專利名稱：細(xì)菌水解產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從細(xì)菌生物量(biomass)，特別從包含甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌的細(xì)菌培養(yǎng)物生產(chǎn)可口性(palatability)提高的水解產(chǎn)物的方法。特別發(fā)現(xiàn)此產(chǎn)物在人和動(dòng)物食物用作替代傳統(tǒng)酵母衍生物的養(yǎng)分或口味(flavour)提高劑。
背景技術(shù)：
近來，開發(fā)可摻入人和/或動(dòng)物食用的食物的蛋白質(zhì)新來源引起了很多注意。若干含蛋白質(zhì)的不同物質(zhì)已被建議作為人類食物中更多傳統(tǒng)來源的蛋白質(zhì)，如魚粉，大豆(soya)產(chǎn)品和血漿的替代物，并作為動(dòng)物飼料。這些物質(zhì)包括含蛋白質(zhì)微生物(本文也指“單細(xì)胞蛋白質(zhì)”)如真菌，酵母和細(xì)菌。
單細(xì)胞蛋白質(zhì)物質(zhì)可被直接用于食物，例如作為噴射干燥(spray dried)產(chǎn)物，或者所述生物量可在使用前，例如用技術(shù)如均一化和/或分離，來進(jìn)一步處理。例如，WO01/60974公開生產(chǎn)具有優(yōu)異功能特征的細(xì)菌生物量的均一化衍生物的過程，該衍生物可在數(shù)種食品制備中用作，例如膠凝劑或乳化劑。
今日，大多廣泛應(yīng)用的單細(xì)胞蛋白質(zhì)衍生自真菌或酵母。例如，眾所周知酵母用于釀造，制酒和培烤產(chǎn)業(yè)。數(shù)種酵母加工衍生物也已知用于制備飼料。例如，酵母自溶(autolysis)產(chǎn)生數(shù)種已知的用作食品中調(diào)味料(flavouring)或調(diào)味品(seasoning)的細(xì)胞組分，例如在調(diào)味料(sauce)，肉汁(gravies)等的制備過程中。然而，一般需要相對(duì)大量的酵母自溶物(autolysate)來獲得所需的口感提高的效果。并且，酵母自溶一般緩慢而且需要數(shù)天來完成適宜程度的消化。因此一般需要作為自溶引發(fā)劑(initiator)或刺激劑(stimulator)的添加劑，例如巰基試劑，來加快所述自溶方法。這增加了商業(yè)生產(chǎn)酵母自溶物的成本。
對(duì)能增加人和動(dòng)物食品可口性的替代物質(zhì)，特別是可以大量生產(chǎn)并且成本相對(duì)低的物質(zhì)的需要是持續(xù)的。特別需要能作為口味提高劑的物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在我們驚喜發(fā)現(xiàn)用酶法水解含甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌的生物量，具有生產(chǎn)有效的可口性提高組分，特別是口味組分的效果，該組分也被用作養(yǎng)分，即飼料或飼料組分。
因此，一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)飼料或飼料組分，例如可口性提高制劑的方法，所述方法包含用酶法水解處理包含甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌的微生物培養(yǎng)物。通過此方法生產(chǎn)的水解產(chǎn)物是本發(fā)明的另一方面。
本發(fā)明生產(chǎn)的水解產(chǎn)物通?？杀挥米黥~或貝殼類動(dòng)物(shellfish)的飼料或飼料組分，例如見PCT/GB02/03795描述(其附件隨同遞交)其內(nèi)容引入本文作為參考。類似，所述水解產(chǎn)物可特別被用作寵物食物，特別是狗食的口味提高劑，例如見英國專利申請(qǐng)No.0203907.1描述(其附件隨同遞交)其內(nèi)容引入本文作為參考。
本發(fā)明水解產(chǎn)物特別優(yōu)選用作丸狀可擠壓(extruded)魚食的組分。所述魚食丸通常也包含蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，例如魚粉和魚和/或植物油，及少量碳水化合物，例如植物源淀粉。
