定板(Maxisorp)過(guò)夜。用PBS-吐溫(0.05%吐溫20)沖洗滴定板3次，并在室溫條件下，甩200^ilPBS-l^酪蛋白封閉2小時(shí)。PBS-吐溫沖洗滴定板5次。根據(jù)上述方法制備噬菌體，以連續(xù)2倍稀釋濃度加到孔中。PBS-吐溫沖洗滴定板5次。采用1/2000PBS稀釋的綴合辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的小鼠抗M13單克隆抗體檢測(cè)結(jié)合的噬菌體。PBS-吐溫沖洗滴定板5次。用ABTS/H202進(jìn)行染色，30分鐘后在405nm波長(zhǎng)檢測(cè)信號(hào)。結(jié)果見(jiàn)圖17，表明文庫(kù)中存在HSA-特異性nanobody。實(shí)施例45:篩選:第1輪和第2輪生物淘洗應(yīng)用10(ig/ml小鼠血清清蛋白(MSA)或含有1X酪蛋白的PBS包被微量滴定板孔。4"溫育過(guò)夜后，用含1X酪蛋白的PBS室溫封閉孔3小時(shí)。向孔中加入200)il噬菌體。室溫下溫育2小時(shí)后，將孔用PBS-吐溫和PBS沖洗10次。用10(^10.2MpH2.4的甘氨酸緩沖液洗脫已結(jié)合的噬菌體。室溫條件下洗脫20分鐘。將洗脫得到的噬菌體感染指數(shù)生長(zhǎng)的大腸桿菌TG1細(xì)胞，然后將其鋪于含100)ng/ml氨芐青霉素和2X葡萄糖的LB瓊脂平板中。在上述相同條件下進(jìn)行第2輪。結(jié)果歸納于表26。實(shí)施例46:生物淘洗后單個(gè)克隆的篩選ELISA:與人血清清蛋白(HSA)及小鼠血清清蛋白nV[SA)的結(jié)合根據(jù)實(shí)施例6所述的方法制備周質(zhì)提取物。用5pig/mlHSA、5pg/ml小鼠血清清蛋白(MSA)或PBS-P/。酪蛋白包被微量滴定板4"C過(guò)夜。室溫下用300|ilPBS-in/。酪蛋白封閉滴定板2小時(shí)。用PBS-吐溫沖洗滴定板3次。經(jīng)過(guò)第1輪和第2輪篩選后從23個(gè)單個(gè)克隆中制備周質(zhì)級(jí)分，使其與滴定板孔結(jié)合。用PBS-吐溫沖洗滴定板6次，然后檢測(cè)nanobody的結(jié)合，方法是通過(guò)室溫下與PBS稀釋的小鼠抗組氨酸單克隆抗體SerotecMCA1396(1/1000稀釋)溫育1小時(shí)后，再與PBS稀釋的抗小鼠堿性磷酸酶綴合物(1/2000稀釋)同樣室溫溫育1小時(shí)。用底物PNPP(2mg/mlp-硝苯基磷酸鹽溶于1M二乙醇胺、lmMMg2S04，pH9.8)進(jìn)行染色，30分鐘后在405nm波長(zhǎng)檢測(cè)信號(hào)。結(jié)果歸納于表27。實(shí)施例47:Hinfl圖譜及測(cè)序第2輪淘洗后，采用與載體序列結(jié)合的一套引物進(jìn)行陽(yáng)性克隆PCR反應(yīng)。應(yīng)用限制性酶Hinfl酶切PCR產(chǎn)物，并上樣于瓊脂糖凝膠上。篩選4個(gè)具有不同HinfI圖譜的克隆進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。對(duì)那些克隆進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果歸納于表30(SEQID號(hào)16、17、18和19)。實(shí)施例48:檢測(cè)不同物種中與清蛋白的交叉反應(yīng)性對(duì)不同物種(狒狒、豬、倉(cāng)鼠、人、大鼠、小鼠和兔)的血漿(1/10稀釋)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并印跡于硝基纖維膜上。如實(shí)施例3所述制備MSA21、MSA24、MSA210、MSA212克隆和非相關(guān)nanobody的噬菌體。使噬菌體與印跡有血清清蛋白的硝基纖維素膜結(jié)合，洗脫未結(jié)合噬菌體。應(yīng)用偶聯(lián)HRP的抗M13多克隆抗體檢測(cè)結(jié)合。DAP用作檢測(cè)底物。結(jié)果見(jiàn)圖18。由這些結(jié)果我們可以得出結(jié)論，所有4種結(jié)合物在豬、人、小鼠(對(duì)MSA212交叉反應(yīng)較小)和倉(cāng)鼠血清清蛋白間均具有交叉反應(yīng)。MSA21也與兔血清清蛋白具有交叉反應(yīng)。非相關(guān)nanobody未發(fā)現(xiàn)結(jié)合(未顯示)。作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，對(duì)用PBS進(jìn)行1/100稀釋的不同血漿樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。應(yīng)用考馬斯藍(lán)染色凝膠。由圖19我們可以得出結(jié)論除兔血漿清蛋白的水平較低外，其它所有血漿樣品中清蛋白水平均較高。實(shí)施例49:表達(dá)及純化根據(jù)實(shí)施例6所述方法表達(dá)和純化蛋白質(zhì)。實(shí)施例50:純化的nanobodies在MSA上的ELISA用5嗎/mlMSA包被微量滴定板4'C過(guò)夜。沖洗后，用PBS-P/。酪蛋白室溫封閉滴定板2小時(shí)。成對(duì)加入樣品，起始濃度為2500nM，以l/3稀釋，使樣品室溫結(jié)合2小時(shí)。加入1/1000稀釋的多克隆兔抗nanobody血清(K208)室溫下1小時(shí)。用1/1000稀釋的抗兔堿性磷酸酶綴合物進(jìn)行檢測(cè)，用PNPP染色。結(jié)果見(jiàn)圖20。實(shí)施例51:雙特異性構(gòu)建體的構(gòu)建與序列用對(duì)清蛋白特異性的第一VHH(MSA21)和對(duì)vWF特異性的第二VHH制備雙特異性構(gòu)建體(圖21)。如實(shí)施例12所述方法制備構(gòu)建體。序列見(jiàn)表30所示(SEQID號(hào)13、14和15)。實(shí)施例52:雙特異性構(gòu)建體的表達(dá)與純化根據(jù)實(shí)施例6所述方法表達(dá)和純化蛋白質(zhì)。需要在superdex75上進(jìn)行額外的純化步驟以去除一些單價(jià)降解產(chǎn)物(5-10%)。實(shí)施例53:雙特異性構(gòu)建體中兩種VHH的功能性用5pg/ml小鼠血清清蛋白4"C包被微量滴定板過(guò)夜。沖洗滴定板后，用PBS-P/。酪蛋白封閉滴定板孔2小時(shí)。使雙特異性蛋白與滴定板孔在室溫下結(jié)合2小時(shí)。沖洗后，加入不同稀釋度的人、狗和豬血漿，使其在室溫下結(jié)合2小時(shí)。用1/3000稀釋的來(lái)自DAKO的抗vWF-HRP檢測(cè)vWF的結(jié)合。用ABTS/H202染色。結(jié)果如圖22所示，表明雙特異性構(gòu)建體保留了兩種VHH的功能性。實(shí)施例54:與單價(jià)VHHs相比，雙特異性構(gòu)建體對(duì)vWF與膠原蛋白結(jié)合的抑制根據(jù)實(shí)施例5所述方法，與雙特異性構(gòu)建體相比，.檢測(cè)單價(jià)VHH對(duì)vWF與膠原蛋白結(jié)合的抑制。IC50值歸納于表28。結(jié)果表明雙特異性構(gòu)建體保留了VHH的抑制特性。