專利名稱：產(chǎn)生高γ－亞麻酸含量的大豆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能改變一種宿主生物使其產(chǎn)生Δ6-脂肪酸脫氫酶以及在該酶的作用下產(chǎn)生γ-亞麻酸的方法。本發(fā)明還涉及含有異源調(diào)節(jié)順序進(jìn)行功能性結(jié)合的Δ6-脂肪酸脫氫酶編碼區(qū)的重組表達(dá)載體。重組表達(dá)載體中的啟動(dòng)子為CaMV35S組成型啟動(dòng)子或大豆β-伴球蛋白種子啟動(dòng)子。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，從子葉節(jié)和胚軸誘導(dǎo)出的叢生芽，在50mg/L Kan篩選培養(yǎng)基中連續(xù)篩選，再生芽的生存率為15％，將再生苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基之前，先將其基部切去采用生根粉浸潤(rùn)，再放入不含卡那霉素的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這一方法可提高生根率達(dá)到80％。采用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)基因于缺陷γ-亞麻酸的大豆中產(chǎn)生γ-亞麻酸。
從天然產(chǎn)生γ-亞麻酸的物種中獲取參與γ-亞麻酸生物合成的遺傳物質(zhì)，并將分離到的遺傳物質(zhì)單獨(dú)或組合在一種能產(chǎn)生γ-亞麻酸的異源系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)是十分有意義的。
目前產(chǎn)生γ-亞麻酸的方法已有許多，中國(guó)專利92113085公開了“通過(guò)Δ6-去飽和酶生產(chǎn)γ-亞麻酸”，這一專利主要闡述了蘭藻細(xì)菌Δ6-去飽和酶轉(zhuǎn)基因藻類產(chǎn)生γ-亞麻酸，與本申請(qǐng)背景技術(shù)相似但發(fā)明內(nèi)容差異較大。
本發(fā)明涉及從深黃被孢霉M6-22分離的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因是全長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)基因，核苷酸長(zhǎng)度為1374bp，編碼457個(gè)氨基酸。
本發(fā)明涉及包括Δ6-脂肪酸脫氫酶基因與外源調(diào)節(jié)區(qū)即非源于Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的單元，進(jìn)行功能性結(jié)合的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生γ-亞麻酸大豆的方法，通過(guò)本發(fā)明分離的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)化的大豆細(xì)胞以及該細(xì)胞再生的植物。
本發(fā)明還提供了含有Δ6-脂肪酸脫氫酶cDNA的載體。在不同生物體中構(gòu)建合適的表達(dá)載體指導(dǎo)Δ6-脂肪酸脫氫酶編碼順序，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。本文所述的表達(dá)載體指的是組成型載體或整合型載體，用于調(diào)控目的基因的表達(dá)。優(yōu)選的載體是質(zhì)粒。這類載體含有能夠有效進(jìn)行基因表達(dá)的順序單元，這些順序單元包括啟動(dòng)子等。本發(fā)明所用的大豆轉(zhuǎn)化表達(dá)載體中含有組成型的CaMV35S或β-伴球蛋白大豆種子特異性啟動(dòng)子。
在缺陷或缺乏γ-亞麻酸的生物體產(chǎn)生γ-亞麻酸的方法，它包括用一種從真菌中分離的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因并轉(zhuǎn)化到缺陷或缺乏γ-亞麻酸的生物體中表達(dá)和增加γ-亞麻酸含量，所述的真菌為深黃被孢霉M6-22(Mortierella isabellina M6-22)，其中Δ6-脂肪酸脫氫酶基因結(jié)構(gòu)為SEQ ID NO1(Genbank接受號(hào)為AF306634)。
所述的生物體是低等真核生物的酵母菌、高等植物中的煙草、大豆或油菜。所述的酵母菌為釀酒酵母INVSCl(Saccharomyces cereviciae INVScl)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris GS115)，表達(dá)載體分別為pYMICL6和pPMICL6。
所述的煙草為Nicotiana tabacum cv.xanthi和N.tabacum cv.YN(云南大金元)，表達(dá)載體分別為pGAMICL6和pBMICL6；所述的大豆為吉林35、吉林37、吉林43、黑農(nóng)37和綏農(nóng)10品種，表達(dá)載體為pBMICL6，所述的表達(dá)載體的啟動(dòng)子為β-伴球蛋白大豆種子啟動(dòng)子或CaMV35S啟動(dòng)子，將帶有Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的重組的表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法感染大豆的子葉節(jié)和胚軸誘導(dǎo)出叢生芽和再生植株；所述的油菜為甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)99F045C、99F044C和99F057C三系雜交組合的恢復(fù)系，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)恢復(fù)系子葉柄進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化獲得再生植株。