本文所用術(shù)語“可口性”包括所有可為人或動(dòng)物感受的食品性狀。這些性狀不僅包括香味，也包括味道和質(zhì)地(texture)。也認(rèn)為術(shù)語“可口性”包括食品的其他性狀，例如可消化性(digestibility)。術(shù)語“可口性提高制劑”被認(rèn)為包括具有所需可口性性狀，或者當(dāng)存在于任何食品時(shí)可有效提高所述食物其他組分的可口性(例如口味)的物質(zhì)。
在存在一或多種能夠水解(例如通過水解降解)所述細(xì)胞結(jié)構(gòu)和/或細(xì)胞內(nèi)組分的酶，優(yōu)選能夠水解所述細(xì)胞核酸成分的酶或酶系統(tǒng)時(shí)，進(jìn)行本發(fā)明方法中的水解。本領(lǐng)域技術(shù)人員可很容易地確定能夠進(jìn)行水解的合適的酶和酶系統(tǒng)。優(yōu)選，這些包括能夠水解所述生物量的DNA和/或RNA成分(優(yōu)選所述RNA成分)來生產(chǎn)相應(yīng)的核苷酸，優(yōu)選5′-核苷酸的核酸酶。此酶的實(shí)施例是Enzyme RP-1(得自AmanoPharmaceutical Co.，Ltd.)。Enzyme RP-1是能夠?qū)NA水解為核苷酸如5′-AMP，5′-GMP，5′-CMP和5′-UMP的5′-磷酸二酯酶(E.C.No.2.7.7.16，CAS No.9001-99-4)制備物。
優(yōu)選，具有5′-腺苷脫氨酶活性并因此能夠?qū)?′-AMP轉(zhuǎn)化為5′-IMP的酶可與所述(一或多種)核酸酶組合(同時(shí)或，更優(yōu)選分開，例如順序)使用。已發(fā)現(xiàn)此處理增加了提高所述最終水解產(chǎn)物可口性的效果。Deamizyme 50000(Amano PharmaceuticalsCo.，Ltd.)是此具有5′-腺苷脫氨酶強(qiáng)活性的酶的一個(gè)實(shí)施例。它在pH范圍4.0-7.0是穩(wěn)定的，并且最適pH為約5.6。
在本發(fā)明一方面，能夠水解所述細(xì)胞核酸成分的酶或酶系統(tǒng)可與至少一種能夠進(jìn)行蛋白質(zhì)水解的蛋白酶組合使用。它具有提高所述最終產(chǎn)物的5′-核苷酸成分的效果并也能使任何苦的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物脫去苦味，從而提高味道的開發(fā)。根據(jù)每種酶的性質(zhì)(即最適溫度，pH等)，可同時(shí)使用它們來處理所述細(xì)菌生物量。然而，通常，用所述核酸酶和蛋白酶酶/酶系統(tǒng)處理可分開，例如順序進(jìn)行。適用于本發(fā)明方法的一個(gè)蛋白酶實(shí)施例是Flavourzyme(得自Novo Nordisk A/S，Denmark)。Flavourzyme是真菌蛋白酶/肽酶復(fù)合物，其含有內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶(exoprotease)并能夠在中性或微酸性條件下水解蛋白質(zhì)。其它可用于本發(fā)明方法的蛋白水解酶包括Alcalase(得自NovoNordisk，Denmark)和Promod 298L(Biocatalysts)。然而，這些酶一般不如Flavourzyme優(yōu)選，因?yàn)樗鼈兙哂心芙到?′-核苷酸的磷酸酶的一定程度的次級(jí)活性(secondary activity)。
可進(jìn)行水解并因此產(chǎn)生水解產(chǎn)物的適宜條件依賴于所用酶或酶系統(tǒng)的確切性質(zhì)，它可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。
溫度條件將能夠不失活所述酶就使水解最優(yōu)化，其取決于所選用于所述方法的酶或酶系統(tǒng)。通常，用于水解的溫度將在30-75℃，優(yōu)選40-70℃的范圍。如果用較低的溫度(例如低于約35℃)，水解就進(jìn)行得很慢。為避免所述分解酶的失活，所述溫度應(yīng)優(yōu)選不超過約70℃。為將RNA分解為5′-核苷酸，在用核酸酶，Enzyme RP-1時(shí)，在約65℃獲得最適產(chǎn)出。