抑制與vWF相互作用的gpIb結(jié)合物的選擇(圖23)根據(jù)實(shí)施例l、2和3所述方法進(jìn)行免疫、所有組成成分的克隆和噬菌體制備。實(shí)施例55:rgplb結(jié)合物的選擇用抗rgplb的小鼠mAb包被微滴定板。封閉該板，使5pg/mlrgplb室溫下結(jié)合2小時(shí)。沖洗該板。如上所述制備噬菌體并使其與微滴定板孔結(jié)合。沖洗后，用0.1MpH4.5甘氨酸緩沖液洗脫噬菌體。同樣方式進(jìn)行第二輪淘洗。實(shí)施例56:在ELISA中篩選結(jié)合物根據(jù)實(shí)施例6所述方法制備胞質(zhì)提取物。如實(shí)施例55所述，將上清加到包被有mAb和隨后的gplb的滴定板孔內(nèi)。系列稀釋的所有純化樣品在室溫下溫育2小時(shí)。用PBS-吐溫沖洗6次滴定板，然后檢測(cè)VHH的結(jié)合，方法是與在PBS中1/2000稀釋的小鼠抗His-HRPmAB室溫溫育1小時(shí)后用底物ABTS/H202染色。30分鐘后在405nm檢測(cè)信號(hào)。實(shí)施例57:純化的VHH與i'gpIb的結(jié)合如實(shí)施例6所述方法制備胞質(zhì)級(jí)分。將含VHH的上清加到Ni-NTA上以純化成均質(zhì)。VHH產(chǎn)量根據(jù)消光系數(shù)計(jì)算。根據(jù)實(shí)施例55所述方法進(jìn)行ELISA。實(shí)施例58:克隆的測(cè)序應(yīng)用M13通用反向引物進(jìn)行克隆測(cè)序。實(shí)施例59:檢測(cè)gplb特異性VHH的抑制性能如實(shí)施例21所述方法，在ELISA中檢測(cè)VHHs的抑制功能。實(shí)施例60:評(píng)估高切應(yīng)力下VHH的抑制作用根據(jù)實(shí)施例16所述方法進(jìn)行切應(yīng)力實(shí)驗(yàn)。將血小板粘附表示為覆蓋血小板的表面的百分比。應(yīng)用VHH包被斯坦特印模、套管、氣囊、導(dǎo)管和移植材料實(shí)施例61:VHH的穩(wěn)定性VHHC37在37'C溫育，如實(shí)施例7所述通過(guò)ELISA測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)其對(duì)vWF與膠原蛋白結(jié)合的抑制作用。結(jié)果與儲(chǔ)存于-20'C的VHH進(jìn)行比較，見(jiàn)圖24。進(jìn)行比較的是抗B3抗原的scFv的活性(Reiter等人，ProteinEngineering,1994，7:697-704)，該scFv發(fā)生了修飾，在框架殘基44和105之間插入了一個(gè)二硫鍵以增加其穩(wěn)定性(dsFv)。37。C溫育60小時(shí)后dsFv損失了其40%活性。37'C溫育1年后，分析C37抑制性能并與儲(chǔ)存于冷藏機(jī)中的C37進(jìn)行比較。根據(jù)實(shí)施例5所述方法，用1/200最終稀釋的人血漿進(jìn)行ELISA。結(jié)果見(jiàn)圖25所示，表明該功能性得以完全保留(儲(chǔ)存在37'C和-2(TC的C37的IC50值分別是0.085和0.1嗎/ml)。因此預(yù)計(jì)VHH具有長(zhǎng)的半衰期。實(shí)施例62:VHH固定于聚合物上制備0.5ml30°/。丙烯酰胺；1ml1MTrispH=7.5;3.5mlH20;35pl10%APS;3.5plTEMED的混合物。在一些孔中，加入VHHC37，終濃度為10嗎/ml。使混合物在96孔板內(nèi)室溫聚合3小時(shí)。加入不同稀釋度的人血漿，起始濃度為未稀釋的血漿。室溫溫育1小時(shí)，沖洗該板，加入1/2000稀釋的抗vWF-HRP(DAKO)，室溫溫育1小時(shí)。沖洗該板后，加入底物(ABTS/H202)并在OD405nm處檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖26所示。結(jié)果表明固定在聚合物上的VHH保留功能性。C37人源化實(shí)施例63:進(jìn)行C37與DP-47的比對(duì)比較C37nanobody(SEQID1號(hào))和人VH3種系(DP-47)發(fā)現(xiàn)二者高度同源oFR1中1、5、28和30位4個(gè)氨基酸改變oFR3中74、75、84和94位4個(gè)氨基酸改變oFR4中104、108和111位3個(gè)氨基酸改變見(jiàn)圖27所示。實(shí)施例64:C37的誘變根據(jù)Chen禾卩Ruffner所述(Chen禾口Ruffner，AmpiificationofclosedcircularDNAinvitro，NucleicAddsResearch,1998，1126—1127)禾卩由Stratagene所商業(yè)化的(Quickchangesite-directedmutagenesis)，應(yīng)用不是以PCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)誘變方法對(duì)C37進(jìn)行突變。用質(zhì)粒DNA作為模板，用兩個(gè)突變引物(表29)引入所需突變。兩引物每個(gè)與模板質(zhì)粒DNA的相反鏈互補(bǔ)。在應(yīng)用p>DNA多聚酶進(jìn)行的聚合酶反應(yīng)中，每一鏈在循環(huán)過(guò)程中通過(guò)有限數(shù)量的循環(huán)從引物序列延伸。產(chǎn)生野生鏈和突變鏈的混合物。用D;"/酶切來(lái)篩選體外合成的突變DNA。沉淀DNA，使之轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過(guò)序列分析來(lái)分析所需突變。將正確序列的克隆命名為C37-hum，氨基酸序列見(jiàn)表30SEQID2號(hào)。根據(jù)實(shí)施例6所述方法表達(dá)和純化C37-hum。如實(shí)施例5所述，比較C37和C37-hum對(duì)vWF和膠原蛋白結(jié)合的抑制作用。結(jié)果見(jiàn)圖28。其清晰表明人源化的C37完全保留功能。需要人源化的位點(diǎn)是Ql、Q5、D104、Q108和I111。我們可以對(duì)1和5位進(jìn)行人源化而無(wú)損其抑制功能，因?yàn)檫@些氨基酸通過(guò)FR1引物引入，而不存在于天然美洲駝序列中。我們也可人源化111位，因?yàn)槲覀兎蛛x出了除1111V外與C37等同的VHH(AM-2-75SEQID3號(hào))，仍具有同樣的功能(實(shí)施例9和表6)。108位在CamelidVHH中是溶劑暴露的，但在人類抗體中該位點(diǎn)隱藏于VH-VL界面(Spinelli，1996;Nieba，1997)。在分離的VH中，108位是溶劑暴露的。引入非極性疏水Leu而不是極性不帶電Gln對(duì)分子固有的可折疊性/穩(wěn)定性有重大影響?？筕WPVHHs的片段實(shí)施例65:vWF-C37的VHH-CDR3片段的表達(dá)通過(guò)使用位于框架4區(qū)中的正義引物(正向CCCCTGGTCCCAGTTCCCTC)(SEQIDNO:72)禾tH立于豐匡架3區(qū)中的反義弓l物(反向TGTGCTCGCGGGGCCGGTAC)(SEQIDNO:73)對(duì)C37的CDR3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。