白細胞介素-10多肽結(jié)合物和其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及白細胞介素-10(IL-10)多肽結(jié)合物，其包含至少一個非天然編碼氨基酸。
【專利說明】白細胞介素-10多肽結(jié)合物和其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及白細胞介素-10 (interleukin-io ;IL-10)多肽結(jié)合物，其包含至少一 個非天然編碼氨基酸。

【背景技術(shù)】
[0002] 白細胞介素-10是一種細胞因子（cytokine)，其原先特征在于其抑制Thl細胞因 子產(chǎn)生的活性。參見例如，德·弗里斯（de Vries)和德?瓦爾?梅勒菲特（de Waal Malefyt) (編，1995)白細胞介素-10蘭德斯公司（Landes Co.)，德克薩斯州奧斯?。ˋustin, Tex.); 等。
[0003] 免疫功能的抑制用于許多不同情況下。參見例如保羅（Paul)(編，1995)基本免 疫學(xué)第 3 版（Fundamental Immunology 3d ed·)，雷文出版社（Raven Press),紐約（NY)。 具體來說，同種異體免疫很大程度上因其非凡力量而在移植情況下至關(guān)重要。隨著器官和 組織移植在醫(yī)學(xué)情況下變得更常見，將來自組織排斥反應(yīng)的問題減到最少的能力展現(xiàn)更大 的經(jīng)濟優(yōu)勢。另外，將自體免疫性病狀減到最少、阻斷對顆粒性抗原（例如細菌和寄生蟲） 的某些響應(yīng)和將對某些可溶性抗原（蛋白質(zhì)和過敏原兩者）的反應(yīng)減到最少的手段將表示 顯著的治療學(xué)進展。
[0004] 缺乏將組織排斥反應(yīng)、移植對宿主疾病或其它免疫響應(yīng)減到最少或消除的完全有 效治療劑導(dǎo)致許多問題。本發(fā)明闡述許多這些問題并提供其解決方案。
[0005] 盡管白細胞介素-IO(IL-IO)通常已經(jīng)被認(rèn)為是有利于腫瘤逃避免疫監(jiān)視的消 炎、免疫抑制性細胞因子，累積的跡象顯示IL-10也具有一些免疫刺激特性。實際上，IL-10 具有在不同實驗?zāi)Ｐ椭姓婧拓?fù)面地影響固有和適應(yīng)性免疫功能的多效性能力。
[0006] IL-10在身體中的血清半衰期相對較短。舉例來說，通過體外生物分析或通過敗 血性休克模型系統(tǒng)中功效所測量的小鼠中半衰期[參見史密斯（Smith)等人，細胞免疫學(xué) (Cellular Immunology) 173:207214(1996)]是約 2 到 6 小時。
[0007] 蛋白質(zhì)的聚乙二醇化可以通過延遲腎清除率來延長其血清半衰期，因為PEG部分 使蛋白質(zhì)的流體動力學(xué)半徑大量增加。然而，常規(guī)聚乙二醇化方法是針對單體蛋白質(zhì)和更 大的二硫鍵接復(fù)合物（例如單克隆抗體）。IL-10的聚乙二醇化呈現(xiàn)此項技術(shù)中已知的其 它聚乙二醇化蛋白質(zhì)未遇到的問題，因為IL-10二聚物通過非共價相互作用保持在一起。 在聚乙二醇化期間可能增加的IL-10解離將導(dǎo)致聚乙二醇化的IL-10單體（PEG-IL-10單 體）。PEG-IL-10單體不保持IL-10的生物活性。還注意到二-PEG-IL-10,亦即在IL-10的 兩個氨基酸殘基上聚乙二醇化不保持明顯體外生物活性。在保持生物活性或甚至提供生物 活性增強或調(diào)節(jié)的治療中使用一或多種IL-10多肽將是優(yōu)勢。本發(fā)明闡述這一點和此項技 術(shù)中的其它相關(guān)需要。
[0008] 癌癥和腫瘤可以受到免疫系統(tǒng)控制或根除。免疫系統(tǒng)包括若干類型的淋巴和骨 髓細胞，例如單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞（DC)、嗜酸性細胞、T細胞、B細胞和嗜中性 白細胞。這些淋巴和骨髓細胞產(chǎn)生被稱為細胞因子的分泌性信號傳導(dǎo)蛋白質(zhì)。細胞因子 包括例如白細胞介素-IO(IL-IO)、干擾素-Y(IFN. Y.)、IL-12和IL-23。免疫響應(yīng)包括 炎癥，亦即免疫細胞全身性地或在身體特定位置中的累積。響應(yīng)于感染劑或外來物質(zhì)，免 疫細胞分泌細胞因子，所述細胞因子隨后調(diào)節(jié)免疫細胞增殖、發(fā)育、分化或遷移。免疫響應(yīng) 過度可能產(chǎn)生病理性結(jié)果（例如自身免疫病癥），而免疫響應(yīng)削弱可能導(dǎo)致癌癥。免疫系 統(tǒng)的抗腫瘤響應(yīng)包括例如由巨噬細胞、NK細胞和嗜中性白細胞介導(dǎo)的固有免疫和例如由 抗原呈遞細胞（APC)、T細胞和B細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫（參見例如阿巴斯（Abbas)等人 (編）（2000)細胞和分子免疫學(xué)（Cellular and Molecular Immunology)，W.B.桑德斯公 司（W.B. Saunders Co·),賓夕法尼亞州費城（Philadelphia, Pa.);奧本海姆（Oppenheim) 和費爾德曼（Feldmann)(編）（2001)細胞因子參考文獻（Cytokine Reference),學(xué)術(shù)出版 社（Academic Press),加利福尼亞州圣地亞哥（San Diego, Calif.);馮?安德里安（von Andrian)和麥基（Mackay) (2000)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志（New Engl. J. Med. )343:1020-1034; 戴維森（Davidson)和戴蒙德（Diamond) (2001)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志345:340-350)。
[0009] 調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)的方法已經(jīng)用于治療癌癥，例如黑色素瘤。這些方法包括用細胞 因子（例如IL-2、IL-10、IL-12、腫瘤壞死因子-a (TNFa)、IFN. 、粒細胞巨噬細胞菌 落刺激因子（GM-CSF)和轉(zhuǎn)型生長因子（TGF))治療或用細胞因子拮抗劑（例如抗體）治 療。白細胞介素-10首先被描述為細胞因子合成抑制性因子（CSIF;參見例如菲奧倫蒂諾 (Fiorentino)等人（1989)實驗醫(yī)學(xué)雜志（J.Exp. Med. ) 170:2081-2095)。IL-10 是由 T 細胞、B細胞、單核細胞產(chǎn)生的多效性細胞因子，其可以充當(dāng)免疫抑制劑和免疫刺激劑兩者 (參見例如格魯士（Groux)等人（1998)免疫學(xué)雜志（J. Immunol. ) 160:3188-3193 ;和海根 保爾（Hagenbaugh)等人（1997)實驗醫(yī)學(xué)雜志 185:2101-2110)。
[0010] 共價連接親水性聚合物聚（乙二醇）（縮寫為PEG)是一種提高許多生物活性分子 (包括蛋白質(zhì)、肽，尤其是疏水性分子）的水溶性、生物利用率；延長血清半衰期；延長治療 半衰期；調(diào)節(jié)免疫原性；調(diào)節(jié)生物活性；或延長循環(huán)時間的方法。PEG已被廣泛用于醫(yī)藥品 或人工移植物以及生物相容性、無毒和無免疫原性極為重要的其它應(yīng)用中。
[0011] PEG衍生物常常是通過反應(yīng)性化學(xué)官能團（例如賴氨酸、半胱氨酸和組氨酸殘基、 N端和碳水化合物部分）與生物活性分子連接。蛋白質(zhì)和其它分子常常具有少數(shù)反應(yīng)性位 點可供聚合物連接。最適合于通過聚合物連接而修飾的位點常常在受體結(jié)合中起到重要作 用，并且是保留分子的生物活性所必需的。因此，聚合物鏈與生物學(xué)活性分子上所述反應(yīng)性 位點的任意連接常常導(dǎo)致經(jīng)聚合物修飾的分子的生物活性明顯減少或甚至全部喪失。R.克 拉克（R. Clark)等人，(1996),牛物化學(xué)雜志（T. Biol. Chem.), 271:21969-21977。為了形 成聚合物分子量足夠賦予目標(biāo)分子所需優(yōu)點的結(jié)合物，現(xiàn)有技術(shù)方法通常涉及大量聚合物 臂與分子的無規(guī)連接，由此增加母體分子的生物活性減少或甚至完全喪失的風(fēng)險。
[0012] 形成PEG衍生物與蛋白質(zhì)的連接點的反應(yīng)性位點可由蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)指示。蛋白質(zhì) (包括酶）由各種序列的α -氨基酸構(gòu)成，其具有通式結(jié)構(gòu)H2N--CHR-C00H。一個氨基酸 的α-氨基部分（H2N--)與相鄰氨基酸的羧基部分（一C00H)接合形成酰胺鍵，其可以表示 為--(NH-CHR--C0) n--，其中下標(biāo)"η"可以等于數(shù)百或數(shù)千。由R表示的片段可以含有用 于蛋白質(zhì)生物活性和連接PEG衍生物的反應(yīng)性位點。
[0013] 舉例來說，在氨基酸賴氨酸的情況下，在ε位以及α位中存在一NH2部分。ε-NH 2 在堿性pH條件下自由反應(yīng)。用PEG進行蛋白質(zhì)衍生化領(lǐng)域中的很多技術(shù)都是針對開發(fā) 用于連接蛋白質(zhì)中存在的賴氨酸殘基的ε-ΝΗ2部分的PEG衍生物。"用于先進聚乙二醇 化技術(shù)的聚乙二醇和衍生物（Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation)，'，奈克塔分子工程目錄（Nektar Molecular Engineering Catalog) ,2003， 第1-17頁。然而，這些PEG衍生物都具有共有的局限性，S卩，無法將其選擇性地安裝于蛋白 質(zhì)表面上存在的常常大量賴氨酸殘基上。在其中賴氨酸殘基對于蛋白質(zhì)活性極為重要（例 如存在于酶活性位點中）的情況下，或在其中賴氨酸殘基對于介導(dǎo)蛋白質(zhì)與其它生物分子 的相互作用起作用的情況下（如在受體結(jié)合位點的情況下），這將會成為顯著的局限性。
