專利名稱：從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆中制備人用基因抗菌肽藥品及其用途的制作方法
昆蟲(chóng)(家蠅)雖然沒(méi)有完善的免疫防御體系，但卻具有高效的無(wú)細(xì)胞免疫系統(tǒng)。抗菌肽是昆蟲(chóng)(家蠅)免疫后血淋巴中的一類抗菌多肽，它具有分子量小，熱穩(wěn)定，水溶性好，無(wú)免疫原性，抗菌譜廣等特點(diǎn)。現(xiàn)在，它被認(rèn)為是從細(xì)菌到高等哺乳動(dòng)物普遍存在的一類防御性多肽，稱之為“第二防御體系”?？咕牟粌H抗菌譜廣，而且可以抑殺某些真菌、病毒及原蟲(chóng)，并對(duì)多種癌細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)全瘤有明顯的殺傷作用，而不破壞正常細(xì)胞。
抗菌肽即將成為一代新的抗菌、抗病素、抗癌藥物。但天然抗菌肽的來(lái)源少，成本高，無(wú)法滿足臨床應(yīng)用的需要。因此我們通過(guò)DNA重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆繁育家蠅收集蠅蛆獲得大量抗菌肽已成為現(xiàn)實(shí)。
從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆中提取、純化出人用基因抗菌肽藥物代替抗菌素對(duì)感染性疾的應(yīng)用。其主要特點(diǎn)有一是抗菌譜廣，對(duì)很多病菌均有作用，而且療效確實(shí)；二是無(wú)抗藥性，不存在用藥不合理很快產(chǎn)生抗菌性；三是幾乎無(wú)毒副作用，分子量小，無(wú)過(guò)敏原，不需做過(guò)敏性試驗(yàn)；四是小分子耐熱，性能穩(wěn)定，有效期長(zhǎng)，易于貯存、保管；五是用量小，以微克計(jì)算，而且可作用于多種途徑如靜注、肌注、口服、噴霧、皮滲，栓劑等；六是對(duì)病毒性疾病也有很好的作用。
一、目前抗菌素存在的主要問(wèn)題抗菌素是指由細(xì)菌、霉菌或其它微生物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類物質(zhì)。自1940年青霉素應(yīng)用于臨床到現(xiàn)在抗生素已達(dá)上千種。在臨床上常用的亦有幾百種。其主要是從微生物的培養(yǎng)液中提取的或者用合成、半合成方法制造。大致可分以下幾類
1、B-內(nèi)酰胺類青霉素和頭孢菌素類的分子結(jié)構(gòu)中含有B-內(nèi)酰胺環(huán)。近年來(lái)又有較大發(fā)展，如硫酶素類(thienamycins)、單內(nèi)酰環(huán)類(monobactams)，B-內(nèi)酰酶抑制劑(B-lactamade inhibitors)等。
2、氨基糖甙類，包括在鏈霉素、慶大霉素、卡娜霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素等。
3、四不素類，包括四環(huán)素、土霉素、金霉素及強(qiáng)力霉素等。
4、氯霉素類，包括氯霉素、甲硯霉素等。
5、大環(huán)內(nèi)脂類，臨床常用的有紅霉素、白霉素、無(wú)味紅霉素、乙酰螺旋霉素、殫迪霉素、交沙霉素等。
6、作用于G+細(xì)菌的共它抗生素，如林可霉素、氯林可霉素、萬(wàn)古霉素、桿菌肽等。
7、作用于G菌的其它抗生素，如多粘菌素、磷霉素、卷霉素、環(huán)絲氨酸、利福平等。
8、抗真菌抗生素如灰黃霉素。
9、抗腫瘤抗生素如絲霉素、放線菌素D、博萊霉素、阿霉素等。
10、具有免疫抑制作用的抗生素如環(huán)孢霉素。
以上十類抗生素約幾百種，給患者和臨床醫(yī)生眼花繚亂，如何合理選擇實(shí)屬難題。耐藥細(xì)菌的急劇增長(zhǎng)。一般來(lái)說(shuō)，幾乎所有臨床醫(yī)師都基本了解抗生素在應(yīng)用過(guò)程中都可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。這些不良反應(yīng)在體內(nèi)過(guò)程與療效關(guān)系都難判定。如B-內(nèi)酰胺類的致敏性；氨基糖甙類的耳毒性，五環(huán)內(nèi)脂抗生素在臨床上應(yīng)用量大，面廣、品種多、更新快、各類藥品之間相互作用關(guān)系復(fù)雜，因此抗菌藥物臨床應(yīng)用發(fā)生率及耐藥性仍然逐年增加。這些問(wèn)題的發(fā)生，主要由抗生素本身決定的。所有抗生素臨床選用很難，急需用換代產(chǎn)品來(lái)替代抗生素的應(yīng)用。藥物的有效選擇、合理應(yīng)用理論講是可行的，實(shí)際應(yīng)用太難了。而合理使用抗生素需具體病人制定出個(gè)體化治療方案。絕沒(méi)有一個(gè)固定的方案可以在不同的情況下沿用。