為了將CDR3片段克隆到pAX10中，用以下引入所需限制位點(diǎn)的引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增反向引物Sfil:C(SEQIDNO:74)正向引物Notl:GTCCTCGCAACTGCGCGGCCGCCCCCTGGTCCCAGTTCCCTC(SEQIDNO:75)用50pmo1每種引物在50ml反應(yīng)體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)。初級(jí)PCR反應(yīng)條件為94°C11分鐘，然后是在94/55/72°C30/60/120秒，循環(huán)30次，最后是72°C5分鐘。所有反應(yīng)體系含2.5mMMgCl2，200mMdNTP和1.25UAmpliTaqGodDNA多聚酶(RocheDiagnostics,Brussels,Belgium)。用Sfil和Notl切開(kāi)后將PCR產(chǎn)物克隆到pAXlO中。構(gòu)象特異性抗vWPVHHs的分離實(shí)施例66:通過(guò)第一和第二輪生物淘洗進(jìn)行重組體Al(rAl)的選擇用5pg/ml重組vWFAl結(jié)構(gòu)域(rAl)或含1%酪蛋白的PBS包被微量滴定板的孔。4'C溫育過(guò)夜后，用含1。/。酪蛋白的PBS室溫封閉滴定板孔3小時(shí)。將20(Hd噬菌體加到滴定板孔內(nèi)。室溫溫育2小時(shí)后，滴定板孔用PBS-吐溫和PBS各沖洗10次。用lOOpil0.2MpH2.4甘氨酸緩沖液洗脫已結(jié)合的噬菌體。室溫條件下洗脫20分鐘。將洗脫得到的噬菌體感染指數(shù)生長(zhǎng)的大腸桿菌TG1細(xì)胞，然后將其鋪于含100pg/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖的LB瓊脂平板中。如上所述在相同條件下進(jìn)行第2輪，但將噬菌體重懸于10嗎/mlvWF。用10)ig/mlvWF沖洗滴定板孔7次，時(shí)間30分鐘。結(jié)果歸納于表31。實(shí)施例67:生物淘洗后進(jìn)行單個(gè)克隆的篩選ELISA:與rAl和vWF結(jié)合將單個(gè)集落用于起始在含2%葡萄糖和100ng/nil氨卞青霉素的LB中培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜培養(yǎng)物用含100pg/ml氨卞青霉素的TB培養(yǎng)基稀釋100倍，在37°C條件下進(jìn)行溫育直到OD600nm=0.5。加入lmMIPTG，培養(yǎng)物37t:溫育3個(gè)多小時(shí)或28。C過(guò)夜。將培養(yǎng)物于10,000rpm4。C離心20分鐘。沉淀冰凍過(guò)夜或在-2(TC條件下放置1小時(shí)。然后，室溫下解凍沉淀40分鐘，用PBS再懸沉淀，冰上振蕩1小時(shí)。通過(guò)在4°C20,000rpm離心20分鐘分離胞質(zhì)級(jí)分。用含VHH的上清液作進(jìn)一步分析。用2嗎/mlrAl或l嗎/mlvWF包被微量滴定板，4'C過(guò)夜。用SOOpl含有1%酪蛋白的PBS室溫下封閉微量滴定板2小時(shí)。PBS-吐溫沖洗滴定板3次。經(jīng)過(guò)第二輪篩選后，對(duì)于192個(gè)獨(dú)立克隆制備胞質(zhì)級(jí)分，使之與滴定板孔結(jié)合。用PBS-吐溫沖洗滴定板6次，然后檢測(cè)nanobody的結(jié)合，方法是與PBS中的兔多克隆抗-nanobody抗體(1/2000稀釋)室溫溫育1小時(shí)，再用PBS中1/2000稀釋的山羊抗兔-HRP綴合物室溫下溫育1小時(shí)。用底物ABTS/H202進(jìn)行染色，30分鐘后在405nm檢測(cè)信號(hào)。結(jié)果歸納于表32。我們得出結(jié)論50個(gè)克隆與rAl而非vWF結(jié)合。實(shí)施例68:Hinfl圖譜及測(cè)序第二輪淘洗后，用一套結(jié)合載體序列的引物對(duì)rAl陽(yáng)性克隆和vWF陰性克隆進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物用限制性酶Hinfl酶切，上樣于瓊脂糖凝膠。選擇30個(gè)具有不同Hinfl圖譜的克隆作進(jìn)一步評(píng)估。那些克隆用實(shí)施例67所述ELISA進(jìn)行更細(xì)致的檢測(cè)。30個(gè)克隆中有4個(gè)顯示明顯對(duì)于rAl比對(duì)于vWF更高的親和力。該數(shù)據(jù)見(jiàn)圖29(結(jié)合rAl)和30(結(jié)合vWF)所示。對(duì)這些克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果歸納于表30(SEQID62到65號(hào))。實(shí)施例69:抑制性ELISA通過(guò)ELISA確定nanobody對(duì)vWF與gplb結(jié)合的抑制作用。用5pg/ml在PBS中的對(duì)血小板受體gplb特異性抗體4。C過(guò)夜包被滴定板。PBS-吐溫沖洗滴定板5次，用300(ilPBS-l^酪蛋白室溫下封閉2小時(shí)。PBS-吐溫沖洗滴定板3次。將1/2稀釋的血漿加到滴定板孔內(nèi)，使之在37。C結(jié)合1.5小時(shí)。PBS-吐溫沖洗滴定板5次。加入遞減濃度的VHH。含vWF的血漿以1/50稀釋，在37。C預(yù)溫5分鐘。將終濃度為lmg/ml的利托菌素加到VHH中。在37。C溫育該混合物1小時(shí)。然后將5(^1該混合物加到滴定板孔內(nèi)，37"溫育90分鐘。PBS-吐溫沖洗滴定板5次。將抗vWF—HRP單克隆抗體用PBS稀釋3000倍，溫育1小時(shí)。PBS-吐溫沖洗滴定板5次，用ABTS/H202檢測(cè)vWP的結(jié)合。30分鐘后在405nm測(cè)量信號(hào)。圖圖1.參與血小板聚集的第一步驟的相互作用。圖2.參與血小板聚集的第一步驟的相互作用。VHH被表示抑制vWF與膠原蛋白之間的相互作用。圖3.如實(shí)施例7所述用純化的VHH，通過(guò)ELISA確定與vWF的結(jié)合。圖4.如實(shí)施例9所述用ELISA檢測(cè)VHH對(duì)vWF與膠原蛋白結(jié)合的抑制作用。圖5.如實(shí)施例11所述，Western印跡顯示vWFA3結(jié)構(gòu)域作為與Oprl的融合物表達(dá)于大腸桿菌表面。圖6.用于構(gòu)建二價(jià)或雙特異性nanobody的PAX011多克隆位點(diǎn)的限制性圖譜。圖7.如實(shí)施例13所述，ELISA中單價(jià)相對(duì)二價(jià)和雙特異性VHH與純化vWF的結(jié)合狀況。圖8.如實(shí)施例15所述，雙特異性VHH在人血漿中37'C溫育高達(dá)24小的穩(wěn)定性。圖9.參與血小板聚集的第一步驟的相互作用。VHH被表示抑制vWF與血小板之間的相互作用。融合物表達(dá)于大腸桿菌表面。圖11.如實(shí)施例20所述，用純化的VHH，通過(guò)ELISA確定與vWF的結(jié)合狀況。圖12.