一種鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含量的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含量的 方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆（Glycine max)是世界上重要的油料糧食作物，其種子油是人類與動(dòng)物營養(yǎng) 以及食品加工業(yè)植物食用油的重要來源。大豆油用量占全世界食用油的31% (Kim and Krishnan，2004)。大豆種子油主要是由甘油和脂肪酸組成的，其中脂肪酸占種子油的90% 以上，主要包括棕櫚酸（16:0)與硬脂酸（18:0)兩種飽和脂肪酸和油酸（18:1)、亞油酸 (18:2)與亞麻酸（18:3)等三種不飽和脂肪酸。脂肪酸的組成及其種類配比決定了種子油 的品質(zhì)。棕櫚酸是飽和脂肪酸，不易消化吸收，人類過度食用，會(huì)造成肥胖和心血管疾病，降 低大豆棕櫚酸含量可以增加大豆的營養(yǎng)價(jià)值。
[0003] 由于棕櫚酸含量是受多基因控制的數(shù)量性狀且易受環(huán)境影響，利用傳統(tǒng)表型鑒 定和育種方法培育低棕櫚酸含量的品種不但需要花費(fèi)很長的時(shí)間，而且難于成功，已經(jīng) 不能夠滿足當(dāng)前優(yōu)質(zhì)大豆育種的發(fā)展。隨著分子標(biāo)記的開發(fā)和使用，分子標(biāo)記輔助選擇 (Molecular marker-assisted selection，MAS)成為可以節(jié)約人力、物力和加速育種進(jìn)程 的有效方法（Cregan et al. 1999)。分子標(biāo)記輔助選擇的最大優(yōu)點(diǎn)為在不需要評(píng)估表型特 征的情況下，通過確認(rèn)是否帶有目標(biāo)基因而鑒定出低棕櫚酸含量的植株。
[0004] 大豆種質(zhì)資源中蘊(yùn)藏著豐富的基因，從育種的物質(zhì)基礎(chǔ)一種質(zhì)資源中發(fā)掘所需要 的優(yōu)異資源及基因可有效促進(jìn)大豆品種改良。作為栽培大豆起源地，我國的大豆種質(zhì)資源 在世界上最為豐富，現(xiàn)保存在國家種質(zhì)資源庫的就有3萬余份，在棕櫚酸含量上變異廣泛 (劉興媛等，作物品種資源，1998)。為了有效的研究和利用我國大豆資源，邱麗娟等（作物 學(xué)報(bào)，2009)構(gòu)建了可代表我國大豆種質(zhì)資源多樣性的核心種質(zhì)，為深入發(fā)掘種質(zhì)資源中蘊(yùn) 藏的優(yōu)異基因、有效拓寬大豆遺傳基礎(chǔ)奠定了材料基礎(chǔ)。
[0005] 關(guān)聯(lián)分析，又稱關(guān)聯(lián)作圖（Association Mapping)，是一種以LD (Linkage Disequlibrium)分析為基礎(chǔ)，直接對(duì)基因型變異和表型變異進(jìn)行分析，從而把那些與性狀 有關(guān)聯(lián)的基因鑒定出來（Khush et al. 2001)的基因定位方法，已成為發(fā)掘與表型相關(guān)分 子標(biāo)記的強(qiáng)有力工具。新型分子標(biāo)記一SNP因?yàn)榫哂性诨蚪M中數(shù)量多、分布廣泛、可高 通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而在近年廣泛用于鑒定多基因控制的復(fù)雜性狀。隨著SNP標(biāo)記數(shù)量的不 斷增多，高通量的SNP分型平臺(tái)相繼推出，包括Goladen Gate和BeadArray (Illumina)， GenomeLab SNP stream(Beckman)和 MegAllele(AfTymetrix)等，其中 Illumina 公司的 BeadArray芯片鑒定技術(shù)具有高效、高通量、成本低、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，適合位點(diǎn)數(shù)從幾十到 幾千的中等通量基因分型研究，實(shí)驗(yàn)成功率>99%，是理想的中高通量基因分型檢測(cè)的解決 方案，目前已被廣泛用于人類、擬南芥、水稻等物種的SNP分型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含量性狀，和/或，篩選或輔助 篩選具有不同棕櫚酸含量的大豆籽粒。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含 量性狀的方法，可包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)大豆基因組中基于Map-6064SNP位點(diǎn)的基因型， 如果為TT純合型、待測(cè)大豆籽粒為候選的具有低棕櫚酸含量性狀的大豆籽粒，如果為CC純 合型、待測(cè)大豆籽粒為候選的具有高棕櫚酸含量性狀的大豆籽粒。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種篩選或輔助篩選具有不同棕櫚酸含量 的大豆籽粒的方法，可包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)大豆基因組中基于Map-6064SNP位點(diǎn)的基 因型，如果為TT純合型、待測(cè)大豆籽粒為候選的具有低棕櫚酸含量性狀的大豆籽粒，如果 為CC純合型、待測(cè)大豆籽粒為候選的具有高棕櫚酸含量性狀的大豆籽粒。