[0014] 現(xiàn)有蛋白質(zhì)聚乙二醇化方法的另一同等重要的難題在于，PEG衍生物可與除所需 殘基外的其它殘基發(fā)生不必要的副反應(yīng)。組氨酸含有一個反應(yīng)性亞氨基部分，結(jié)構(gòu)上表示 為--N(H)-，但許多與ε -Mis反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)性物質(zhì)也可以與--N(H)-反應(yīng)。類似地， 氨基酸半胱氨酸的側(cè)鏈帶有一個游離硫氫基，結(jié)構(gòu)上表示為-SH。在一些情況下，針對賴氨 酸ε--ΝΗ 2基團的PEG衍生物還與半胱氨酸、組氨酸或其它殘基反應(yīng)。這可以產(chǎn)生經(jīng)PEG衍 生化的生物活性分子的復(fù)雜不均勻混合物，并且有破壞作為目標(biāo)的生物活性分子活性的風(fēng) 險。需要開發(fā)出這樣的PEG衍生物，其允許在蛋白質(zhì)內(nèi)的單一位點引入化學(xué)官能團，隨后使 一或多種PEG聚合物能夠在蛋白質(zhì)表面上明確界定并可預(yù)測的特定位點處與生物活性分 子選擇性偶合。
[0015] 除賴氨酸殘基外，此項技術(shù)中還曾就開發(fā)以其它氨基酸側(cè)鏈（包括半胱氨酸、組 氨酸和N端）為目標(biāo)的經(jīng)活化PEG試劑進行了大量嘗試。參見例如以引用的方式并入本文 中的美國專利第6, 610, 281號，以及"用于先進聚乙二醇化技術(shù)的聚乙二醇和衍生物"，奈 克塔分子工程目錄，2003,第1-17頁。可以使用定點誘變和此項技術(shù)中已知的其它技術(shù)， 將半胱氨酸殘基位點選擇性地引入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，并且可使由此得到的游離硫氫基部分與 具有硫醇反應(yīng)性官能團的PEG衍生物反應(yīng)。但這種方法比較麻煩，因為引入游離硫氫基會 使所得蛋白質(zhì)的表達、折疊和穩(wěn)定性變得復(fù)雜。因此，需要具有一種將化學(xué)官能團引入生物 活性分子中的手段，其能使一或多種PEG聚合物與蛋白質(zhì)選擇性偶合，同時還與硫氫基以 及蛋白質(zhì)中常見的其它化學(xué)官能團相容（即，不會與之發(fā)生不必要的副反應(yīng)）。
[0016] 如從此項技術(shù)的抽樣中可以看出，已經(jīng)證明，已經(jīng)開發(fā)出的用于連接到蛋白質(zhì)側(cè) 鏈上，尤其賴氨酸氨基酸側(cè)鏈上的一Mis部分和半胱氨酸側(cè)鏈上的-SH部分上的許多這些 衍生物在其合成和使用中有問題。一些衍生物與蛋白質(zhì)形成不穩(wěn)定的鍵，這些鍵經(jīng)歷水解， 并因此分解、降解，或者另外在水性環(huán)境（例如血流）中不穩(wěn)定。一些衍生物形成較為穩(wěn)定 的鍵，但會在形成鍵之前經(jīng)歷水解，這意味著PEG衍生物上的反應(yīng)性基團可能會在連接蛋 白質(zhì)之前就失活。一些衍生物略帶毒性，因此不太適合于體內(nèi)使用。一些衍生物反應(yīng)過慢 而無法實際使用。一些衍生物會因連接到負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)活性的位點而導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性喪失。 一些衍生物對其將連接的位點不具特異性，這也會導(dǎo)致喪失所需活性以及缺乏結(jié)果的可再 現(xiàn)性。為克服與用聚（乙二醇）部分修飾蛋白質(zhì)相關(guān)的挑戰(zhàn)，已經(jīng)開發(fā)出更穩(wěn)定（例如，美 國專利6, 602, 498,其以引用的方式并入本文中）或與分子和表面上的硫醇部分選擇性反 應(yīng)（例如，美國專利6, 610, 281，其以引用的方式并入本文中）的PEG衍生物。
[0017] 近來，已經(jīng)報導(dǎo)了蛋白質(zhì)科學(xué)中的一種全新技術(shù)，這項技術(shù)有望克服與蛋 白質(zhì)位點特異性修飾相關(guān)的眾多局限。特定來說，已經(jīng)將新組分添加到原核類大 腸桿菌（Escherichia coli ;E. coli)(例如 L.王（L. Wang)等人，(2001),科學(xué) (Science) 292:498-500)和真核類釀酒酵母（Sacchromyces cerevisiae ;S. cerevisiae) (例如J.秦（J. Chin)等人，科學(xué)301:964-7(2003))的蛋白質(zhì)生物合成機構(gòu)中，其使 得能夠?qū)⒎腔蚓幋a氨基酸并入體內(nèi)蛋白質(zhì)中。已經(jīng)使用此方法將多種具有新穎化 學(xué)、物理或生物學(xué)特性的新氨基酸，包括光親和力分類和可光異構(gòu)化氨基酸、光交聯(lián)氨 基酸（參見例如秦，J.W. (Chin, J.W.)等人(2002)美國國家科學(xué)院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A). 99:11020-11024 ;和秦，J. W.等人，(2002)美國化學(xué)會志（了.八111· Chem. Soc.) 124:9026-9027)、酮氨基酸、含有重原子氨基酸和糖基化氨基酸有效地目. 高保真地并入大腸桿菌中和酵母中響應(yīng)于琥珀密碼子（TAG)的蛋白質(zhì)中。參見例如 J. W.秦（J. W. Chin)等人，（2002)，美國化學(xué)會志（.Tournal of the American Chemical Society) 124:9026-9027 ： T. ff.秦和 P. G.舒爾茨(P. G. Schultz), (2002),化學(xué)牛物化 學(xué)（ChemBioChem) 3 (11) :1135-1137 J.W.秦等人，(2002),美國國家科學(xué)院院刊（PNAS United States of America) 99:11020-11024 :和 L.王和 P. G.舒爾茨，(2002),化學(xué)通訊 (Chem. Comm.), 所有參考文獻的全文都以引用的方式并入本文中。
[0018] 本發(fā)明除了其它以外還闡述與IL-10多肽得活性和產(chǎn)生相關(guān)的問題，并且還闡述 生物學(xué)或藥理學(xué)特性改良（例如針對腫瘤的活性提高和/或治療半衰期改良）的IL-10多 肽的產(chǎn)生。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明涉及具有一或多個非天然編碼氨基酸的白細胞介素-10(IL-10)多肽。本 發(fā)明進一步涉及結(jié)合于水溶性聚合物上的具有一或多個非天然編碼氨基酸的IL-10多肽。
[0020] 本發(fā)明提供抑制或減少腫瘤或癌癥的方法，其包含用有效量的本發(fā)明IL-10多肽 接觸所述腫瘤。本發(fā)明提供抑制或減少腫瘤或癌癥增長的方法，其包含用有效量的本發(fā)明 聚乙二醇化IL-IO(PEG-IL-IO)多肽接觸所述腫瘤。在一個實施例中，PEG-IL-10是單聚乙 二醇化的。在一個實施例中，PEG-IL-10是雙聚乙二醇化的。在一個實施例中，PEG-IL-10具 有連接到其上的兩個（2)以上聚（乙）二醇分子。本發(fā)明的另一個實施例提供使用本發(fā)明 的PEG-IL-10多肽來調(diào)節(jié)CD8+T細胞和/或調(diào)節(jié)CD8+T細胞對腫瘤細胞的響應(yīng)的方法。在另 一個實施例中，本發(fā)明的IL-10和/或PEG-IL-10多肽調(diào)節(jié)至少一種發(fā)炎性細胞因子的表 達，所述細胞因子可以選自由以下各者組成的群組：IFN. γ、IL-4、IL-6、IL-10和RANK-配 體（RANK-L)。在某些實施例中，PEG-IL-10與至少一種化學(xué)治療劑共投與?；瘜W(xué)治療劑可 以選自由以下各者組成的群組：替莫唑胺（temozolomide)、吉西他濱（gemictabine)、多柔 比星（doxorubicin)、IFN-α。在本發(fā)明的另一個實施例中，PEG-IL-10與至少一種化學(xué) 治療劑共投與。在本發(fā)明的一個實施例中，PEG-IL-10與以下各者之一共投與：替莫唑胺 (劑量 5mg-250mg);吉西他濱（200mg-lg);多柔比星（lmg/m2-50mg/m2);干擾素 -a (lyg/ kg-300yg/kg)。在某些實施例中，腫瘤或癌癥選自由以下各者組成的群組：結(jié)腸癌、卵巢 癌、乳癌、黑色素瘤、肺癌、成膠質(zhì)細胞瘤和白血病。
[0021] 在一些實施例中，本發(fā)明提供使用經(jīng)工程改造形式的IL-10(例如聚乙二醇化 IL-10)來治療癌癥的方法。在本發(fā)明的另一個實施例中，聚乙二醇化IL-10多肽的血清半 衰期比非聚乙二醇化IL-10多肽長。在本發(fā)明的另一個實施例中，聚乙二醇化IL-10多肽 的血清半衰期比野生型IL-10多肽長。在另一個實施例中，本發(fā)明的IL-10多肽提高腫瘤 殺傷活性。在本發(fā)明的另一個實施例中，當(dāng)與非聚乙二醇化相比時，本發(fā)明的IL-10多肽增 加腫瘤位點處CD8+T細胞的數(shù)量。在本發(fā)明的另一個實施例中，當(dāng)與野生型IL-10相比時， 本發(fā)明的IL-10多肽增加腫瘤位點處CD8+T細胞的數(shù)量。動物模型表明IL-10可以劑量依 賴性方式誘導(dǎo)NK-細胞活化并且促使目標(biāo)細胞破壞（參見例如鄭（Zheng)等人（1996)實 驗醫(yī)學(xué)雜志184:579-584 ;高彥（Kundu)等人（1996)國立癌癥研究所雜志（J. Natl. Cancer Inst. )88:536-541)。進一步研究指示IL-10在腫瘤微環(huán)境中的存在與患者生存期較好相 關(guān)（參見例如盧（Lu)等人（2004)臨床腫瘤學(xué)雜志（J. Clin. Oncol. )22:4575-4583)。