實(shí)施例21所述，A50和A38(陰性對(duì)照)對(duì)gplb與vWF結(jié)合的抑制作用。圖13.參與血小板聚集的第一步驟的相互作用。雙特異性構(gòu)建體中的一個(gè)VHH為vWF特異性并抑制vWF與膠原蛋白之間的相互作用，另一個(gè)VHH為vWF特異性但抑制vWF與血小板之間的相互。圖14.如實(shí)施例28所述，在ELISA中對(duì)vWF的結(jié)合。圖15.參與血小板聚集的第一歩驟的相互作用。VHH被表示為膠原蛋白特異性，抑制vWF與膠原蛋白之間的相互作用。圖16.如實(shí)施例34所述，在ELISA中純化的VHH與I型和III型膠原蛋白結(jié)合狀況。圖17.如實(shí)施例44所述，表明文庫(kù)中存在HSA特異性nanobody的噬菌體ELISA。圖18.如實(shí)施例48所述，表達(dá)清蛋白結(jié)合物的噬菌體與印跡到硝酸纖維素膜上的血漿的結(jié)合狀況。圖19.如實(shí)施例48所述，SDS-PAGE上血漿樣品的考馬斯染色。圖20.如實(shí)施例50所述，通過(guò)ELISA確定純化的nanobody與小鼠清蛋白結(jié)合狀況。圖21.如實(shí)施例51所述，用于改善半衰期的雙特異性構(gòu)建體，所述雙特異抗體的一個(gè)VHH結(jié)合清蛋白，第二個(gè)VHH結(jié)合vWF。圖22.如實(shí)施例53所述，三明治ELISA表明雙特異性構(gòu)建體中兩種VHH的功能性。圖23.參與血小板聚集的第一步驟的相互作用。將VHH表示為gpIb特異性并抑制vWF與血小板之間的相互作用。圖24.儲(chǔ)存于-2(TC的C37與37。C溫育高達(dá)194小時(shí)的C37殘留活性的比較。如實(shí)施例61所述，C37穩(wěn)定性與B3抗原特異性scFv的穩(wěn)定性和穩(wěn)定形式dsFv(通過(guò)2個(gè)二硫鍵穩(wěn)定)的穩(wěn)定性比較。圖25.如實(shí)施例61所述，儲(chǔ)存于-2(TC的C37與在37"C溫育一年的C37抑制活性比較。圖26.如實(shí)施例62所述，人血漿vWF與固定于丙烯酰胺上的C37結(jié)合狀況。圖27.如實(shí)施例63所述，C37與人種系序列DP-47氨基酸比對(duì)。圖28.如實(shí)施例64所述，通過(guò)ELISA確定C37和C37-hum對(duì)vWF與膠原蛋白結(jié)合的抑制作用。圖29.ELISA測(cè)量的All、A12、A13、A14、A15和A16克隆與rAl結(jié)合狀況。圖30.ELISA測(cè)量的All、A12、A13、A14、A15和A16克隆與vWF結(jié)合狀況。表表1.根據(jù)實(shí)施例1免疫美洲駝002的方案。表2.如實(shí)施例4所述，與PBS-酪蛋白相比，一或兩輪淘洗后vWF蝕斑形成單位(pfu)。PfuvWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特異性結(jié)合)=豐度。表3.如實(shí)施例5所述，一或兩輪淘洗后抑制劑數(shù)目與檢測(cè)克隆數(shù)目比值。表4.如實(shí)施例6所述，生長(zhǎng)于WK6大腸桿菌細(xì)胞的VHH表達(dá)和純化后的產(chǎn)量(mg/升培養(yǎng)物)。表5.依照實(shí)施例8，ELISA中VHH與vWF和美洲駝002免疫的3種抗原結(jié)合的OD405nm值。表6.如實(shí)施例9所述，抑制vWF與膠原蛋白結(jié)合達(dá)50。/。(IC50)所需的VHH的濃度(nM)。表7.如實(shí)施例ll所述，結(jié)合vWF并抑制其與膠原蛋白相互作用的VHH表位作圖。表8.如實(shí)施例12所述，每升培養(yǎng)物中二價(jià)和雙特異性VHHs純化蛋白產(chǎn)量(mg)。表9.單價(jià)與二價(jià)和雙特異性VHHs的IC50值比較。如實(shí)施例14所述，用人、豬和狒狒血漿檢測(cè)抑制狀況。表IO.如實(shí)施例16所述，高切應(yīng)力狀態(tài)下(1600s")血小板聚集的抑制狀況。表11.如實(shí)施例16所述，低切應(yīng)力狀態(tài)下(300s")血小板聚集的抑制狀況。表12.如實(shí)施例17所述，經(jīng)過(guò)一輪淘洗后vWF蝕斑形成單位(pfu)。PfovWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特異性結(jié)合)-豐度。表13.如實(shí)施例18所述，結(jié)合vWF和vWFAl結(jié)構(gòu)域的單個(gè)克隆的ELISA篩選結(jié)果。表14.如實(shí)施例19所述，一輪MATCHM后pBAD-Oprl-Al細(xì)胞上的結(jié)果。表15.如實(shí)施例23所述，高切應(yīng)力狀態(tài)下(1600s力血小板聚集的抑制狀況。表16.如實(shí)施例23所述，低切應(yīng)力狀態(tài)下(300s力血小板聚集的抑制狀況。表17.如實(shí)施例25所述，高切應(yīng)力狀態(tài)下(1600s、血小板聚集的抑制狀況。表18.如實(shí)施例25所述，低切應(yīng)力狀態(tài)下(300s")血小板聚集的抑制狀況。表19.如實(shí)施例27所述，雙特異性構(gòu)建體表達(dá)和純化后的產(chǎn)量。表20.如實(shí)施例29所述，vWFAl和A3結(jié)構(gòu)域的雙特異性nanobody的IC50值。表21.如實(shí)施例30所述，高切應(yīng)力狀態(tài)下(1600s")血小板聚集的抑制狀況。表22.如實(shí)施例30所述，低切應(yīng)力狀態(tài)下(300s力血小板聚集的抑制狀況。表23.如實(shí)施例31所述，經(jīng)過(guò)一輪淘洗后I型膠原蛋白蝕斑形成單位(pfU)。PfuvWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特異性結(jié)合)=豐度。表24.如實(shí)施例32所述，經(jīng)過(guò)一輪選擇后結(jié)合I型和ni型膠原蛋白的克隆數(shù)。表25.根據(jù)實(shí)施例41人血清清蛋白免疫方案。表26.如實(shí)施例45所述，經(jīng)過(guò)一輪和二輪淘洗后小鼠血清清蛋白的結(jié)果。表27.經(jīng)過(guò)一輪和二輪篩選后選擇克隆并制備周質(zhì)提取物。如實(shí)施例46所述，在ELISA中分析這些克隆與人和小鼠清蛋白結(jié)合狀況。表28.如實(shí)施例54所述，抗清蛋白和抗vWF的雙特異性nanobody的IC50值。表29.如實(shí)施例64所述用于C37人源化的引物序列。表30.本發(fā)明肽和人馮維勒布蘭德因子(vWF)的氨基酸序列表。人vWF序列分別用粗體字母表示Al和A3結(jié)構(gòu)域。表31.如實(shí)施例66所述，經(jīng)過(guò)兩輪淘洗后對(duì)vWFrAl結(jié)構(gòu)域的結(jié)果。表32.如實(shí)施例67所述，所選克隆與rAl和vWF結(jié)合的ELISA分析。表l:依照實(shí)施例1美洲駝002免疫接種方案<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表2:如實(shí)施例4所述，與PBS-酪蛋白相比，一或兩輪淘洗后vWF蝕斑形成單位(pfu)。PfuvWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特異性結(jié)合)=豐度。<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表3:如實(shí)施例5所述，經(jīng)過(guò)第1輪和第2輪淘洗后，抑制劑數(shù)目與檢測(cè)克隆數(shù)目比值。<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表4:如實(shí)施例6所述，生長(zhǎng)于WK6大腸桿菌細(xì)胞的VHH表達(dá)和純化后的產(chǎn)量(mg/升培養(yǎng)物)。<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>表5:依照實(shí)施例8，ELISA中VHH與vWF和美洲駝002免疫的3種抗原結(jié)合的OD405訓(xùn)值。<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>表6:如實(shí)施例9所述，抑制vWF與膠原蛋白結(jié)合達(dá)50n/。(IC50)所需的VHH的濃度(nM)。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>表7:如實(shí)施例ll所述，結(jié)合vWF并抑制其與膠原蛋白相互作用的VHH表位作圖<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>表12:如實(shí)施例17所述，經(jīng)過(guò)一輪淘洗vWF的蝕斑形成單位(pfu)。PfovWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特異性結(jié)合)=豐度<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>表13:如實(shí)施例18所述，在ELISA中篩選個(gè)體克隆結(jié)合vWF和vWFAl結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>表14:如實(shí)施例19所述，一輪MATCHM后pBAD-Oprl-Al細(xì)胞的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>表15:如實(shí)施例23所述，在高切應(yīng)力狀態(tài)下(1600s")血小板聚集的抑制狀況<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>表16:如實(shí)施例23所述，在低切應(yīng)力狀態(tài)下(300s")血小板聚集的抑制狀況<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>表17:如實(shí)施例25所述，在高切應(yīng)力狀態(tài)下(1600s")血小板聚集的抑制狀況<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表18:如實(shí)施例25所述，在低切應(yīng)力狀態(tài)下(300s")血小板聚集的抑制狀況<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表19:如實(shí)施例27所述，雙特異性構(gòu)建體表達(dá)和純化后的產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>表24:如實(shí)施例32所述，經(jīng)過(guò)一輪選擇結(jié)合I型和III型膠原蛋白的克隆數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>表25:根據(jù)實(shí)施例41人血清清蛋白的免疫方案<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>表26:如實(shí)施例45所述，經(jīng)過(guò)一輪和二輪淘洗后小鼠血清清蛋白上的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>表27:經(jīng)過(guò)一輪和二輪篩選后選擇克隆并制備周質(zhì)提取物。如實(shí)施例46所述，在ELISA中分析這些克隆與人和小鼠清蛋白結(jié)合狀況<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>200810170807.4說(shuō)明書(shū)第92/140頁(yè)jIRYDAAQIiRILASPAGDSNVVJCdQRIEDriPTMVTIjGNSFLHKLCSGFVRICMDEDGKEKRPGDVWTLPDQCHTVTCQPDGQTLLKSHRVKCDRGLRPSCPNSQSPVKVEETCGCRWTCPCVCTGSSTRHIVTFDGQNFKLTGSCSYVLFQKTKEQDIiE!V工LiHNGACSPGARQGCMKSIEVKHSALSVEliHSDMEVTVNGRLVSVPyVGGNMEVNVYGAIMHEVRFKHIjGinFTFTPQNWEFQLiQLSPKTFASKTYGLCGICDENGANDFMLRDGTVITDWKTLVQEWTVQRPGQTCQPILiEEQCIjVPDSSHCQVLKLPLFAECHKVLAPATFYAICQQDSCHQEQVCEV工ASYAHLCRTNGVCVDWRTPDFCAMSCPPSLVYNHCEHGCTRHCDGNVSSCGDHPSEGCFOTPDKVMIjEGSCVPEEACTQC工GEDGVQHQFLSAWVPDHQPCQ工CTCLSGRiCVNCTTQPCPTAKAPTCGIiCEVARLRQNADQCCPEYECVCOTVSCDLPPVPHCERGLQPTIiTNPGECRPNFTCACRKEECKRVSPPSCPPHRLPTIjRKrQCCDEYECACNCVNSTVSCPLGYLASTATHDCGCTTTTCIiPDKVCVHRSITYPVGQFWEEGCDVCTCTDMEDAVMGIiRVaLQCSQKPCEDSCRSGFTYVLHEGECCGRCIiPSACEWTGSPRGDSQSSWKSVGSQWASPENPCL工NECVRVKEEVF工QQRNVSCiPQLEVPVCPSGFQLSCKTSACCPSCRCERMEACMLNGTVTGPGKTVMIDVCTTCRCMVQVGVISGFKLECRKTTCHPCPLGYkEENNTGECCGiRCLPTACriQIjRGGQIMTLKRDETLQDGCDTHFCKVHERGEYFWEKRVTGCPPPDEHKCLAEGGKIMKIPGTCCDTCEEPECNDITARLQYVKVGSCKSEVEVDIHYCQGKCASKAMYS工D工N__DVQDQCSCCSPTOTEPMQVALHCmGSWYHEVUJAMECKCSPIlKCSK表31:如實(shí)施例66所述經(jīng)過(guò)兩輪淘洗vWFi.Al上的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>表32:如實