水解的pH條件將類似取決于所選用于所述方法的酶或酶系統(tǒng)。用于水解的合適pH范圍可在4.0-7.0，優(yōu)選5.0-6.0的范圍。在用酶RP-1來水解RNA時(shí)，優(yōu)選的pH在5.5±0.25。為在水解中將所述生物量的pH維持在所需范圍內(nèi)，所需加入的任何酸的性質(zhì)、量和時(shí)間可很容易由那些本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。調(diào)節(jié)pH的合適的酸包括硫酸，鹽酸等。
所述水解產(chǎn)物可以連續(xù)或分批(batchwise)方法來生產(chǎn)。優(yōu)選以連續(xù)方式生產(chǎn)。
用任何已知酶或酶系統(tǒng)處理的反應(yīng)時(shí)間通常在30分鐘到24小時(shí)的范圍。優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間為約1.5-2小時(shí)。更長的反應(yīng)時(shí)間一般使所述產(chǎn)物的水解程度增加，并已經(jīng)發(fā)現(xiàn)降低最終水解產(chǎn)物味道中的任何苦味。
在任何已知條件產(chǎn)生水解產(chǎn)物所需要的任何已知酶的量由那些本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。一般，可預(yù)計(jì)該量為0.001-0.5％，例如0.03-0.25％(基于所述生物量的重量)。
所述水解步驟一般在攪拌釜反應(yīng)器或活塞流反應(yīng)器中進(jìn)行。
本文所述水解方法可預(yù)計(jì)產(chǎn)出的產(chǎn)物，其包含70-95重量％，例如約75重量％的不可溶物質(zhì)(例如包含細(xì)胞壁碎片等)，和5-30重量％，例如約10-20重量％的可溶物質(zhì)(本文也指“可溶部分”)，該可溶物質(zhì)通常包含5′-和3′-核苷酸(主要是5′-核苷酸，例如5′-核糖核苷酸)。進(jìn)行本發(fā)明步驟時(shí)，特別優(yōu)選產(chǎn)生的水解產(chǎn)物是富含天然核糖核苷酸，如鳥嘌呤5′-單磷酸鹽(5′-GMP)和次黃嘌呤(inosine)5′-單磷酸鹽(5′-IMP)的那些。
在本發(fā)明優(yōu)選方面中，所述生物量可在酶水解前被預(yù)處理，從而使所述細(xì)胞打開(open up)(即增加所述細(xì)胞膜的滲透性)。這可通過若干方式來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選，預(yù)處理可采取熱休克處理的形式，其中所述生物量在溫度70-140℃，優(yōu)選80-135℃，例如85-90℃，被加熱30秒-15分鐘，例如約2分鐘。不希望受理論限制，人們認(rèn)為該處理通過所述細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的變性來增加細(xì)胞膜的滲透性，因而使核酸的部分從所述細(xì)胞滲透到所懸浮的培養(yǎng)基。
用于本發(fā)明方法的細(xì)菌生物量可通過所述細(xì)菌在合適培養(yǎng)基或底物上生長來形成。用來生產(chǎn)所述生物量的所述生長培養(yǎng)基的確切性質(zhì)對(duì)于本發(fā)明的表現(xiàn)并不關(guān)鍵，可使用數(shù)種合適的底物。
便利的是，用于本發(fā)明方法的單細(xì)胞物質(zhì)可用發(fā)酵方法來生產(chǎn)，在該方法中將氧和合適的底物如液體或氣態(tài)烴(hydrocarbon)，醇或碳水化合物，例如甲烷，甲醇或天然氣，和營養(yǎng)礦物溶液一起加到(are fed)含所述一或多種微生物的管狀反應(yīng)器。本領(lǐng)域已知并且描述了若干此種方法，例如WO01/60974，DK-B-170824，EP-A-418187和EP-A-306466。特別優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明水解的生物量，其生產(chǎn)見PCT/GB02/003798描述(其附件隨同遞交)其內(nèi)容在此引入本文作為參考。