[0009] 上述方法中，所述Map-6064位點(diǎn)的所在基因?yàn)榇蠖够蚪M第5條染色體的 Glyma.05g015400基因；所述Glyma.05g015400基因的核苷酸序列為序列表的序列1 ;所述 Map-6064位點(diǎn)為序列表中序列1的第891位。
[0010] 上述方法中，所述低棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量小于12. 3% ;所述高棕櫚酸含 量指的是棕櫚酸含量可為12. 3%以上。
[0011] 上述方法中，所述檢測(cè)待測(cè)大豆基因組中基于Map-6064SNP位點(diǎn)的基因型的方法 可包括：（1)提取大豆基因組DNA。（2)加入Map-6064探針組，進(jìn)行等位基因特異性延伸和 連接酶連接，可以得到一段包含Map-6064SNP位點(diǎn)和地址序列的片段。（3)將得到的片段進(jìn) 行PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增體系中具有Cy3標(biāo)記的dATP、Cy5標(biāo)記的dGTP、dCTP和dTTP)后與芯片 (美國11 lumina公司產(chǎn)品，芯片上具有微珠，微珠表面連接有所述地址序列的互補(bǔ)序列）進(jìn) 行雜交。（4)芯片掃描，利用軟件根據(jù)兩種熒光顏色判讀并輸出分型結(jié)果。從而確定待測(cè)大 豆品種基于Map-6064SNP位點(diǎn)基因型為CC純合型或TT純合型。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)品。
[0013] 本發(fā)明所提供的產(chǎn)品，可為檢測(cè)大豆基因組中基于Map_6064SNP位點(diǎn)的多態(tài)性或 基因型的物質(zhì)；所述產(chǎn)品的功能為如下（a)、（b)或（c):
[0014] (a)鑒定或輔助鑒定大豆籽粒的棕櫚酸含量性狀；
[0015] (b)鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含量性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性；
[0016] (c)篩選或輔助篩選具有不同棕櫚酸含量的大豆籽粒。
[0017] 上述產(chǎn)品中，所述大豆基因組中基于Map-6064SNP位點(diǎn)的基因型可為TT純合型或 CC純合型。
[0018] 上述產(chǎn)品中，所述Map-6064位點(diǎn)的所在基因?yàn)榇蠖够蚪M第5條染色體的 Glyma.05g015400基因；所述Glyma.05g015400基因的核苷酸序列為序列表的序列1 ;所述 Map-6064位點(diǎn)為序列表中序列1的第891位。
[0019] 上述產(chǎn)品中，所述檢測(cè)大豆基因組中基于Map_6064SNP位點(diǎn)的多態(tài)性或基因型的 物質(zhì)可包括Map-6064SNP探針組。
[0020] 上述產(chǎn)品中，所述棕櫚酸含量為高棕櫚酸含量或低棕櫚酸含量；所述高棕櫚酸含 量指的是棕櫚酸含量可為12. 3%以上；所述低棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量小于12. 3%。
[0021] 檢測(cè)大豆基因組中基于Map_6064SNP位點(diǎn)的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在下述 (1)-(6)中的任一應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0022] (1)鑒定或輔助鑒定大豆籽粒的棕櫚酸含量性狀；
[0023] (2)制備鑒定或輔助鑒定大豆籽粒的棕櫚酸含量性狀的產(chǎn)品；
[0024] (3)鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含量性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性；