(shí)施例67所述所選克隆與rAl和vWF結(jié)合的ELISA分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>序列表<110〉埃博靈克斯股份有限公司<120>治療性多肽，其同源物，其片段和其用于調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集〈130〉A(chǔ)BL-005-PCT3<140>PCT/BE2004/000002<141〉2004-01-09<150>EP03447005.4<151>2003-01-10〈150>PCT/EP03/06581<151>2003-06-23<150>PCT/EP03/07313<151>2003-07-08<150>PCT/BE03/00193<151>2003-11-07<150>PCT/BE03/0(U89<151〉2003-11-07〈150〉PCT/BE03/00190<151〉2003-11-07<150〉PCT/BE03/00192〈151〉2003-11-07<150〉PCT/BE03/00194<151〉2003-11-07<150>PCT/BE03/00206〈151〉2003-12—01<150〉PCT/鵬3/00191〈151〉2003-12-02<160〉85〈170〉Pa"tentTnversion3.1<210〉1<211>121<213〉美洲鴕(Lamaglama)〈1GinValGinLeuGln15SerLeuArgLeuSer20ProMetSerTrpVal35Ser丁hrlieSerThr50GlyArgPheThrlie65GinMetAsnSerLeuS5ArgG1yAlaG1yThriobGinGlyThrGinVal115〈210〉2<211>121<212>PR丁(213〉美洲鴕(Lamaglama)<400>2GinValGinLeuGinGluSerGlyGWG1yLeuValGinProGlvG1y151015GluSerGlvGlyGlvLeuValGinProGlvGly1015CysAlaAlaSerGlvPheAsnPheAsnTrpTvr2530ArgGinAlaProGlvLysGl、'LeuGluTrpVal4045TvtG1yGluProArgTvrAlaAspSerValLvs5560'SerArgAspAsnAlaAsnAsn丁hrLeuTyrLeu7075'80紅gProGluAspThrAlaValTvtTvrCvsAla909bSerSerTyrLeuProGinArgG1yAsnTrpAsp105110ThrlieSerSer<formula>formulaseeoriginaldocumentpage98</formula><212>PRT<213〉美洲駝(Laraaglama)<柳〉4GlnValGln1LeuGlnA印SerGlyGlvGlvLeuValGlnAlaGlvGlv51015SerLeuArgLeuSerC、'sAlaAlaSerValArgliePheThrSerT、'r202530AlaMetGlvTrpPheArgGinAlaProGl、'LvsGluArgGluPheVal354045AlaAlalieAsnArgSerGlvLvsSerThrTvrTvrSerAspSerVal505560GluGlvArgPheThrlieSerArgAspAsnAlaUsAsnThrValSer65707580LeuGinMetAspSerLeuU'sLeuGluAspThrAlaValT、'rTvrC、rs85909^AlaAlaAspTyrSerGlvSerTvrThrSerLeuTrpSerArgProGlulbO105110ArgLeuAspTrpGlvGinGlvThrGlnValThrValPheSer115120125<210〉5<211>124<212>PRT<213〉美洲駝(L咖aglama)<400>5GlnValGlnLeuValGluSer15GlvGlvGlvLeuVal10GlnAlaG1yGlv15SerLeuArgLeuSerCvsAlaAlaSerGlyAr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lvProHisAlaAsnLeuUsGinlieArgLeulie141514201425GluLvsGinAlaProGluAsnLvsAlaPheValLeuSerSerVallhO14351440AspGluLeuGluGinGinArgAspGlulieValSerTyrLeuCys144514501455AspLeuAlaProGluAlaProProProThrLeuProProHisMet146014651470AlaGinValThrValGlyProGlvUuArgAsnSerMetValLeu147514801485AspValAlaPheValLeuGluGlySerAspLvslieGlvGluAla149014951500AspPheAsnArgSerLvsGluPheMetGluGluVallieGinArg150515101515MetAspValGlvGinAspSerlieHisValThrValLeuGinTvr152015251530SerTvrMetValThrValGluTvrProPheSerGluAlaGinSer辻3515401545LysGlvAsplieLeuGinArgValArgGlulieArgTvrGinGlv15^015551560GlvAsnArgThrAsnThrGlvLeuAlaLeuAi-gTvrLeuSerAsp156515^01575HisSerPheLeuValSerGinGWAspArgGluGinMaProAsn158015851590LeuValT、'rMetValThrGlvAsnProAlaSerAspGlulieLvs159516b01605ArgLeuProGlvA印lieGinValValProlieGlvValGlvPro1610161516^)AsnAlaAsnValGinGluLeuGluArglieGl、'TrpProAsnAla162516301635ProlieUulieGinAspPheGluThrLeuProArgGluAlaPro164016451650AspLeuValLeuGinArgC、'sCvsSerGlvGluGl、'LeuGinlie16551^60ProThrLeuSerProAlaProAspC、'sSerGinPro!