一種產(chǎn)生高γ-亞麻酸含量的大豆的方法，包括1)用一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大豆細(xì)胞，所述的表達(dá)載體含有SEQ ID NO1(Genbank接受號(hào)為AF306634)的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因，所述的表達(dá)載體為雙元載體pBMICL6，啟動(dòng)子為組成型的CaMV35S或特異性大豆β一伴球蛋白種子啟動(dòng)子，選擇標(biāo)記為卡那霉素或潮霉素；2)將帶有Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的重組的表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法感染大豆的子葉節(jié)和幼胚誘導(dǎo)出叢生芽和再生植株。
所述的轉(zhuǎn)化方法是從子葉節(jié)和胚軸誘導(dǎo)出的叢生芽，在50mg/L Kan篩選培養(yǎng)基中連續(xù)篩選，再生芽的生存率為15％，待叢生芽生長(zhǎng)至2cm高時(shí)轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中，降低Kan濃度為25％或完全去除。所述的轉(zhuǎn)化方法是將再生苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基之前，先將其基部切去采用生根粉浸潤(rùn)，再放入不含卡那霉素的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待再生苗在生根培養(yǎng)基中長(zhǎng)出主根后，轉(zhuǎn)入蛭石或土壤中。
所述的大豆為吉林35、吉林43、吉林47、黑農(nóng)37和綏農(nóng)10大豆品種。
本發(fā)明提供了在缺陷γ-亞麻酸的大豆細(xì)胞中產(chǎn)生γ-亞麻酸的方法。這些方法涉及了在宿主細(xì)胞中有功能性的表達(dá)載體，該表達(dá)載體使Δ6-脂肪酸脫氫酶在宿主細(xì)胞中表達(dá)，使宿主細(xì)胞產(chǎn)生γ-亞麻酸。本發(fā)明還涉及對(duì)大豆種子中γ-亞麻酸的產(chǎn)生進(jìn)行選擇控制。在轉(zhuǎn)化方法上本發(fā)明涉及到抗性篩選和再生芽生根培養(yǎng)的條件?？商岣呱蔬_(dá)到80％。采用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)基因于缺陷γ-亞麻酸的大豆中產(chǎn)生γ-亞麻酸，適用于γ-亞麻酸的大規(guī)模生產(chǎn)和適用于大豆的脂肪酸譜的改變。
圖2顯示畢赤酵母表達(dá)載體pPMICL6，該質(zhì)粒是由質(zhì)粒pPIC3.5K(購(gòu)自Invitrogen公司)和本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有完整的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因(D6D基因)的質(zhì)粒pTMICL6構(gòu)建而成的。質(zhì)粒pPIC3.5K經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切后，電泳回收純化大片段；以pTMICL6質(zhì)粒為模板，PCR獲得5′端帶EcoRI位點(diǎn)，3′端帶NotI位點(diǎn)的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因，用EcoRI和NotI雙酶切，電泳回收純化D6D基因片段，將上述兩個(gè)片段經(jīng)T4DNALigase連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選并鑒定出重組質(zhì)粒，命名為pPMICL6。
圖3顯示煙草表達(dá)載體pGAMICL6，該質(zhì)粒是質(zhì)粒pGA643和本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有完整的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因(D6D基因)的質(zhì)粒pTMICL6構(gòu)建而成的。質(zhì)粒pGA643經(jīng)XbaI和BglII雙酶切后，電泳回收純化大片段；以pTMICL6質(zhì)粒為模板，PCR獲得5′端帶XbaI位點(diǎn)，3′端帶BglII位點(diǎn)的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因，用XbaI和BglII雙酶切，電泳回收純化D6D基因片段，將上述兩個(gè)片段經(jīng)T4DNALigase連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選并鑒定出重組質(zhì)粒，命名為pGAMICL6。質(zhì)粒pGA643源自文獻(xiàn)GynheungAN，Paul R.Ebert，Amitava Mitra and Sam HA.(1988)Binary rectors.Plant MolecularBiology Manual，A31-19。