[0022] 本發(fā)明還涉及一種用于治療哺乳動物中急性白血病的方法，其包含向所述哺乳動 物投與治療有效量的本發(fā)明IL-10多肽。本發(fā)明還一種用于抑制急性白血病母細胞增殖的 方法，其包含向罹患急性白血病的哺乳動物投與治療有效劑量的本發(fā)明IL-10。
[0023] 本發(fā)明還提供一種用于治療哺乳動物中急性白血病的方法，其包含向所述哺乳動 物投與治療有效量的本發(fā)明IL-10,其中所述IL-10對急性白血病母細胞的抗增殖作用在 投與白細胞介素-10停止之后仍持續(xù)。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的方法，待治療的急性白血病可能是骨髓細胞白血?。ɡ缂毙怨撬?性白血病（AML))或B細胞白血?。ɡ缂毙粤馨颓蛐园籽。ˋLL))。待投與的IL-10可 以選自由病毒白細胞介素-10和人類白細胞介素-10組成的群組。
[0025] 在本發(fā)明的一個實施例中，具有一或多個非天然編碼氨基酸的IL-10多肽結(jié)合于 細胞毒性劑上。特定來說，合適的細胞毒性劑可以是例如奧瑞他?。╝uristatin)、DNA小溝 結(jié)合劑、DNA小溝燒基化劑、烯二炔、萊希菌素（lexitropsin)、倍癌霉素（duocarmycin)、紫 杉燒（taxane)、噪呤霉素（puromycin)、海兔毒素（dolastatin)、類美登素（maytansinoid) 和長春花（vinca)生物堿。在特定實施例中，細胞毒性劑是AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、 奧瑞他汀E、紫杉醇（paclitaxel)、多烯紫杉醇（docetaxel)、CC_1065、SN-38、拓樸替 康（topotecan)、嗎琳基-多柔比星、根霉素、氛基嗎琳基 _多柔比星、海兔毒素-10、棘 霉素（echinomycin)、考布他?。╟ombretatstatin)、卡里奇霉素（chalicheamicin)、 美登素（maytansine)、DM-l或紡錘菌素（netropsin)。其它合適的細胞毒性劑包括抗 微管蛋白劑，例如奧瑞他汀、長春花生物堿、鬼臼毒素（podophyllotoxin)、紫杉燒、巴 卡亭（baccatin)衍生物、念珠藻素（cryptophysin)、類美登素、考布他汀或海兔毒素。 在特定實施例中，抗微管蛋白劑是AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、奧瑞他汀E、長春新堿 (vincristine)、長春喊（vinblastine)、長春地辛（vindesine)、長春瑞賓（vinorelbine)、 VP-16、喜樹堿（camptothecin)、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃坡霉素 A(epothilone A)、埃坡 霉素 B、諾考達唑（nocodazole)、秋水仙堿（colchicines)、秋水酰胺（colcimid)、雌莫 司?。╡stramustine)、西馬多丁（cemadotin)、迪斯德莫來（discodermolide)、美登素、 DM-1或艾榴塞洛素（eleutherobin)。結(jié)合于細胞毒性劑上的IL-10或結(jié)合于細胞毒性劑 上的PEG-IL-10可以直接結(jié)合。結(jié)合于細胞毒性劑上的IL-10或結(jié)合于細胞毒性劑上的 PEG-IL-10可以通過來自IL-10多肽的非天然編碼氨基酸中的至少一者直接結(jié)合。結(jié)合于 細胞毒性劑上的IL-10或結(jié)合于細胞毒性劑上的PEG-IL-10可以通過連接基團間接結(jié)合。 結(jié)合于細胞毒性劑上的IL-10或結(jié)合于細胞毒性劑上的PEG-IL-10可以通過可裂解連接基 團間接結(jié)合。結(jié)合于細胞毒性劑上的IL-10或結(jié)合于細胞毒性劑上的PEG-IL-10可以通過 不可裂解連接基團間接結(jié)合?？闪呀膺B接基團通常對胞內(nèi)條件下的裂解敏感。合適的可裂 解連接基團包括例如可由胞內(nèi)蛋白酶（例如溶酶體蛋白酶或內(nèi)體蛋白酶）裂解的肽連接基 團。在例示性實施例中，連接基團可以是二肽連接基團，例如纈氨酸-瓜氨酸（val-cit)或 苯丙氨酸-賴氨酸（phe-lys)連接基團。其它合適的連接基團包括可以在小于5. 5的pH 值下水解的連接基團，例如腙連接基團。其它合適的可裂解連接基團包括二硫連接基團。
[0026] 在一些實施例中，本發(fā)明的IL-10多肽用于癌癥的過繼性免疫療法。本發(fā)明還包 括包含用于過繼性免疫療法的白細胞介素-10的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明部分地基于以下發(fā) 現(xiàn)：IL_10可以預(yù)防或減少細胞因子產(chǎn)生，所述細胞因子被認(rèn)為是造成目前過繼性免疫療 法中遇到的許多有害副作用的原因。本文中所用的術(shù)語"過繼性免疫療法"意味著涉及將 對抗功能性癌癥的免疫細胞轉(zhuǎn)移到患者中的療法。優(yōu)選地，對抗癌癥的免疫細胞包含源自 患者本身的腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL)。廣義上，本發(fā)明的方法包含以下步驟：（i)在存在 IL-2和IL-10的情況下培養(yǎng)TIL，（ii)向患者投與經(jīng)培養(yǎng)的TIL，和（iii)在投與TIL之后 向患者投與IL-2和IL-10。這些化學(xué)物質(zhì)和方法描述于貝爾托齊（Bertozzi)申請案美國 公開案第20090068738號，其以全文引用的方式并入本文中。
[0027] 在本發(fā)明的一些實施例中，IL-10多肽用于抑制移植組織的排斥反應(yīng)。本發(fā)明還 包括包含白細胞介素-10的醫(yī)藥組合物。
[0028] 在一些實施例中，投與本發(fā)明的IL-10多肽抑制腫瘤誘導(dǎo)的血管生成且/或增強 腫瘤毒性分子[例如氧化氮（N0)]的產(chǎn)生，其在一或多種臨床前模型中導(dǎo)致腫瘤消退。
[0029] 本發(fā)明提供一種用于治療哺乳動物中癌癥的方法，其通過投與有效量的IL-10來 進行，所述哺乳動物例如包括（但不限于）具有以下病狀中一或多者的那些哺乳動物：結(jié)腸 癌、卵巢癌、乳癌、黑色素瘤、肺癌、成膠質(zhì)細胞瘤和白血病。
[0030] 本文中所用的白細胞介素10或IL-10被定義為滿足以下的蛋白質(zhì)：（a)氨基酸序 列實質(zhì)上與如本申請SEQ ID No: 1-4中所揭示的成熟（亦即缺少分泌性前導(dǎo)序列）IL-10 的已知序列一致并且（b)至少一種生物活性是原生IL-10中常見的。出于本發(fā)明的目的， 糖基化（例如在例如酵母或CH0細胞的真核細胞中產(chǎn)生）和未糖基化（例如以化學(xué)方式合 成或在大腸桿菌中產(chǎn)生）的IL-10是等效物并且可以互換使用。還包括突變蛋白質(zhì)和其它 類似物，包括病毒IL-10,其保持IL-10的生物活性。
[0031] 由杰弗遜（Jefferson)基梅爾癌癥中心（Ki_el Cancer Center)在 2010 ASC0 芝加哥年會呈遞的數(shù)據(jù)（摘要#8588)顯示腫瘤細胞中的白細胞介素-10產(chǎn)生可以用作用 自體黑色素瘤細胞疫苗治療的患有晚期黑色素瘤的患者中的預(yù)測因子。從黑色素瘤組織中 提取腫瘤細胞并保存以供用于疫苗生產(chǎn)。在疫苗生產(chǎn)之前，研究人員從組織中分離一小部 分黑色素瘤細胞。隨后培養(yǎng)這些小部分以用于產(chǎn)生IL-10。腫瘤樣本在用稱為二硝基苯基 (DNP)的化學(xué)品修飾之后用于自體癌細胞疫苗，所述修飾使腫瘤細胞與宿主免疫系統(tǒng)更加 無關(guān)。腫瘤細胞中的IL-10與患者接受疫苗之后的較壞預(yù)后相關(guān)，因為T細胞因腫瘤微環(huán) 境中的較高IL-10含量而下調(diào)，可能降低疫苗的有效性。因此，本發(fā)明的另一個實施例是待 在投與自體癌癥疫苗之前、同時或之后共投與的IL-10拮抗劑。
[0032] 優(yōu)選地，本發(fā)明的白細胞介素-10選自由用以下氨基酸序列界定的開放式閱讀框 的成熟多膚組成的群組：Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val Arg Ala Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala Leu Ser Glu Met lie Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Asp lie Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly lie Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp lie Phe lie Asn Tyr lie Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys lie Arg Asn(SEQ ID N0:l),and Met Glu Arg Arg Leu Val Val Thr Leu Gin Cys Leu Val Leu Leu Tyr Leu Ala Pro Glu Cys Gly Gly Thr Asp Gin Cys Asp Asn Phe Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gin Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala Leu Ser Glu Met lie Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin lie Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly lie Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp He Phe lie Asn Tyr lie Glu Ala Tyr Met Thr lie Lys Ala Arg(SEQ ID N0:2)，其中標(biāo)準(zhǔn)三字母縮寫用于從N端開始指示L-氨基酸。