特別優(yōu)選用于本發(fā)明的是單細(xì)胞蛋白物質(zhì)，其衍生自烴部分(fractions)或天然氣的發(fā)酵物。特別優(yōu)選的是衍生自天然氣發(fā)酵物的單細(xì)胞蛋白。當(dāng)發(fā)酵罐中微生物的濃度增加，就取出所述反應(yīng)器內(nèi)含物或培養(yǎng)液的一部分，并且可用本領(lǐng)域已知技術(shù)，例如通過離心和/或超濾分離所述微生物。便利的是，在此發(fā)酵步驟中，從所述發(fā)酵罐中連續(xù)取出所述培養(yǎng)液，并且培養(yǎng)液的細(xì)胞濃度為1-5重量％，例如約3重量％。
可用本發(fā)明方法處理從兩種或更多微生物生產(chǎn)的單細(xì)胞物質(zhì)。盡管可在同一或分開的發(fā)酵罐中生產(chǎn)，一般會(huì)在同一的發(fā)酵罐中在相同的發(fā)酵條件下生產(chǎn)。用分開的發(fā)酵方法生產(chǎn)的物質(zhì)可在本發(fā)明水解步驟前混合。
優(yōu)選用于本發(fā)明的細(xì)菌包括莢膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus，M.capsulatus)(Bath)，原來從英格蘭巴斯(Bath)的熱噴泉分離的嗜熱(thermophilic)細(xì)菌，它保藏在國立工業(yè)海洋細(xì)菌收藏所(The NationalCollections of Industrial and Marine Bacterium)，Aberdeen，Scotland，作為NCIMB 11132。莢膜甲基球菌(Bath)在約45℃最適生長，盡管在37℃-52℃之間可以出現(xiàn)生長。該細(xì)菌是革蘭氏陰性的，不能動(dòng)(non-motile)球形細(xì)胞，通常成對(duì)出現(xiàn)。它的細(xì)胞內(nèi)膜以I型甲烷營養(yǎng)菌所特有的成束的囊狀盤(bundles of vesicular discs)來排列。莢膜甲基球菌(Bath)基因上是無已知質(zhì)粒的很穩(wěn)定的生物體。它可利用甲烷或甲醇來生長并且利用氨，硝酸鹽或分子氮作為蛋白質(zhì)合成的氮源。
用天然氣作為單個(gè)碳和能量來源的發(fā)酵方法的一個(gè)實(shí)施例在EP-A-306466(Dansk Bioprotein)中描述。此方法是基于持續(xù)發(fā)酵靠甲烷生長的所述甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌莢膜甲基球菌?？諝饣蚣冄醣挥糜谘鹾?oxygenation)并且氨被用作氮源。除了這些底物，所述細(xì)菌培養(yǎng)物通常需要水，磷酸鹽(例如磷酸)和若干礦物質(zhì)，其可包括，通常以硫酸鹽，氯化物或硝酸鹽應(yīng)用的鎂，鈣，鉀，鐵，銅，鋅，錳，鎳，鈷和鉬。所有在生產(chǎn)所述單細(xì)胞物質(zhì)中使用的礦物質(zhì)的質(zhì)量應(yīng)該為食品級(jí)別(food-grade)。
盡管其組分(composition)對(duì)于不同氣體域(field)會(huì)變化，天然氣主要由甲烷組成。通常，可希望天然氣包含約90％的甲烷，約5％的乙烷，約2％的丙烷和一些更高級(jí)(higher)的烴。在天然氣發(fā)酵過程中，甲烷被甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌氧化為生物量和二氧化碳。甲醇，甲醛和甲酸是代謝中間產(chǎn)物。甲醛和某種程度上的二氧化碳被吸收(assimilated)到生物量內(nèi)。然而，甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌不能利用含碳碳鍵的的底物來生長，并且天然氣的剩余組分，即乙烷，丙烷和某種程度更高級(jí)的烴灰分被甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌氧化產(chǎn)生相應(yīng)的羧酸(例如乙烷被氧化為乙酸)。此產(chǎn)物可抑制甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌，因此在生產(chǎn)所述生物量時(shí)，重要的是它們的濃度要保持低，優(yōu)選低于50mg/l。