[0025] (4)制備鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含量性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn) 品；
[0026] (5)篩選或輔助篩選具有不同棕櫚酸含量的大豆籽粒；
[0027] (6)制備篩選或輔助篩選具有不同棕櫚酸含量的大豆籽粒的產(chǎn)品。
[0028] 上述應(yīng)用中，所述⑴和/或所述⑵中，所述大豆籽粒的棕櫚酸含量性狀可為高 棕櫚酸含量性狀或低棕櫚酸含量性狀。所述高棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量可為12. 3 %以 上；所述低棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量小于12. 3%。
[0029] 上述應(yīng)用中，所述⑶和/或所述⑷中，所述大豆籽粒的棕櫚酸含量性狀可為高 棕櫚酸含量性狀或低棕櫚酸含量性狀。所述高棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量可為12. 3 %以 上；所述低棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量小于12. 3%。
[0030] 上述應(yīng)用中，所述（5)和/或所述（6)中，所述具有不同棕櫚酸含量的大豆籽粒 可為具有高棕櫚酸含量性狀的大豆籽粒或具有低棕櫚酸含量性狀的大豆籽粒。所述高棕 櫚酸含量指的是棕櫚酸含量可為12. 3%以上；所述低棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量小于 12. 3%〇
[0031] 上述應(yīng)用中，所述大豆基因組中基于Map-6064SNP位點(diǎn)的基因型可為TT純合型或 CC純合型。
[0032] 上述應(yīng)用中，所述Map-6064位點(diǎn)的所在基因?yàn)榇蠖够蚪M第5條染色體的 Glyma.05g015400基因；所述Glyma.05g015400基因的核苷酸序列為序列表的序列1 ;所述 Map-6064位點(diǎn)為序列表中序列1的第891位。
[0033] 上述應(yīng)用中，所述用于檢測(cè)大豆基因組中基于Map_6064SNP位點(diǎn)的多態(tài)性或基因 型的物質(zhì)可包括Map-6064SNP探針組。
[0034]上述任一所述Map_6064SNP探針組可由探針1、探針2和探針3組成：
[0035] 所述探針1為單鏈DNA分子，探針1的序列如序列表中序列2中的核苷酸所示。
[0036] 所述探針2為單鏈DNA分子，探針2的序列如序列表中序列3中的核苷酸所示。
[0037] 所述探針3為單鏈DNA分子，探針3的序列如序列表中序列4中的核苷酸所示。
[0038] 本發(fā)明中，所述低棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量小于12. 3% ;所述高棕櫚酸含量 指的是棕櫚酸含量可為12. 3%以上。
[0039] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的一種鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含量性狀的方法 可以用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)大豆品種中大豆籽粒棕櫚酸含量的高低。所述高棕櫚酸含量 指的是棕櫚酸含量為12. 3%以上；所述低棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量小于12. 3%。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0041] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] 下述實(shí)施例中所述40個(gè)南方大豆品種和60個(gè)北方大豆品種記載在如下文獻(xiàn)中： 王國勛.中國大豆品種資源目錄.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1982 ;常汝鎮(zhèn)，孫建英.中國大豆 品種資源目錄：續(xù)編一.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1991;常汝鎮(zhèn)，孫建英，邱麗娟，陳一舞.中國大 豆品種資源目錄：續(xù)編二.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996。
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