這兩種形式的IL-10有 時分別被稱為人類IL-10 (或人類細胞因子合成抑制性因子（"CSIF"））和病毒IL-10 (或 BCRF1)，例如穆爾（Moore)等人，科學(xué)248:1230-1234 (1990);維埃拉（Vieira)等人，國家 科學(xué)院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci)88:1172-1176(1991);菲奧倫蒂諾等人，實驗醫(yī)學(xué)雜志 170:2081-2095(1989);和許（Hsu)等人，科學(xué)250:830-832(1990)。還已經(jīng)描述馬皰疹病 毒類型2的同系物（羅（Roe)等人，病毒基因 （Virus Genes)7:lll-116(1993))。以及來 自各種物種的大量對應(yīng)物。更優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法的成熟IL-10選自由以下各者組成 的群組：Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala Leu Ser Glu Met lie Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Asp lie Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly lie Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp lie Phe lie Asn Tyr lie Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys lie Arg Asn (SEQ ID NO :3)和 Thr Asp Gin Cys Asp Asn Phe Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gin Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala Leu Ser Glu Met lie Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin lie Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly lie Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp lie Phe lie Asn Tyr lie Glu Ala Tyr Met Thr lie Lys Ala Arg(SEQ ID N0:4)〇 [0033]因此，在特定實施例中，本發(fā)明提供一種減少或抑制哺乳動物骨髓轉(zhuǎn)移中移植對 宿主疾病的方法，其包含向所述哺乳動物投與有效量的白細胞介素-10。其還提供一種抑制 免疫系統(tǒng)對后續(xù)出現(xiàn)的所述抗原的抗原特異性響應(yīng)的方法，其包含向所述免疫系統(tǒng)投與有 效量的外源性白細胞介素-10和所述抗原。在優(yōu)選實施例中，免疫響應(yīng)由巨噬細胞、APC、蘭 格漢氏細胞（langerhans cell)或樹突狀細胞介導(dǎo)；所述方法進一步抑制⑶4. sup. +宿主 反應(yīng)性T細胞克隆的增殖性響應(yīng)；或所述抑制持續(xù)至少約21天。在其它優(yōu)選實施例中，有 效量足以減少響應(yīng)者T細胞活化；或可以進一步包含降低外周血液單核細胞、樹突狀細胞、 單核細胞和/或正常B細胞的刺激能力。
[0034] 在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種實質(zhì)上純的抗原特異性無變應(yīng)性（anergic)T 細胞，其特征在于在較低IL-2 ;較低IL-4 ;較低IL-5 ;中間物IFN- γ ;較低GM-CSF ;和較高 IL-10再刺激后產(chǎn)生；以及通過向所述T細胞的前驅(qū)體投與外源性IL-10和抗原的組合來 制得種群。在優(yōu)選實施例中，前驅(qū)體是CD4. sup. +T細胞；所述細胞進一步產(chǎn)生較高TNF-α ; 所述細胞誘導(dǎo)對抗原的無變應(yīng)性響應(yīng)；所投與的IL-10是人類IL-10 ;投與IL-10保持至少 約7天；且/或無變應(yīng)性病狀持續(xù)至少約21天?？乖禺愋钥梢允菍x自以下各者的抗原 的特異性：蛋白質(zhì)抗原；顆粒性抗原；同種異體抗原；或自體抗原。
[0035] 另一個實施例是一種實質(zhì)上純的抗原特異性無變應(yīng)性T細胞，其特征在于在較低 IL-2、較低IL-5 ;中間物IFN- γ ;較低GM-CSF ;和較高IL-10的再刺激后產(chǎn)生。通常，細胞因 子的產(chǎn)生含量對IL-2小于約500pg/ml ;對IL-5介于約300與3000pg/ml之間；對IFN- γ 至少約 1000pg/ml ;對 GM-CSF 介于約 300-3000pg ml 之間；且對 IL-10 至少約 3000pg/mL， 優(yōu)選地，在用抗⑶3再刺激后的IL-10含量是Thl細胞的至少約5倍。
[0036] 本發(fā)明還包涵一種實質(zhì)上純的T細胞，其展現(xiàn)對抗原的抗原特異性無變應(yīng)性，包 括例如其中所述抗原是同種異體抗原或自身抗原；其在用至少約3000pg/ml的抗CD3再刺 激后產(chǎn)生IL-10 ;或其展現(xiàn)抗原特異性無變應(yīng)性，保持至少約21天。
[0037] 在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種抑制T細胞對抗原的響應(yīng)的方法，其通過向 含有所述細胞的免疫系統(tǒng)中投與外源性IL-10與抗原或抗CD3抗體的組合。優(yōu)選地，抗原是 同種異體抗原或自身抗原；但通常受MHC分子限制。在其它實施例中，所述方法體內(nèi)進行； 或進一步抑制對后續(xù)刺激的響應(yīng)，例如伴隨例如器官或骨髓移植的組織移植的響應(yīng)。通常， T細胞來自所述組織移植的接受者而抗原來自供體MHC。常常當(dāng)響應(yīng)伴隨組織移植時，投與 在組織移植之前；向接受者引入T細胞；或在移植之前向待移植的組織（例如向供體和/或 在轉(zhuǎn)運期間）投與IL-10。在其它實施例中，抗原造成自體免疫疾病。
[0038] 在其它實施例中，本發(fā)明還提供一種抑制T細胞對抗原的后續(xù)響應(yīng)的方法，其通 過向免疫系統(tǒng)中投與外源性IL-10 ;與抗原或抗⑶3抗體的組合。優(yōu)選地，IL-10投與保持 至少約7天。
[0039] 本發(fā)明進一步提供一種誘導(dǎo)T細胞對MHC抗原無變應(yīng)性的方法，其通過向T細胞 中投與前驅(qū)體，外源性IL-10和抗原；或外源性IL-10與抗⑶3抗體。優(yōu)選地，IL-10投與 保持至少約7天。
[0040] 由本發(fā)明包涵的另一個實施例是一種包含IL-10和抗原的組合物。組合物可以是 包含IL-10和醫(yī)藥學(xué)上可接受載劑的醫(yī)藥組合物；所述IL-10可以是人類IL-10 ;或抗原可 以是同種異體抗原；自身抗原；蛋白質(zhì)抗原或顆粒性抗原。
[0041] 本發(fā)明提供包含一或多個非天然編碼氨基酸的白細胞介素10(IL-10)多肽。本發(fā) 明還提供IL-10多肽的單體和二聚物。本發(fā)明還提供IL-10多肽的三聚物。本發(fā)明提供 IL-10多肽的多聚物。本發(fā)明還提供包含一或多個非天然編碼氨基酸的IL-10二聚物。本 發(fā)明提供包含一或多個非天然編碼氨基酸的IL-10多聚物。
[0042] 在一些實施例中，IL-10多肽包含一或多個翻譯后修飾。在一些實施例中，IL-10 多肽與連接基團、聚合物或生物活性分子連接。在一些實施例中，形成包括鋅的IL-10三聚 物。在一些實施例中，IL-10單體是均質(zhì)的。在一些實施例中，IL-10二聚物是均質(zhì)的。在 一些實施例中，IL-10多聚物結(jié)合于一種水溶性聚合物上。在一些實施例中，IL-10多聚物 結(jié)合于兩種水溶性聚合物。在一些實施例中，IL-10多聚物結(jié)合于三種水溶性聚合物。在一 些實施例中，IL-10多聚物結(jié)合于三種以上水溶性聚合物上。在一些實施例中，其中IL-10 多肽與長度足夠允許形成二聚物的連接基團連接。在一些實施例中，其中IL-10多肽與長 度足以允許形成三聚物的連接基團連接。在一些實施例中，其中IL-10多肽與長度足以允 許形成多聚物的連接基團連接。在一些實施例中，IL-10多肽與雙官能聚合物、雙官能連接 基團或至少一個其它IL-10多肽連接。在一些實施例中，IL-10多肽包含一或多個翻譯后 修飾。在一些實施例中，IL-10多肽與連接基團、聚合物或生物活性分子連接。
[0043] 在一些實施例中，非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。在一些實施例中，水溶 性聚合物包含聚（乙二醇）（PEG)部分。在一些實施例中，非天然編碼氨基酸通過連接基團 與水溶性聚合物連接或與水溶性聚合物鍵接。在一些實施例中，聚（乙二醇）分子是一種 雙官能聚合物。在一些實施例中，雙官能聚合物與第二多肽連接。在一些實施例中，第二多 膚是IL-10。
[0044] 在一些實施例中，IL-10或其變異體包含至少兩個與包含聚（乙二醇）部分的水 溶性聚合物連接的氨基酸。在一些實施例中，至少一個氨基酸是非天然編碼氨基酸。