此問題的一個(gè)解決辦法是組合使用一或多種異養(yǎng)型(heterotrophic)細(xì)菌，該細(xì)菌能利用由所述甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌生產(chǎn)的代謝產(chǎn)物。此細(xì)菌也能夠利用所述細(xì)胞裂解釋放到發(fā)酵培養(yǎng)液中的有機(jī)物質(zhì)。為避免泡沫形成這是重要的，并且這也使所述培養(yǎng)物被不需要的細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)降到最低。甲烷營養(yǎng)型和異養(yǎng)型細(xì)菌的組合可得到穩(wěn)定并且高產(chǎn)的培養(yǎng)物。
用于本發(fā)明的合適異養(yǎng)型細(xì)菌包括DB3，菌株NCIMB 13287(Ralstoniasp.以前叫做Alcaligenes acidovorans)；DB5，菌株NCIMB 13289(Brevibacillus agri以前叫做堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus))和DB4，菌株NCIMB 13288(Aneurinibacillus sp.以前叫做短芽孢桿菌(Bacillus brevis))，其每種都在約45℃的溫度最適生長。
DB3是革蘭氏陰性，需氧的，能動(dòng)桿菌，它屬于Ralstonia屬，其可利用乙醇，乙酸鹽，丙酸鹽和丁酸鹽來生長。DB4是革蘭氏陽性，形成孢子內(nèi)壁(endospore-forming)，需氧的芽孢桿菌，它屬于Aneurinibacillu，其可利用乙酸鹽，D-果糖，D-甘露糖，核糖和D-塔格糖。DB5是革蘭氏陽性，形成內(nèi)生孢子，能動(dòng)型，需氧芽孢包桿菌，它屬于短芽孢桿菌屬，其可利用乙酸鹽，N-乙酰-葡糖胺，檸檬酸鹽，葡萄糖酸，D-葡萄糖，甘油和甘露醇。
用于本發(fā)明的單細(xì)胞蛋白質(zhì)物質(zhì)特別優(yōu)選是微生物培養(yǎng)物，它由甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌可選與一或多種異養(yǎng)型細(xì)菌組合，特別優(yōu)選甲烷營養(yǎng)型和異養(yǎng)型細(xì)菌的組合。本文所用術(shù)語“甲烷營養(yǎng)型”包括任何利用甲烷，甲醇或甲醛來生長的細(xì)菌。術(shù)語“異養(yǎng)型”用于描述利用甲烷，甲醇或甲醛之外的有機(jī)底物來生長的細(xì)菌。
特別優(yōu)選用于本發(fā)明的是包含如下組合物的微生物培養(yǎng)物甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌莢膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)，和所述異養(yǎng)型細(xì)菌DB3(菌株NCIMB 13287)和DB5(菌株NCIMB 13289)，它們可選與DB4(菌株NCIMB13288)組合。DB3的作用是利用莢膜甲基球菌(Bath)從天然氣中的乙烷和丙烷生產(chǎn)的乙酸和丙酸。DB3可占所得生物量總細(xì)胞計(jì)數(shù)的最多10％，例如約6-8％。DB4和DB5的作用是利用培養(yǎng)基中的分解產(chǎn)物和代謝產(chǎn)物。通常，DB4和DB5均占持續(xù)發(fā)酵中細(xì)胞計(jì)數(shù)的1％以下。
在生產(chǎn)所述單細(xì)胞物質(zhì)過程中，一般調(diào)節(jié)所述發(fā)酵混合物的pH到約6-7，例如6.5±0.3。本領(lǐng)域技術(shù)人員可很容易選擇調(diào)節(jié)pH的合適的酸/堿。特別合適的用于此方面的是氫氧化鈉和硫酸。在發(fā)酵過程中發(fā)酵罐內(nèi)的溫度優(yōu)選保持在40℃-50℃，最優(yōu)選45℃±2℃。