二、基因人用抗菌肽藥物的有效性和安全生1、抗菌肽的抗感染作用抗菌肽的主要作用和生物學(xué)效應(yīng)在它的名稱上已有體現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的抗菌肽均具有廣譜抗菌作用。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均有殺傷作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、念珠球菌、綠膿桿菌、結(jié)核桿菌、肺炎克雷氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、變形桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、糞鏈球菌都有很好的抗菌效果。對(duì)治療創(chuàng)傷、燒傷等細(xì)菌感染和敗血癥休克有很好的治療作用，對(duì)病毒、真菌、原蟲(chóng)也有殺傷和抑制作用。
2、抗菌肽遺傳毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)安全。
經(jīng)用Ames試驗(yàn)、嚙齒動(dòng)物微核試驗(yàn)和睪丸細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)，證明抗菌肽的遺傳毒理學(xué)效應(yīng)安全可靠，測(cè)試抗菌肽對(duì)小鼠無(wú)蓄積毒性。
三、抗菌肽的作用機(jī)理抗菌肽具有廣譜殺菌作用，包括對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭低陽(yáng)性細(xì)菌，尤其對(duì)耐藥菌株有明顯抑殺作用。另外，對(duì)某些真菌如粗糙鏈孢霉、綠色木霉、大刀鐮孢等有顯著效果。關(guān)于抗菌肽的殺菌機(jī)制。Christensen等以脂雙層為模型詳細(xì)描述了抗菌肽作用于膜的過(guò)程。首先是抗菌肽通過(guò)靜電作用被吸引到膜表面，在后疏水尾巴插入細(xì)胞膜中的疏水區(qū)域，通過(guò)改變膜的構(gòu)象，多個(gè)抗菌肽聚合在膜上形成了離子通道，造成物質(zhì)泄露和細(xì)菌死亡。1996年，Lockey利用電子顯微鏡和免疫膠體金技術(shù)觀察到天蠶素(cecropin(A結(jié)合到大腸桿菌(r.)膜上，形成一個(gè)9.6nm直徑的病灶，形成的孔洞直徑4.2nm，也洞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄，細(xì)菌死亡。Juvvadi通過(guò)對(duì)天蠶素A和蜂素素(melittin)雜合體的抗菌作用研究，推測(cè)抗菌肽的抗菌作用的第一步是抗菌肽的陽(yáng)離子與膜上磷脂基團(tuán)的陰離子之間的相互作用，接著是與膜上碳?xì)浠衔锏南嗷ハ嘧饔?，然后肽分子的疏水，螺旋插入膜上，聚合形成孔道，?dǎo)致內(nèi)容物外泄，細(xì)菌死亡。1997年，Silvestro研究發(fā)現(xiàn)天蠶素A在低濃度時(shí)可改變脂質(zhì)體的膜電化學(xué)離子梯度，同樣濃度下也可改變革蘭氏陰性菌的膜離子梯度，但在更高濃度下才會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)容物的釋放。所以天蠶素A是通過(guò)改變膜離子梯度來(lái)殺死細(xì)菌的。而1998年，Park卻發(fā)現(xiàn)蛙的一種抗菌肽BuforinⅡ與昆蟲(chóng)抗菌肽的抗菌機(jī)理不同，沒(méi)有裂解細(xì)胞膜，而是穿過(guò)膜，結(jié)合到DNA、RNA上，快速導(dǎo)致細(xì)菌死亡。目前，化學(xué)合成的抗真菌藥物副作用較大，而抗菌肽的毒副作用小，且具有熱穩(wěn)定、抗菌譜廣等特點(diǎn)。但目前抗菌肽抑殺真菌的作用機(jī)理研究較少。Cavallarin發(fā)現(xiàn)位于Cecropin衍生物N末端，螺旋區(qū)域的11個(gè)氨基酸順序與抗真菌活力有關(guān)。1998年，Lee用激光共聚焦顯微鏡觀察真菌受抗菌肽作用后，細(xì)胞膜上也有洞形成，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，對(duì)熒光敏感性增強(qiáng)。