圖4顯示大豆表達(dá)載體pBMICL6，該質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程見實(shí)施例2。質(zhì)粒pBI121源自文獻(xiàn)Jefferson RA.Tony AK，Michael WB.(1987a).Gus fusionsβ-glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J.，6(13)1301-1307。
根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)中不同物種Δ6-脂肪酸脫氫酶核苷酸序列比較，大都具有電子傳遞功能的細(xì)胞色素b5區(qū)(Cytb5)、和組氨酸(His)保守區(qū)I、II、III區(qū)的保守序列。我們根據(jù)Cytb5區(qū)(HPGG)和His保守區(qū)III(QIEHHLFP)的氨基酸序列設(shè)計(jì)克隆深黃被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶核苷酸序列的部分引物和全長(zhǎng)引物部分引物(依據(jù)結(jié)構(gòu)基因的兩個(gè)保守區(qū)Cytb5和HisIII)上游引物5，-TTTGTCCCTGATCATCCCGGTGG-3，下游引物5，-AGGGAACAAGTGGTGGTCAATCTG-3，全長(zhǎng)引物(依據(jù)結(jié)構(gòu)基因的起始和終止區(qū)核苷酸序列)上游引物5’>TAGGCTGAATTCATGGCTGCTGCTCCCAGTGTGAGGACG<3’下游引物5’>AACTGCCTCGAGTTACTGCGCCTTACCCATCTTGGAGGC<3’于下面的反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR反應(yīng)體系(25ul)，于0.2ml薄壁管內(nèi)進(jìn)行

按如下PCR反應(yīng)程序進(jìn)行
程序1(cycle1) 94℃ 2min程序2(cycle2～36) 94℃ 1min，46℃ 100s，72℃ 100s程序3(cycle37) 72℃ 15min使用部分引物在cDNA上進(jìn)行的PCR產(chǎn)生一條大小約1.0kb的特異帶，經(jīng)測(cè)序該核苷酸長(zhǎng)度為1071bp。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)該核苷酸序列含有Cytb5和HisI、II、III區(qū)，證明克隆的cDNA片段為Δ6-脂肪酸脫氫酶核苷酸序列的一部分。
使用全長(zhǎng)引物在cDNA上進(jìn)行的PCR產(chǎn)生一條大小約1.4kb的片段，經(jīng)測(cè)序和比較該核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)含有Cytb5和HisI、II、III區(qū)，證明克隆的cDNA片段為Δ6-脂肪酸脫氫酶核苷酸序列。測(cè)序結(jié)果表明深黃被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶結(jié)構(gòu)基因全長(zhǎng)為1374個(gè)核苷酸，共編碼457個(gè)氨基酸，膜脫氫酶所共有的三個(gè)組氨酸保守區(qū)，分別在氨基酸序列的172～176，209～213，395～402處，推導(dǎo)出的氨基酸序列與已知的藍(lán)細(xì)菌(Reddy A S.et al.，Plant Mol.Biol.1993，27293～300)、植物琉璃苣(Sayanova O.etal.Proc.Natl.Acad Sci.USA1997，944211～4216)、線蟲(Napier J A.et al.Biochem.J.1998，330611～614)的Δ6-脂肪酸脫氫酶相似，與高山被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列的最大同源性為94％，與植物琉璃苣為53％，與線蟲為55％。正如其它物種Δ6-脂肪酸脫氫酶一樣，在氨基酸序列的N末端同樣含有類似于細(xì)胞色素b5區(qū)域的蛋白序列HPGG。該序列即為Δ6-脂肪酸脫氫酶結(jié)構(gòu)基因SEQ ID NO1(Genbank接受號(hào)為AF306634)。實(shí)施例2 深黃被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因在大豆轉(zhuǎn)化中表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)例只限于pBMICL6的構(gòu)建從質(zhì)粒pTMICL6上PCR獲得5′端帶XbaI位點(diǎn)，3′端帶SacI位點(diǎn)的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因，用XbaI和SacI酶切，將PCR產(chǎn)物中的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因片段替換GUS基因而克隆進(jìn)pBI221質(zhì)粒中。