[0045] 在一些實施例中，將一或多個非天然編碼氨基酸并入在IL-10或其變異體中以 下位置中的一或多者中：位置1之前（亦即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、 111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、 130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、 149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160 或添加到蛋白質(zhì)羧基端上和其任何 組合（SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:l、2、4中的相應(yīng)氨基酸）。
[0046] 在一些實施例中，將一或多個非天然編碼氨基酸并入在IL-10或其變異體中以 下位置中的一或多者中：位置1之前（亦即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、 111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、 130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、 149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160 或添加到蛋白質(zhì)羧基端上和其任何 組合（SEQ ID NO:3)。
[0047] 在一些實施例中，將一或多個非天然編碼氨基酸并入在如下的對應(yīng)于IL-10或其 變異體二級結(jié)構(gòu)的以下區(qū)域中一或多者中的任何位置中：螺旋L側(cè)；疏水性相互作用位點 處；N 端最初 43 個氨基酸內(nèi)；SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 的氨 基酸位置44-160內(nèi)。在一些實施例中，將一或多個非天然編碼氨基酸并入在IL-10或其變 異體的以下位置中的一或多者中：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 的位置 1 之前（亦即在 N 端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43 和其任何 組合。在一些實施例中，將一或多個非天然編碼氨基酸并入在IL-10或其變異體的以下位 置中的一或多者中：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 的 44、45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、 136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、 155、156、157、158、159、160或添加到蛋白質(zhì)羧基端上和其任何組合。
[0048] 在一些實施例中，在IL-10或其變異體中的這些位置中的一或多者處的非天然存 在氨基酸與水溶性聚合物連接，包括（但不限于）以下位置：位置1之前（亦即在N端）、1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、 104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、 123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、 142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160 或 添加到蛋白質(zhì)羧基端上和其任何組合（SEQ ID N0:3或SEQ ID N〇:l、2、4中的相應(yīng)氨基酸 或任何IL-10序列中的相應(yīng)氨基酸）。
[0049] 在一些實施例中，在IL-10或其變異體中的這些位置中的一或多者處的非天然存 在氨基酸與水溶性聚合物連接，包括（但不限于）以下位置：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 的位置 1 之前（亦即在 N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43或其任何組合。
[0050] 在一些實施例中，在IL-10或其變異體中的這些位置中的一或多者處的非天然存 在氨基酸與水溶性聚合物連接，包括（但不限于）以下位置：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 的 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、 109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、 128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、 147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160 或添加到蛋白質(zhì)羧基端上 和其任何組合。
[0051] 在一些實施例中，IL-10或其變異體包含調(diào)節(jié)所述IL-10對另一個IL-10或其變 異體的親和力的取代、添加或缺失。在一些實施例中，IL-10或其變異體包含調(diào)節(jié)IL-10或 其變異體對IL-10受體或結(jié)合搭配物的親和力的取代、添加缺失缺失，所述受體或結(jié)合搭 配物包括（但不限于）蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)、脂肪酸、小分子或核酸。在一些實施例中，IL-10 或其變異體包含在與不含所述取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-10的穩(wěn)定性相比較時調(diào)節(jié)所述 IL-10穩(wěn)定性的取代、添加或缺失。穩(wěn)定性和/或溶解性可以使用所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 已知的多種不同分析來測量。所述分析包括（但不限于）SE-HPLC和RP-HPLC。在一些實施 例中，IL-10或其變異體包含在與不含所述取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-10的免疫原性相比 較時調(diào)節(jié)所述IL-10免疫原性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，IL-10包含在與不含 所述取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-10的血清半衰期或循環(huán)時間相比較時調(diào)節(jié)所述IL-10血 清半衰期或循環(huán)時間的取代、添加或缺失。
[0052] 在一些實施例中，IL-10或其變異體包含在與不含所述取代、添加或缺失的相應(yīng) IL-10或其變異體的水溶性相比較時提高所述IL-10水溶性的取代、添加或缺失。在一些實 施例中，IL-10或其變異體包含在與不含所述取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-10或其變異體的 溶解性相比較時提高宿主細胞中所產(chǎn)生IL-10或其變異體溶解性的取代、添加或缺失。在 一些實施例中，IL-10或其變異體包含在與不含所述取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-10或其變 異體的表達或合成相比較時提高IL-10在宿主細胞中的表達或增加體外合成的取代、添加 或缺失。包含此取代的IL-10或其變異體保持激動劑活性并且保持或改良在宿主細胞中的 表達水平。在一些實施例中，IL-10或其變異體包含在與不含所述取代、添加或缺失的相應(yīng) IL-10或其變異體的蛋白酶抗性相比較時提高所述IL-10或其變異體蛋白酶抗性的取代、 添加或缺失。在一些實施例中，IL-10或其變異體包含在與受體對不含所述取代、添加或缺 失的相應(yīng)IL-10或其變異體相互作用的活性相比較時調(diào)節(jié)所述IL-10受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性 的取代、添加或缺失。在一些實施例中，IL-10或其變異體包含在與不含所述取代、添加或 缺失的相應(yīng)IL-10的結(jié)合相比較時調(diào)節(jié)所述IL-10與另一個分子的結(jié)合的取代、添加或缺 失。
[0053] PEG-IL-10可以調(diào)配成醫(yī)藥組合物，所述醫(yī)藥組合物包含治療有效量的IL-10和 醫(yī)藥載劑。"治療有效量"是足以提供所需治療結(jié)果的量。優(yōu)選地，所述量負(fù)性副作用最少。 經(jīng)投與以治療可用IL-10治療的病狀的PEG-IL-10量是基于所結(jié)合蛋白質(zhì)的IL-10活性， 所述活性可以通過此項技術(shù)中已知的IL-10活性分析來加以測定。對需要所述治療的特定 患者的治療有效量可以通過考慮各種因素來確定，例如所治療的病狀、患者的總體健康狀 況、投藥方法、副作用嚴(yán)重性等。在腫瘤的情形下，合適的IL-10活性將是例如浸潤到腫瘤 位點中的⑶8T細胞，來自這些浸潤性細胞的發(fā)炎性細胞因子（例如IFN. γ.、IL-4、IL-6、 IL-10和RANK-L)的表達，生物樣品中TNF-α或IFN-γ的含量增加。
[0054] 聚乙二醇化IL-10的治療有效量可以在每天每千克體重約0. 01到約100 μ g蛋白 質(zhì)的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，聚乙二醇化IL-10的量在每天每千克體重約0. 1到20 μ g蛋白質(zhì)，更 優(yōu)選地每天每千克體重約0. 5到10 μ g蛋白質(zhì)，并且最優(yōu)選地每天每千克體重約1到4 μ g 蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)。使用本發(fā)明的PEG-IL-10可以采用較不頻繁的投藥安排，因為此結(jié)合形 式的作用比IL-10長。聚乙二醇化IL-10調(diào)配成經(jīng)純化的形式，并且實質(zhì)上不含聚集體和 其它蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，通過連續(xù)輸注投與PEG-IL-10,以使得每天遞送介于約50到800 μ g 蛋白質(zhì)范圍內(nèi)的量（亦即每天每千克體重約1到16yg蛋白質(zhì)PEG-IL-10)。每日輸注速率 可以基于副作用監(jiān)測和血液細胞計數(shù)而變化。