四、人用基因抗菌肽藥物的質(zhì)量指標(biāo)要求除含有特定抗菌肽免疫活性物質(zhì)含量外，以下項(xiàng)目指標(biāo)必須符合基因生物藥品規(guī)定的質(zhì)量要求，保證藥物安全性、有效性、穩(wěn)定性和時(shí)效必的統(tǒng)一。Lowos檢測(cè)蛋白含量 1.65 外觀檢查微色液體SDS-PAGE電泳純度測(cè)定＞95 PH值6.55HPLC純度測(cè)定100 無(wú)菌試驗(yàn)合格SDS-PAGE電脈分子量測(cè)定 3300 熱原質(zhì)檢定(家免法) 合格等電聚焦電泳等電點(diǎn)測(cè)定 5.5 內(nèi)毒素試驗(yàn)(魚(yú)試劑法)＜kc/n特異性及純度檢測(cè)(免疫印跡法)陽(yáng)性 安全試驗(yàn)合格殘余DNA檢測(cè) ＜10pg/mg 穩(wěn)定性試驗(yàn) 合格宿主蛋白含量測(cè)定＜510pg/mg全自動(dòng)紫外全波段掃描276.9效價(jià)測(cè)定4.72肽圖譜測(cè)定 合格N端氨基酸序列 與理酸一致(N端不含氨基酸)生物活性測(cè)定50ug/ml五、人用基因抗菌肽的使用方式注射用基因人抗菌肽系采用轉(zhuǎn)基因蠅蛆工程技術(shù)生產(chǎn)，結(jié)構(gòu)與天然抗菌肽一致、高純度的液體制品，具有顯著廣譜抗菌作用，同時(shí)還有抗病毒，抗真菌和抗腫瘤等功能。
適應(yīng)癥本品主要用于治療各類感染性疾病，對(duì)革蘭氏細(xì)菌和金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌結(jié)核菌等有很好的治療作用。也可用病毒和真菌感染，對(duì)腫瘤也有一定的治療作用。
用法和用量供皮下或肌肉注射。每天一次，每次50ug/ml，腫瘤用100ug/ml。劑量和治療時(shí)間也可視具體情況在醫(yī)生的指導(dǎo)下適當(dāng)調(diào)整。
不良反應(yīng)患者注射本品一般無(wú)不良反應(yīng)，個(gè)別可能出現(xiàn)注射部位輕微疼痛。
注意事項(xiàng)1、本品溶解時(shí)如有渾濁沉淀、包裝瓶如有損壞以及過(guò)期失效者不得使用。2、用藥謹(jǐn)遵醫(yī)囑，不得擅自使用。
規(guī)格本品為水劑，每包裝含基因人抗菌肽500ug/ml、100ug/ml。
有效期本品自生產(chǎn)之日起四年內(nèi)有效。
儲(chǔ)存自然溫度避光保存。
權(quán)利要求
1.從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆中制備人用基因抗菌肽藥品，是從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆中提取的基因抗菌肽，具備Lowos檢測(cè)蛋白含量 1.65 外觀檢查 微色液體SDS-PAGE電泳純度測(cè)定 ＞95 PH值 6.55HPLC純度測(cè)定 100無(wú)菌試驗(yàn) 合格SDS-PAGE電脈分子量測(cè)定3300 熱原質(zhì)檢定(家免法)合格等電聚焦電泳等電點(diǎn)測(cè)定5.5內(nèi)毒素試驗(yàn)(魚(yú)試劑法) ＜kc/n特異性及純度檢測(cè)(免疫印跡法) 陽(yáng)性 安全試驗(yàn) 合格殘余DNA檢測(cè) ＜10pg/mg 穩(wěn)定性試驗(yàn)合格宿主蛋白含量測(cè)定 ＜510pg/mg全自動(dòng)紫外全波段掃描 276.9效價(jià)測(cè)定 4.72肽圖譜測(cè)定合格N端氨基酸序列 與理酸一致(N端不含氨基酸)生物活性測(cè)定 50ug/ml
2.從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆中制備人用基因抗菌肽藥品，一種抗革蘭氏細(xì)菌藥，含從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆中制備人用基因抗菌肽和制藥可接受的載體。
全文摘要
從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆中制備人用基因抗菌肽藥品,是從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆中提取的基因抗菌肽,含從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆中制備人用基因抗菌肽和制藥可接受的載體。取代抗菌素對(duì)感染性疾病的應(yīng)用,有著廣泛的前景。它不但抗菌譜廣,療效確實(shí),無(wú)抗藥性和無(wú)毒副作用,而且分子量小,無(wú)過(guò)能原,能耐熱,性能穩(wěn)定,易于貯藏,用量小,以微克計(jì)算,可作用于多種途徑,如靜注、肌注、口服、噴霧等。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1312293SQ0110619
公開(kāi)日2001年9月12日 申請(qǐng)日期2001年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月23日
發(fā)明者茍仕金, 茍鴻鷹, 王成余 申請(qǐng)人:遼寧天成生物制藥研究所