用于制備所述單細(xì)胞物質(zhì)的合適發(fā)酵罐是那些環(huán)狀(loop-type)，如Dansk Bioprotein的DK 1404/92，EP-A-418187和EP-A-306466所述的那些，或氣升式(air-lift)反應(yīng)器。具有靜止混合物(static mixer)的環(huán)狀發(fā)酵罐室由于其活塞流動(dòng)的特性使氣體的利用率高(例如至多95％)。在沿所述環(huán)的數(shù)個(gè)位置導(dǎo)入氣體并保留與所述液體接觸直到它們?cè)诜磻?yīng)器頂部(headspace)分離。用2-3％生物量(以干重為基)和稀釋率0.02-0.50h-1，例如0.05-0.25h-1來連續(xù)發(fā)酵。
其他發(fā)酵罐可在制備所述單細(xì)胞物質(zhì)中使用，它們包括管狀(tubular)和攪拌釜發(fā)酵罐。
典型地，通過發(fā)酵天然氣生產(chǎn)的生物量將包含為60-80重量％的粗蛋白質(zhì)；為5-20重量％的粗脂肪；為3-10重量％的灰分；為3-15重量％的核酸(RNA和DNA)；10-30g/kg的磷；至多350mg/kg的鐵；和最多120mg/kg的銅。特別優(yōu)選，所述生物量包含為68-73重量％，例如約70％的粗蛋白質(zhì)；為9-11重量％，例如約10％的粗脂肪；為5-10重量％，例如約7％的灰分；為8-12重量％，例如約10％的核酸(RNA和DNA)；10-25g/kg的磷；至多310mg/kg的鐵；和至多110mg/kg的銅。所述蛋白質(zhì)成分的氨基酸分布圖(profile)應(yīng)該是營養(yǎng)性好的(nutritionally favourable)，其中較重要的氨基酸半胱氨酸，蛋氨酸，蘇氨酸，賴氨酸，色氨酸和精氨酸比例高。通常這些氨基酸可分別以約0.7％，3.1％，5.2％，7.2％，2.5％和6.9％的量存在(表示為氨基酸總量的百分比)。一般所述脂肪酸主要包含飽和棕櫚酸(約50％)和單不飽和棕櫚酸(約36％)。所述產(chǎn)物的礦物成分通常包含大量的磷(約為1.5重量％)，鉀(約為0.8重量％)和鎂(約為0.2重量％)。
通常所得生物量以流動(dòng)液體糊或勻漿(slurry)的形式生產(chǎn)。通常它基本包含全細(xì)胞物質(zhì)，盡管一定比例的破裂細(xì)胞物質(zhì)也可能存在。
在所述生物量產(chǎn)生后，一般從所述發(fā)酵培養(yǎng)基，例如用常用的離心和/或過濾方法，例如超濾來濃縮它。濃縮所述生物量可僅用離心來進(jìn)行。在離心過程中，所述生物量成分的干物質(zhì)通常被提高到為約5-18重量％，優(yōu)選為8-15重量％，例如約14％。如果必要，或事實(shí)上需要的話，可用過濾(例如超濾)方法進(jìn)一步提高所述生物量的固體含量?？稍?0-50℃，例如42-46℃的溫度進(jìn)行超濾，并將所述生物量濃縮為包含單細(xì)胞物質(zhì)為10-30重量％，優(yōu)選15-25％，例如18-22％的產(chǎn)物。在超濾中使用的尺寸排阻(size exclusion)一般在約20,000道爾頓。所得生物量將會(huì)是水勻漿的形式并且通常固體含量為10-30重量％，優(yōu)選15-25重量％，例如約20％。
水解之前優(yōu)選用熱處理和/或壓力降低方法來處理所述生物量，來使所述微生物細(xì)胞壁至少部分破裂，從而從所述細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)釋放出部分核酸。
本發(fā)明優(yōu)選方面提供了生產(chǎn)可口性提高物質(zhì)(例如口味提高劑)的方法，所述方法包含下列步驟(a)制備微生物培養(yǎng)物的水勻漿，其包含甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌可選與一或多種異養(yǎng)型細(xì)菌的組合；(b)可選加熱所述勻漿，并且優(yōu)選在溫度70-140℃，更優(yōu)選80-135℃，例如85-90℃，30秒到15分鐘，例如約2分鐘；并且(c)用酶法水解作用處理所得產(chǎn)物。
水解后，優(yōu)選通常在溫度50-75℃，優(yōu)選55-65℃，例如約60℃加熱產(chǎn)物約5分鐘來失活所述分解酶。