[0055] 為制備含有單-PEG-IL-10的醫(yī)藥組合物，將治療有效量的PEG-IL-10與醫(yī)藥學(xué) 上可接受的載劑或賦形劑混合。載劑或賦形劑優(yōu)選地是惰性的。醫(yī)藥載劑可以是任何適 合于向患者遞送本發(fā)明IL-10組合物的相容的無毒物質(zhì)。合適載劑的實例包括標(biāo)準(zhǔn)生理 食鹽水、林格氏溶液（Ringer's solution)、右旋糖溶液和漢克氏溶液（Hank's solution)。 也可以使用非水性載劑，例如不揮發(fā)性油和油酸乙酯。優(yōu)選的載劑是5%右旋糖/鹽水。 載劑可以含有少量添加劑，例如增強等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，例如緩沖劑和防腐劑， 參見例如雷明頓藥物科學(xué)（Remington's Pharmaceutical Sciences)和美國藥典：國內(nèi) 處方集（U.S.Pharmacopeia:National Formulary),馬克出版公司（Mack Publishing Company),賓夕法尼亞州伊斯頓（Easton, Pa.) (1984)。治療劑和診斷劑的調(diào)配物可以通過 與生理學(xué)上可接受的呈例如凍干粉末、漿料、水溶液或懸浮液形式的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑 混合來制備（參見例如哈德曼（Hardman)等人（2001)古德曼和吉爾曼治療劑藥理學(xué)基礎(chǔ) (Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics),麥格勞 _ 希爾 集團（McGraw-Hill),紐約州紐約（New York, N.Y.);杰納羅（Gennaro) (2000)雷明頓：醫(yī) 藥科學(xué)和實踐（Remington:The Science and Practice of Pharmacy),利平科特、威廉姆 斯和威爾金斯公司（Lippincott, Williams, and Wilkrns),紐約州紐約；阿維斯（Avis)等 人（編）（1"3)醫(yī)藥劑型：非經(jīng)腸藥物治療（Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications),馬塞爾?德克公司（Marcel Dekker),紐約州；利伯曼（Lieberman)等人 (編）（1990)醫(yī)藥劑型：淀劑（Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets),馬塞爾?德克 公司，紐約州；利伯曼等人（編）（1990)醫(yī)藥劑型：分散系統(tǒng)（Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems),馬塞爾?德克公司，紐約州；韋納（Weiner)和科考斯基 (Kotkoskie) (2000)賦形劑毒性和安全性（Excipient Toxicity and Safety),馬塞爾?德 克公司（Marcel Dekker, Inc.)，紐約州紐約。
[0056] 本發(fā)明的組合物可以經(jīng)口投與或注射到身體中。用于經(jīng)口使用的調(diào)配物還可以包 括進一步保護IL-10不受胃腸道中蛋白酶影響的化合物。注射通常是肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或 靜脈內(nèi)的?；蛘撸谶m當(dāng)情況下可以使用關(guān)節(jié)內(nèi)注射或其它途徑。
[0057] 當(dāng)非經(jīng)腸投與時，聚乙二醇化IL-10優(yōu)選地以單位劑量可注射形式（溶液、懸浮 液、乳液）與醫(yī)藥載劑聯(lián)合調(diào)配。參見例如阿維斯等人，編，醫(yī)藥劑型：非經(jīng)腸藥物治療， 德克公司（Dekker)，紐約州（1993);利伯曼等人，編，醫(yī)藥劑型：錠劑，德克公司，紐約州 (1990);和利伯曼等人，編，醫(yī)藥劑型：分散系統(tǒng)，德克公司，紐約州（1990)?；蛘?，本發(fā)明 的組合物可以通過可植入或可注射藥物遞送系統(tǒng)引入患者身體中，例如厄克特（Urquhart) 等人藥理學(xué)和毒理學(xué)年鑒（Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.) 24:199-236，（1984);路易 斯（Lewis)編，農(nóng)藥和醫(yī)藥的受控釋放（Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals)普雷納姆出版社（Plenum Press),紐約（1981)美國專利第 3, 773, 919 號；第3, 270, 960號；等。聚乙二醇化IL-10可以在存在或不存在各種添加劑和/或稀釋劑 的情況下在例如水、鹽水或緩沖媒劑的水性媒劑中投與。
[0058] 特定患者的有效量可以取決于例如以下各者的因素而變化：所治療的病狀、患者 的總體健康狀況、投藥的方法途徑和劑量、和副作用的嚴(yán)重性（參見例如梅納德（Maynard) 等人（1996)良好臨床實踐SOP手冊（A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice), 國際藥物出版社（Interpharm Press),佛羅里達州波卡拉頓（Boca Raton, Fla.);登 特（Dent) (2001)良好實驗室和良好臨床實踐（Good Laboratory and Good Clinical Practice),厄奇出版社（Urch Publ.),英國倫敦）。
[0059] 典型獸醫(yī)學(xué)、實驗或研究個體包括猴、犬、貓、大鼠、小鼠、兔、天竺鼠、馬和人類。
[0060] 由臨床醫(yī)生例如使用此項技術(shù)中已知或懷疑影響治療或預(yù)測影響治療的參數(shù)或 因素來確定適當(dāng)劑量。一般來說，劑量以在某種程度上小于最佳劑量的量開始，并且其隨后 以較小增量增加，直到相對于任何負(fù)性副作用實現(xiàn)所需或最佳效果。重要診斷測量包括例 如炎癥癥狀或所產(chǎn)生發(fā)炎性細胞因子含量的那些測量。優(yōu)選地，將使用的生物來源于與治 療所針對的動物相同物種，由此將對試劑的體液響應(yīng)減到最少。
[0061] 用第二治療劑（例如細胞因子、類固醇、化學(xué)治療劑、抗生素或輻射）共投與或治 療的方法是此項技術(shù)中眾所周知的（參見例如哈德曼等人（編）（2001)古德曼和吉爾曼治 療劑藥理學(xué)基礎(chǔ)，第10補充版，麥格勞-希爾集團，紐約州紐約；普爾（Poole)和彼得森 (Peterson)(編）（2001)高階實踐的藥物治療學(xué)：實用方法（Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach),利平科特、威廉姆斯和威爾金斯公司，賓夕 法尼亞州費城（Phila.，PA);錢伯納（Chabner)和隆戈（Longo)(編）（2001)癌癥化學(xué)療法 和生物療法（Cancer Chemotherapy and Biotherapy)，利平科特、威廉姆斯和威爾金斯公 司，賓夕法尼亞州費城）。有效量的治療劑將減少癥狀（例如腫瘤大小）或抑制腫瘤增長， 通常至少10% ;通常至少20% ;優(yōu)選地至少約30% ;更優(yōu)選地至少40%，并且最優(yōu)選地至 少 50%。
[0062] 本發(fā)明提供治療增生性病狀或病癥的方法，例如以下各者的癌癥：子宮、子宮 頸、乳房、前列腺、睪丸、陰莖、胃腸道（例如食道、口咽、胃、小腸或大腸、結(jié)腸、或直腸）、 腎臟、腎細胞、膀胱、骨、骨髓、皮膚、頭部或頸部、皮膚、肝臟、膽囊、心、肺、胰腺、唾液腺、 腎上腺、甲狀腺、大腦（例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤）、神經(jīng)節(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)和外周神經(jīng)系統(tǒng) (PNS)和免疫系統(tǒng)（例如脾臟或胸腺）。本發(fā)明提供治療例如以下各者的方法：免疫原 性腫瘤、非免疫原性腫瘤、休眠腫瘤、病毒誘導(dǎo)癌癥（例如上皮細胞癌、內(nèi)皮細胞癌、鱗狀 細胞癌、乳突狀瘤病毒、腺癌、淋巴瘤）、癌瘤、黑色素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌、化 學(xué)誘導(dǎo)癌癥、癌轉(zhuǎn)移和血管生成。本發(fā)明還涵蓋例如通過調(diào)節(jié)調(diào)控性T細胞（Treg)和或 CD8T細胞的活性來降低對腫瘤細胞或癌細胞抗原的耐受性（參見例如拉米雷茲-蒙太 古（Ramirez-Montagut)等人（2003)癌基因（Oncogene) 22:3180-3187 ;薩瓦亞（Sawaya) 等人（2003)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志349:1501-1509 ;法勒（Farrar)等人（1999)免疫學(xué)雜志 162:2842-2849 ;勒（Le)等人（2001)免疫學(xué)雜志 167:6765-6772 ;卡尼斯塔（Cannistra) 和尼洛夫（Niloff) (1996)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志334:1030-1038 ;奧斯本（Osborne) (1998) 新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志339:1609-1618 ;林奇（Lynch)和沙佩勒（Chapelle) (2003)新英 格蘭醫(yī)學(xué)雜志348:919-932 ;恩辛格（Enzinger)和梅爾（Mayer) (2003)新英格蘭醫(yī) 學(xué)雜志349:2241-2252 ;福雷斯蒂耶雷（Forastiere)等人（2001)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志 345:1890-1900 ;伊茲比克（Izbicki)等人（1997)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志337:1188-1194 ;霍蘭 德（Holland)等人（編）（1996)癌癥的癌癥藥物百科全書（Cancer Medicine Encyclopedia of Cancer)，第4補充版，學(xué)術(shù)出版社，加利福尼亞州圣地亞哥）。