形成新的質(zhì)粒pBI221MICL6，使該基因處于CaMV35S啟動(dòng)子(或β-伴球蛋白種子啟動(dòng)子)的控制下，然后通過(guò)HindIII和EcoRI限制位點(diǎn)將含有CaMV35S啟動(dòng)子的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的DNA片段克隆進(jìn)另外一個(gè)含有卡那霉素選擇性標(biāo)記的載體pBI121質(zhì)粒中，構(gòu)建出含Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的質(zhì)粒pBMICL6(見圖4)。通過(guò)電轉(zhuǎn)化技術(shù)，將該表達(dá)載體質(zhì)粒引入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，以此菌對(duì)植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。實(shí)施例3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化(1)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及制備從4℃保存的平板上挑取含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌單菌落接入含有50mg/LKan，25mg/L Rif，25mg/L Str的YEP培養(yǎng)基，28℃，160r/min振蕩培養(yǎng)18-20h左右至對(duì)數(shù)期，然后用MS(.Mtuashige T，Skoog F.Physiol Plant，1962，21473-479)液體培養(yǎng)基將菌液稀釋5-10倍，作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的工程菌液。
(2)無(wú)菌苗的培養(yǎng)挑取無(wú)病斑，種皮完好的大豆種子，經(jīng)清水浸泡過(guò)夜后，70％乙醇消毒1min，10-15％次氯酸鈣消毒15min，無(wú)菌水沖洗3-4次，去種皮，置于1/2MS固體培養(yǎng)基，25-30℃培養(yǎng)，幾天后獲得無(wú)菌苗。
(3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化直接誘導(dǎo)再生植株和愈傷組織的誘導(dǎo)，所用各種添加不同生長(zhǎng)激素6BA+IBA(6-芐基氨基嘌呤+吲哚丁酸)的MS培養(yǎng)基。
切取無(wú)菌苗的子葉、子葉節(jié)、胚軸、真葉，分別采用多點(diǎn)注射和浸泡的方法感染。接種于相應(yīng)的MS培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)2-3d，轉(zhuǎn)入含有50mg/L Kan和500mg//L Cef(頭胞霉素) 的MS培養(yǎng)基中，二周繼代一次，在創(chuàng)口處長(zhǎng)出叢生芽，叢生芽逐漸長(zhǎng)大形成再生植株。由于大豆基因型、取材部位的不同，出芽率和轉(zhuǎn)化率有差異(見表1)。
表1不同大豆品種和不同外植體對(duì)誘導(dǎo)叢生芽的影響Table 1 The affection of adventitious bud on soybean genetype and explant品種 外植體 接種數(shù) 出芽數(shù) 出芽率卡那抗性 轉(zhuǎn)化率CultivarsExplantInfectionNumber ofRate of Kan resistanceRate ofnumber adventitious adventitioustransformationbud bud吉育43 子葉 86 00 0 0Jiyu43 子葉節(jié) 84 179 213 1517.9胚軸 86 162 188 1112.8真葉 86 00 0 0黑農(nóng)36 子葉 20 00 0 0heinong36子葉節(jié) 20 38 190 2 10.0胚軸 19 31 163 1 5.3真葉 20 00 0 0黑農(nóng)37 子葉 119 00 0 0heinong37子葉節(jié) 120 230 192 1613.3胚軸 120 207 173 9 7.5真葉 120 00 0 0從表1可以看出，子葉節(jié)易于誘導(dǎo)叢生芽，叢生芽數(shù)目最高達(dá)7個(gè)之多，胚軸也易于誘導(dǎo)叢生芽，但子葉和真葉分化叢生芽困難。從子葉節(jié)和胚軸誘導(dǎo)出叢生芽的時(shí)間大致相似，叢生芽的數(shù)目前者高于后者，后者再生植株多細(xì)小。從表1中還可以看出，不同基因型的大豆誘導(dǎo)叢生芽數(shù)差異明顯，吉育43出芽率較高。因此，采用子葉節(jié)和胚軸誘導(dǎo)叢生芽是最佳選擇。