>euAspVal167016751680lieLeuLeuLeuAspGl、'Sei-SerSerPheProAlaSerTyi—Phe168516901695AspGuMetLysSerPheAlaLysAlaPhelieSerLvsAlaAsn170017051710lieGlvProArgLeuThrGinValSerValLeuGinTyrGlySer17.1517201725lieThrThrlieAspValProTrpAsnValValProGluLvsAla173017351740HisLeuLeuSerLeuValAspValMetGinArgGluGlyGlvPro174517501755SerGinlieGlvAspAlaLeuGlvPheAlaValArgTvrLeuThr176017651770SerGluMetHisGlvAlaArgProGl、'AlaSerLrsAlaValVal177517801^85lieLeuValThrAspValSerValAspSerValA印AlaAlaAla179017951800AspAlaAlaArgSerAsnArgValThrValPheProlieGlylie180518101815GlyAspArgT、'rAspAlaAlaGinLeuArglieLeuAlaGlvPro182018251830AlaGlvAspSerAsnValValLvsLeuGinArglieGluAspLeu18^1840'1845ProThrMetValThrLeuGlvAsnSerPheLeuHisLvsLeuC\'s18501860SerGlyPheValArglieCvsMetAspGluAspGlvAsnGluUsl&O18^5ArgProGlvAspValTrpThrLeuProAspGinCysHisThrVall咖1885ThrCysGinProAspGlvGinThrLeuUuLySSerHisArgVal化9519001905AsnOsAspArgGlvLeuArgProSerOsProAsnSerG，SerlblO19151920ProValLvsValGluGluThrCysGlvCvsArgTrpThrCysPro192519301935CvsValCysThrGlvSerSerThrArgHislieValThrPheAsp194019451950GlvGinAsnPheLvsLeuThrGlvSerCvsSerTvrValLeuPhe19551960lb65GinAsnLvsGluGinAspLeuGluVallieLeuHisAsnGlvAla1970'19751980CvsSerProGlyAlaArgGinGlyCysMetUsSer工leGluVal198519901995t/srsHisSerAlaLeuSerValGluLeuHisSerAspMetGluVal200020052010ThrValAsnGlvArgLeuValSerValProTyrValGlyGlyAsn201520202025MetGluValAsnValTyrGlvAlalieMetHisGluValArgPhe20302040AsnHisLeuGlvHisliePheThrPheThrProGinAsnAsnGlu204520502055PheGinLeuGinLeuSerProLysThrPheAlaSerLysThrTvr206020652070GlvLeuCysG1ylieCvsAspGluAsnGlyAlaAsnAspPheMet207520802085LeuArgAspGlyThrValThrThrAspTrpLysThrLeuValGin209020952100GluTrpThrValGinArgProGlvGinThrCysGinProlieLeu210521102115GluGluGinCysLeuValProAspSerSerHisCvsGinValUu212021252.130LeuLeuProLeuPheAlaGluCysHisLysValLeuAlaProAla213521402145ThrPheTyrAlalieCysGinGinAspSerCvsHisGinGluGin215021552160ValCvsGluVallieAlaSerTvrAlaHisLeuCysArgThrAsn2'16521702'175GIyValCvsValAspTrpArgThrProAspPheCysAlaMetSer218021852i90CysProProSerLeuValTyrAsnHisCvsGluHisGlyCysPro'21952S002205''ArgHisCysAspGlvAsnValSerSerCvsGlvAspHisProSer2210''22152220GltiGlyCvsPheCvsProPtoAspUsValMetGluGlvSer225522302235CysValProGluGluAlaCvsThrGinOslieGlvGluAspGlv22402^522^0ValGinHisGinPheLeuGluAlaTrpValProAspHisGinPro225522602265CvsGinlieCvsThrCysLeuSerGlvArgUsValAsnCvsThr227022752280ThrGinProCysProThrAlaLysAlaProThrCvsGlyLeuCys228522902295GluValAlaArgLeuArgGinAsnAlaAspGinCysCvsProGlu230023052^10TvrGluCysValCysAspProValSerCysAspLeuProProVal231523202325ProHisCysGluArgGlyLeuGinProThrLeuThrAsnProGIy233023352340GluCysArgProAsnPheThrCysAlaCysArgUsGluG)uCys2iM523502555LysArgValSerProProSerCysProProHisArgLeuProThr'236023652370LeuArgUsThrGinCysCvsAspGluTyrGluCvsAlaCysAsn23752^802^385CysValAsnSerThrValSerCysProLeuGlvTvrLeuAlaSer'23902395ThrAlaThrAsnAspCysGIyCvsThrThrThrThrCysLeuPro240524.102415<formula>formulaseeoriginaldocumentpage142</formula>GIvThrCysCvsAspThrOsGluGluProGluCysAsnAsplie27052h02^15ThrAlaArgLeuGinTvrValLysValGlySerOsLvsSerGlu272027252730ValGluValA印lieHisTyrCvsGinGlyLysCysAlaSerL、's27352h02^45AlaMetTyrSerlieAsplieAsnAspValGinAspGinCysSer2750'27552760'CvsCvsSerProThrArgThrGluProMetGinValAlaLeuHis2)6527702775C、'sThrAsnGlvSerValValTyrHisGluValLeuAsnAlaMet278027852790GluCysL、'sCvsSerProArgLvsCvsSerLvs2^952800<210〉49<211>128<212>PRT〈213〉美洲鴕(Laraaglaraa)<400>49AlaValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGnAla1510GlyAsp15SerLeuArgLeuSerOsValValSerGlyThrThrPheSerSerAla202530AlaMetGlvTrpPheArgGinAlaProGlvLysGluArgGluPheVal354045GlyAlalieLysTrpSerGlyThrSerThrTyrTvrThrAspSerVal50556bLvsG1yAi'gPheThrlieSerArgAspAsnValLvsAsnThrValTvt'70758J3LeuGinMetAsnAsnLeul/ysProGluAspThrGlvValTyrThrCys85'90''95'AlaAlaAspArgAspArgTvrArgAspArgMetGlvProMetThrThr100105110ThrA印PheArgPheTrpGlvGinGlvThrGinValThrValSerSer115120125<210>50權(quán)利要求1.