[0063] 在一些實施例中，本發(fā)明提供用于用PEG-IL-10和至少一種其它治療劑或診斷劑 來治療增生性病狀、癌癥、腫瘤或癌變前病狀（例如非典型增生）的方法。其它治療劑可 以是例如細胞因子或細胞因子拮抗劑（例如IL-12、干擾素-α或抗表皮生長因子受體）、 多柔比星、表柔比星（epirubicin)、抗葉酸（例如甲胺碟呤（methotrexate)或氟尿啼陡）、 伊立替康（irinotecan)、環(huán)磷酰胺、放射線療法、激素或抗激素療法（例如雄激素、雌激素、 抗雌激素、氟他胺（flutamide)或二乙基己烯雌酚（diethylstilbestrol))、手術(shù)、他莫昔 芬（tamoxifen)、異環(huán)磷酰胺（ifosfamide)、二溴衛(wèi)矛醇（mitolactol)、燒基化劑（例如美 法侖（melphalan)或順鉬）、依托泊苷（etoposide)、長春瑞賓、長春堿、長春地辛、糖皮質(zhì) 激素（glucocorticoid)、組胺受體拮抗劑、血管生成抑制劑、輻射、輻射敏化劑、蒽環(huán)霉素 (anthracycline)、長春花生物堿、紫杉燒（例如紫杉醇和多烯紫杉醇）、細胞周期抑制劑 (例如細胞周期調(diào)節(jié)蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitor))、針 對另一種腫瘤抗原的單克隆抗體、單克隆抗體與毒素的復(fù)合物、T細胞佐劑、骨髓移植、或抗 原呈遞細胞（例如樹突狀細胞療法）。疫苗可以可溶性蛋白質(zhì)形式或以編碼所述蛋白質(zhì)的 核酸形式提供（參見例如勒等人，同前文獻；格列柯（Greco)和澤爾夫斯基（Zellefsky) (編）（2000)前列腺癌的放射線療法（Radiotherapy of Prostate Cancer),哈伍德學(xué)術(shù)出 版社（Harwood Academic),阿姆斯特丹（Amsterdam);夏皮羅（Shapiro)和雷希特（Recht) (2001)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志344:1997-2008 ;霍托巴基（Hortobagyi) (1998)新英格蘭醫(yī)學(xué) 雜志339:974-984 ;卡特羅納（Catalona) (1994)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志331:996-1004 ;內(nèi)勒 (Naylor)和哈登（Hadden) (2003)國際免疫藥理學(xué)（Int. Immunopharmacol. )3:1205-1215 ; 國際輔助肺癌研究合作組（The Int. Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group) (2004)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志350:351-360 ;斯拉蒙（Slamon)等人（2001)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志 344:783-792 ;庫德卡（Kudelka)等人（1998)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志338:991-992 ;范?內(nèi)登 (van Netten)等人（1996)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志334:920-921)。
[0064] 還提供治療癌癥髓外造血（EMH)的方法。描述EMH(參見例如拉奧（Rao)等人 (2003)白血病和淋巴瘤（Leuk.Lymphoma)44:715-718 ;雷恩（Lane)等人（2002)皮膚病理 學(xué)雜志（J. Cutan. Pathol.) 29:608-612)。
[0065] 在一些實施例中，IL-10或其變異體包含與不含所述取代、添加或缺失的相應(yīng) IL-10的脂質(zhì)結(jié)合活性相比較調(diào)節(jié)所述IL-10脂質(zhì)結(jié)合的取代、添加或缺失。在一些實施例 中，IL-10或其變異體包含與不含所述取代、添加或缺失的相應(yīng)IL-10或其變異體的脂質(zhì)代 謝活性相比較增強所述IL-10與代謝脂質(zhì)相關(guān)活性的取代、添加或缺失。
[0066] 在一些實施例中，IL-10或其變異體包含在與不含所述取代、添加或缺失的相應(yīng)野 生型IL-10的相容性相比較時提高所述IL-10或其變異體與醫(yī)藥防腐劑（例如間甲酚、苯 酚、苯甲醇）相容性的取代、添加或缺失。此提高的相容性將使保存的醫(yī)藥調(diào)配物制劑能夠 在存儲期間保持蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性（physiochemical property)和生物活性。
[0067] 在一些實施例中，利用一或多個非天然氨基酸產(chǎn)生一或多個經(jīng)工程改造的鍵。分 子內(nèi)鍵可以多種方式產(chǎn)生，包括（但不限于）在合適條件下，蛋白質(zhì)中的兩個氨基酸之間 發(fā)生反應(yīng)（一個或兩個氨基酸可以是非天然氨基酸）；在合適條件下，兩個氨基酸與連接基 團、聚合物或其它分子發(fā)生反應(yīng)，這兩個氨基酸各自可以是天然編碼或非天然編碼的，等。 [0068] 在一些實施例中，IL-10或其變異體中的一或多個氨基酸取代可以用一或多個天 然存在或非天然存在的氨基酸進行。在一些實施例中，IL-10或其變異體中的氨基酸取代 可以用天然存在或非天然存在的氨基酸進行，其限制條件為至少一個取代用非天然編碼氨 基酸進行。在一些實施例中，IL-10或其變異體中的一或多個氨基酸取代可以用一或多個 天然存在的氨基酸進行，并且另外至少一個取代用非天然編碼氨基酸進行。
[0069] 在一些實施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨 基脈基、置氣基或塊基。
[0070] 在一些實施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基。在一些實施例中，非天然編碼的氨 基酸具有以下結(jié)構(gòu)：
[0071]

【權(quán)利要求】
1. 一種白細胞介素 IO(IL-IO)多肽，其包含一或多個非天然編碼氨基酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10多肽與SEQ ID NO: 390%同源。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10多肽與SEQ ID NO: 3至少90%同源。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10多肽與SEQ ID NO: 3至少95%同源。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10多肽與SEQ ID NO: 3至少98%同源。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10多肽與SEQ ID NO: 3至少99%同源。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10結(jié)合于一或多種水溶性聚合物上。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的IL-10,其中所述水溶性聚合物中的至少一者與非天然編碼 氨基酸中的至少一者連接。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10的形式是單體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10的形式是二聚物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的IL-10,其中所述IL-10三聚物結(jié)合于至少一種水溶性聚合 物上。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的IL-10,其中所述IL-10三聚物結(jié)合于至少一種水溶性聚 合物上。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組 成的群組的位置處經(jīng)取代：位置1之前（亦即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、 111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、 130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、 149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160 或添加到蛋白質(zhì)羧基端上和其任何 組合。