從子葉節(jié)和胚軸誘導(dǎo)出叢生芽長(zhǎng)到2cm時(shí)，將叢生芽切下其基部采用生根粉浸潤(rùn)，轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基〔MS+VB6(1mg/L)+煙酸(1mg/L)+硫胺素(10mg/L)+肌醇(100mg/L)+Cef(500mg/L)+IBA(1.5mg/L)pH5.8)。待叢生芽長(zhǎng)出主根后將再生苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(混合的富營(yíng)養(yǎng)土)中培養(yǎng)。實(shí)施例4 卡那霉素對(duì)大豆選擇壓力的試驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)所用大豆品種為吉林43、黑農(nóng)36和黑農(nóng)37，表達(dá)載體為pBMICL6，植物篩選標(biāo)記基因?yàn)榭敲顾乜剐曰?，配制濃度分別為0mg/L，5mg/L，25mg/L，50mg/L，75mg/L，100mg/L的卡那霉素，在遺傳轉(zhuǎn)化中進(jìn)行大豆愈傷組織生長(zhǎng)和分化再生芽的選擇壓力試驗(yàn)。接種生長(zhǎng)發(fā)育基本一致的胚性愈傷10個(gè)/皿(設(shè)5個(gè)重復(fù))，在加有不同濃度Kan的分化培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)四周。接種分化再生芽3個(gè)/瓶(設(shè)10個(gè)重復(fù))，在加有不同濃度Kan的分化培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)四周。25-30℃培養(yǎng)，12h光照培養(yǎng)，觀察愈傷生長(zhǎng)和分化再生芽的變化情況(見圖5)。
圖5表明25-50mg/L的Kan濃度對(duì)大豆胚性愈傷組織和分化再生芽均達(dá)到50％的抑制作用，特別是在Kan濃度為50mg/L時(shí)，再生芽的生存率低于15％。所以，本轉(zhuǎn)化研究中，開始所用的Kan篩選濃度為50mg/L，待再生芽長(zhǎng)至2cm高時(shí)，在生根培養(yǎng)基中將Kan完全去除。實(shí)施例5 轉(zhuǎn)基因大豆的分子生物學(xué)檢測(cè)(1)轉(zhuǎn)基因大豆的PCR檢測(cè)取卡那霉素篩選過(guò)的抗性愈傷和再生植株，用CTAB法(.傅榮昭，孫勇如，賈士榮主編，植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)手冊(cè)，中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1994)提取總DNA，用于PCR技術(shù)擴(kuò)增Δ6-脂肪酸脫氫酶的基因。
兩個(gè)引物序列是5′-GGCTTCTAGAATGGCTGCTGCTCCCAGT-3′和5′-CTGCGAGCTCTTACTGCGCCTTACC-3′。PCR反應(yīng)條件是95℃變性5min，然后在94℃變性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min的條件下進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10min。電泳結(jié)果見圖6。
(2)轉(zhuǎn)基因大豆植株的southern檢測(cè)大量提取PCR反應(yīng)陽(yáng)性大豆轉(zhuǎn)基因苗的總DNA，HindIII充分酶切后，經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜等步驟，與地高辛標(biāo)記的Δ6-脂肪酸脫氫酶的基因探針雜交，具體試驗(yàn)步驟見試劑盒使用說(shuō)明書。雜交結(jié)果見圖7和8。
(3)轉(zhuǎn)基因大豆黑農(nóng)37T0代種子的氣相色譜(GC)分析轉(zhuǎn)基因大豆種子經(jīng)去離子水洗滌三次，50℃烘干。研碎后，加入5％的KOH-CH3OH溶液，70℃反應(yīng)3h，再加入14％BF3-CH30H，70℃反應(yīng)1.5h，形成脂肪酸甲酯。用1∶4的氯仿己烷抽提兩次，合并提取液。加入適量無(wú)水Na2SO4干燥提取液，靜置1h，去掉Na2SO4，用氮?dú)獯蹈伞Ｓ蒙僭S正己烷回溶，備用。以Sigma公司生產(chǎn)的GLA甲酯為標(biāo)準(zhǔn)品，正己烷為溶劑測(cè)定樣品。儀器為島津GC-7A，柱子DEGS 0.25mm×25m，分流比100∶1，柱溫180℃，尾吹50ml/min，氣化室溫度250℃，檢測(cè)器氫火焰離子化檢測(cè)。
測(cè)定結(jié)果見附圖9。根據(jù)截面積計(jì)算黑農(nóng)37大豆T0代種子中r一亞麻酸含量為多不飽和脂肪酸的18.2％。
權(quán)利要求
1.一種在缺陷或缺乏γ-亞麻酸的生物體產(chǎn)生γ-亞麻酸的方法，其特征在于它包括用一種從真菌中分離的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因并轉(zhuǎn)化到缺陷或缺乏γ-亞麻酸的生物體中表達(dá)和增加γ-亞麻酸含量，所述的真菌為深黃被孢霉M6-22(Mortierella isabellina M6-22)，其中Δ6-脂肪酸脫氫酶基因結(jié)構(gòu)為SEQ ID NO1(Genbank接受號(hào)為AF306634)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在缺陷或缺乏γ-亞麻酸的生物體產(chǎn)生γ-亞麻酸的方法，其特征在于所述的生物體是低等真核生物的酵母菌、高等植物中的煙草、大豆和油菜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的在缺陷或缺乏γ-亞麻酸的生物體產(chǎn)生γ-亞麻酸的方法，其特征在于所述的酵母菌為釀酒酵母INVSCl(Saccharomycescereviciae INVScl)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris GS115)，表達(dá)載體分別為pYMICL6和pPMICL6(見