一種多肽或多肽構(gòu)建體，其包括a)至少一種針對(duì)馮德勒布蘭德因子(vWF)的單結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體對(duì)應(yīng)于由SEQIDNO1-7中任一個(gè)所代表的序列，或?qū)?yīng)于i.SEQIDNO1-7中任一個(gè)的同源序列，所述同源序列具有與親本序列高于70％的序列同一性；或ii.SEQIDNO1-7中任一個(gè)的功能部分，所述功能部分保持與靶目標(biāo)相互作用的親和力為1×10-6M或更高；或iii.SEQIDNO1-7中任一個(gè)的功能部分，所述功能部分包括完整氨基酸序列的部分缺失，并仍然保持與所述靶目標(biāo)結(jié)合和相互作用所必需的結(jié)合位點(diǎn)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；b)和至少一種針對(duì)血清清蛋白(SA)的單結(jié)構(gòu)域抗體，其中，所述至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體對(duì)應(yīng)于由SEQIDNO16-19中任一個(gè)所代表的序列，或?qū)?yīng)于i.SEQIDNO16-19中任一個(gè)的同源序列，所述同源序列具有與親本序列多于70％的序列同一性。2.按照權(quán)利要求1的多肽或多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體是VHH結(jié)構(gòu)域。3.按照權(quán)利要求1或2的多肽或多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體是VHH結(jié)構(gòu)域，按照Kabat編號(hào)，所述VHH結(jié)構(gòu)域在第45位包括選自由下列各項(xiàng)組成的組中的一個(gè)氨基酸甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。4.按照權(quán)利要求1-3的多肽或多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體是VHH結(jié)構(gòu)域，按照Kabat編號(hào)，所述VHH結(jié)構(gòu)域在第103位包括選自由下列各項(xiàng)組成的組中的一個(gè)氨基酸精氨酸、絲氨酸或不帶電殘基，任選地甘氨酸。5.按照權(quán)利要求l-4的多肽或多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體是通過(guò)下列方法獲得的VHH結(jié)構(gòu)域，所述方法是免疫駱駝并從中獲得雜交瘤，或克隆單結(jié)構(gòu)域抗體文庫(kù)并隨后利用噬菌體展示選擇所述VHH。6.按照權(quán)利要求1-5的多肽或多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體是人源化的。7.按照權(quán)利要求l-6的多肽或多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體是人源化的VHH結(jié)構(gòu)域。8.按照權(quán)利要求1-7的多肽或多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體是通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)縣#^￥氨基酸置換為在人類共有序列中發(fā)現(xiàn)的它們的人類相對(duì)應(yīng)物而被人源化的。9.按照權(quán)利要求1-8的多肽或多肽構(gòu)建體，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體是通過(guò)單獨(dú)或聯(lián)合置換以下任一殘基而被人源化的，所述殘基是FR1的1、5、28和30位，F(xiàn)R2的37、44、45和47位標(biāo)志氨基酸，F(xiàn)R3的74、75、76、83、84、93和94位及FR4的103、104、108和111位，其中所述位置編號(hào)是按照Kabat編號(hào)法進(jìn)行的。10.按照權(quán)利要求1-9的多肽或多肽構(gòu)建體，其中第一單結(jié)構(gòu)域抗體的C-末端與下一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的N-末端相連接。11.組合物，其包括按照權(quán)利要求1-10的多肽或多肽構(gòu)建體和藥用載體。12.組合物，其包括按照權(quán)利要求1-10的多肽或多肽構(gòu)建體和藥用載體，所述多肽或多肽構(gòu)建體適合于選擇的給藥途徑，其中所述給藥途徑是口服或胃腸外途徑，通過(guò)吸入的鼻內(nèi)途徑、靜脈內(nèi)途徑、肌肉內(nèi)途徑、局部途徑或皮下路徑。13.編碼按照權(quán)利要求1-10的多肽或多肽構(gòu)建體的核酸。14.按照權(quán)利要求1-10的多肽或多肽構(gòu)建體在制備用于預(yù)防、治療和/或緩解血小板介導(dǎo)的聚集病癥的藥物中的應(yīng)用，其中所述病癥是非閉塞性血栓形成，閉塞性血栓形成，動(dòng)脈血栓形成，急性冠脈閉塞，再狹窄，PCTA或放置斯坦特印模后再狹窄，狹窄的動(dòng)脈內(nèi)血栓形成，血管成形術(shù)、粥樣斑切除術(shù)或動(dòng)脈斯坦特印模后的增生，血管系統(tǒng)的閉塞綜合征或患病動(dòng)脈的開(kāi)放缺陷中的任何一種。全文摘要本發(fā)明涉及治療性多肽，其同源物、其片段及其在調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集方面的應(yīng)用。具體涉及用于治療需要對(duì)血小板介導(dǎo)的聚集進(jìn)行調(diào)節(jié)的疾病并克服現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題的多肽、所述多肽的同源物和/或所述多肽的功能部分，該多肽包括針對(duì)vWF、vWFA1結(jié)構(gòu)域、活化的vWF的A1結(jié)構(gòu)域、vWFA3結(jié)構(gòu)域、gpIb和/或膠原蛋白的至少一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體。本發(fā)明另一方面是產(chǎn)生所述多肽的方法，用所述多肽包被用于醫(yī)學(xué)程序(如PCTA，放置斯坦特印模)的裝置的方法，篩選調(diào)節(jié)血小板介導(dǎo)的聚集的試劑的方法和試劑盒，以及診斷與血小板介導(dǎo)的聚集相關(guān)疾病的試劑盒。文檔編號(hào)A61P19/02GK101412759SQ20081017080公開(kāi)日2009年4月22日申請(qǐng)日期2004年1月9日優(yōu)先權(quán)日2003年1月10日發(fā)明者卡倫·西萊恩克申請(qǐng)人:埃博靈克斯股份有限公司