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10包含一或多個調(diào)節(jié)所述IL-10多肽 對IL-10受體親和力的氨基酸取代、添加或缺失。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10包含一或多個提高所述IL-10穩(wěn)定 性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白元，其中所述IL-10包含一或多個提高所述IL-10多 肽在重組宿主細胞中的表達或體外合成的氨基酸取代、添加或缺失。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10包含一或多個提高所述IL-10的蛋 白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述非天然編碼氨基酸對連接基團、聚合物或 生物活性分子具有反應(yīng)性，而所述連接基團、聚合物或生物活性分子另外對所述多肽中的 20種常見氨基酸中的任一者均不具反應(yīng)性。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、肼 基、醜餅基、氣基脈基、置氣基或塊基。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-10,其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu)：
其中η是O到10成是烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；R2是H、烷基、芳基、經(jīng)取 代烷基和經(jīng)取代芳基；并且R3是1氨基酸、多肽，或氨基端修飾基團；并且R4是!1、氨基酸、 多肽，或羧基端修飾基團。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-10,其中所述非天然編碼氨基酸包含氨氧基。
23. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-10,其中所述非天然編碼氨基酸包含酰肼基。
24. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-10,其中所述非天然編碼氨基酸包含肼基。
25. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-10,其中所述非天然編碼氨基酸殘基包含氨基脲基。
26. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-10多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含疊氮基。
27. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的IL-10,其中所述非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu)：
其中η是0到10況是烷基、芳基、經(jīng)取代烷基、經(jīng)取代芳基或不存在；X是0、N、S或不 存在；m是0到10 ;R2是H、氨基酸、多肽或氨基端修飾基團；并且R3是H、氨基酸、多肽或羧 基端修飾基團。
28. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-10,其中所述非天然編碼氨基酸包含炔基。
29. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu)：
其中η是0到10成是烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；X是0、N、S或不存在；m 是0到10 ;R2是H、氨基酸、多肽或氨基端修飾基團；并且R3是H、氨基酸、多肽或羧基端修 飾基團。
30. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的IL-10,其中所述水溶性聚合物的分子量介于約0. IkDa與 約IOOkDa之間。
31. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的IL-10多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量介于約 0. IkDa與約50kDa之間。
32. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的IL-10,其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基通過酰 胺鍵與所述水溶性聚合物連接。
33. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的IL-10,其通過使包含羰基的水溶性聚合物與包含非天然 編碼氨基酸的多肽反應(yīng)來制得，所述非天然編碼氨基酸包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲 基。
34. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述非天然編碼氨基酸包含糖部分。
35. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10多肽更包含通過所述非天然編碼氨 基酸與所述多肽連接的連接基團、聚合物或生物活性分子。
36. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的IL-10,其中所述IL-10多肽其中所述連接基團、聚合物或 生物活性分子通過糖部分與所述多肽連接。
37. -種制造根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細胞介素10的方法，所述方法包含使所分離的 包含非天然編碼氨基酸的IL-10多肽與包含與所述非天然編碼氨基酸反應(yīng)部分的連接基 團、聚合物或生物活性分子接觸。
38. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述聚合物包含選自由水溶性聚合物和聚（乙 二醇）組成的群組的部分。
39. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼 基、餅基、氣基脈基、置氣基或塊基。
40. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基部分，并且所 述連接基團、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分。
41. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分通過酰胺鍵 與所述連接基團、聚合物或生物活性分子連接。
42. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含炔部分，并且所述 連接基團、聚合物或生物活性分子包含疊氮部分。
43. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含疊氮部分，并且所 述連接基團、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
44. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的IL-10多肽，其中所述水溶性聚合物是聚（乙二醇）部分。
45. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的IL-10多肽，其中所述聚（乙二醇）部分是分支或多臂接 枝聚合物。
46. -種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL-10和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。
47. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連 接。
48. -種治療患有由白細胞介素10調(diào)節(jié)的病癥的患者的方法，其包含向所述患者投與 治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求44所述的組合物。
49. 一種制造包含非天然編碼氨基酸的白細胞介素10的方法，所述方法包含在允許包 含非天然編碼氨基酸的IL-10多肽表達的條件下培養(yǎng)包含編碼IL-10多肽的包含選擇密碼 子的一或多個多核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的細胞；以及純化所述多肽。
50. -種調(diào)節(jié)白細胞介素10多肽血清半衰期或循環(huán)時間的方法，所述方法包含用一或 多個非天然編碼氨基酸取代所述多肽中的任何一或多個天然存在氨基酸。
51. -種白細胞介素10多肽，其包含一或多個提高重組宿主細胞中所述IL-10多肽的 表達的氨基酸取代、添加或缺失。
52. -種白細胞介素10多肽，其包含至少一個連接基團、聚合物或生物活性分子，其中 所述連接基團、聚合物或生物活性分子通過以核糖體方式并入多肽中的非天然編碼氨基酸 的官能團連接到所述多肽上。
53. -種白細胞介素10多肽，其包含連接到一或多個非天然編碼氨基酸上的連接基 團、聚合物或生物活性分子，其中所述非天然編碼氨基酸在預(yù)先選擇的位點處以核糖體方 式并入所述多肽中。
【文檔編號】C07K14/00GK104245722SQ201380021501
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月29日
【發(fā)明者】克里斯汀·S.·艾頓, 梅蘭妮·尼爾森 申請人:Ambrx公司