圖1，2)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的在缺陷或缺乏γ-亞麻酸的生物體產(chǎn)生γ-亞麻酸的方法，其特征在于所述的煙草為Nicotiana tabacum cv.xanthi和N.tabacumcv.YN(云南大金元)，表達(dá)載體分別為pGAMICL6和pBMICL6(見圖3，4)；所述的大豆為吉林35、吉林37和吉林43大豆、黑農(nóng)37和綏農(nóng)10，表達(dá)載體為pBMICL6，所述的表達(dá)載體的啟動(dòng)子為CaMV35S或β-伴球蛋白大豆種子啟動(dòng)子，將帶有Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的重組的表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法感染大豆的子葉節(jié)和胚軸誘導(dǎo)出叢生芽和再生植株；所述的油菜為甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)99F045C、99F044C和99F057C三系雜交組合的恢復(fù)系，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)恢復(fù)系子葉柄進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化獲得再生植株。
5.一種產(chǎn)生高γ-亞麻酸含量的大豆的方法，其特征在于1)用一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大豆細(xì)胞，所述的表達(dá)載體含有SEQ ID NO1(Genbank接受號(hào)為AF306634)的Δ6-脂肪酸脫氫酶結(jié)構(gòu)基因，所述的表達(dá)載體為雙元載體pBMICL6(見圖4)，啟動(dòng)子為組成型的CaMV35S或特異性大豆β一伴球蛋白種子啟動(dòng)子，選擇標(biāo)記為卡那霉素或潮霉素；2)將帶有Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的重組的表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法感染大豆的子葉節(jié)和幼胚誘導(dǎo)出叢生芽和再生植株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)生高γ-亞麻酸含量的大豆的方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化方法是從子葉節(jié)和胚軸誘導(dǎo)出的叢生芽，在50mg/L Kan篩選培養(yǎng)基中連續(xù)篩選，再生芽的生存率為15％，待叢生芽生長(zhǎng)至2cm高時(shí)轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中，降低Kan濃度為25％或完全去除。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的產(chǎn)生高γ-亞麻酸含量的大豆的方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化方法是將再生苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基之前，先將其基部切去采用生根粉浸潤(rùn)，再放入不含卡那霉素的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待再生苗在生根培養(yǎng)基中長(zhǎng)出主根后，轉(zhuǎn)入蛭石或土壤中。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)生高γ-亞麻酸含量的大豆的方法，其特征在于所述的大豆為吉林35、吉林43、吉林47、黑農(nóng)37和綏農(nóng)10大豆品種。
9.權(quán)利要求5所述的產(chǎn)生高γ-亞麻酸含量的大豆的方法，其特征在于所述的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因是通過(guò)RT-PCR方法獲得的全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)基因，其核苷酸長(zhǎng)度為1374bp，編碼457個(gè)氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及在缺陷或缺乏γ－亞麻酸的生物體產(chǎn)生γ－亞麻酸的方法。從真菌－深黃被孢霉M
文檔編號(hào)A01H1/00GK1415754SQ0215559
公開日2003年5月7日 申請(qǐng)日期2002年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月13日
發(fā)明者李明春, 邢來(lái)君, 胡國(guó)武, 卜云萍, 財(cái)音青格樂, 王廣科 申請(qǐng)人:南開大學(xué)