所述水解產(chǎn)物包含可溶和不可溶細(xì)胞物質(zhì)的混合物。盡管這可被直接(即無進(jìn)一步加工)用作食品中的組分或前體(例如作為可口性提高調(diào)味組分)，還是優(yōu)選將所述不可溶細(xì)胞物質(zhì)從可溶部分分離。這可以通過本領(lǐng)域已知分離方法，優(yōu)選通過過濾，例如超濾來進(jìn)行?？稍跍囟?5-75℃，例如50-70℃進(jìn)行超濾，可有效濾出能夠穿過所述濾膜的核苷酸和其他小分子。主要用于食品，例如提高可口性制劑生產(chǎn)的是此可溶或可滲透部分。在超濾中所用的尺寸排阻決定滲透物(permeate)的微粒含量，因此根據(jù)所述產(chǎn)物的所需性質(zhì)可選擇所述尺寸排阻。通常，所述尺寸在約20kD的范圍。然而，可用截留分子量(MW cut-off)為10-100kD的濾膜。為提高產(chǎn)物(所得的5′-核苷酸)的產(chǎn)量，可在附加的超濾步驟后用水重復(fù)清洗所述水解產(chǎn)物(例如至多5次，例如至多3次)。
在分離所述水解產(chǎn)物后，所述可溶部分的固體含量預(yù)期為1-3.5重量％，例如2.0-2.1重量％。5′-核苷酸的含量(以固體物質(zhì)為基)預(yù)期為約4-15重量％。
如果需要，所述產(chǎn)物水含量的進(jìn)一步降低可通過本領(lǐng)域已知蒸發(fā)方法來完成。例如，可用它來生產(chǎn)固體含量為15-70重量％，例如約為35重量％的產(chǎn)物。合適的蒸發(fā)方法包括降升膜式(falling-raising film)蒸發(fā)法，降膜式(falling film)蒸發(fā)法和閃蒸法(flash evaporation)。必要的話，所述蒸發(fā)步驟可重復(fù)多次，例如三次。蒸發(fā)過程中如果出現(xiàn)起泡問題，可加入抗起泡劑，如Kimol V39360(得自Gruau Illertissen GmbH，Germany)。需要避免起泡的消泡劑的量可很容易由那些本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。消泡劑的大致的量可為0.01-0.05重量％，例如約0.02重量％。
在蒸發(fā)所述產(chǎn)物后優(yōu)選立即冷卻，例如到5-20℃的溫度，例如約15℃的溫度。
通常，所述產(chǎn)物還用本領(lǐng)域已知的噴霧干燥(spray drying)技術(shù)來處理?？捎萌魏纬Ｓ玫膰婌F干燥器(spray drier)，有或無液化床(fluid bed)單位，例如購自APV Anhydro，Denmark的3型-SPD噴霧干燥器。優(yōu)選，噴霧干燥器的氣體進(jìn)氣口的溫度可為約250℃，出口溫度可為約90℃。優(yōu)選所得產(chǎn)物具有的水含量在約1-10重量％，例如2-7重量％。
所得產(chǎn)物吸濕性極強(qiáng)，因此應(yīng)該貯藏在低溫?zé)o濕氣的環(huán)境中(例如干袋子中)。
本文所述水解方法的結(jié)果是本發(fā)明生產(chǎn)的產(chǎn)物富含核苷酸，特別是5′-核苷酸，例如5′-GMP和5′-IMP，并具有高M(jìn)SG含量。此產(chǎn)物顏色一般為白(pale)到黃，口味(taste)中性，在水中高度可溶(例如完全可溶來生產(chǎn)1％的溫水溶液)。它們特別用作食品中的組分或前體，特別當(dāng)用作可口性提高劑或調(diào)味料時(shí)，例如可提高人或動(dòng)物食物(例如動(dòng)物飼料)的口味。
本發(fā)明另一方面提供了衍生自含甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌生物量的水解產(chǎn)物，該產(chǎn)物核苷酸含量為10-20重量％，例如12-15％(以干物質(zhì)為基)。本發(fā)明優(yōu)選產(chǎn)物的5′-核苷酸含量為4-15重量％，例如10-14％(以干物質(zhì)為基)。優(yōu)選，此產(chǎn)物MSG含量為最多3重量％，例如1-2重量％；蛋白質(zhì)含量為小于70重量％，例如小于60重量％；并且碳水化合物含量為小于20重量％，例如小于12％。
本發(fā)明另一方面提供了本文所述的水解物質(zhì)或其加工衍生物在飼料前體中或作為飼料前體，優(yōu)選作為可口性提高劑，例如作為口味組分的用途。
本發(fā)明另一方面提供了包含本文所述的水解物質(zhì)或其加工衍生物的食品。
當(dāng)用作食品中的可口性提高劑時(shí)，所述水解物質(zhì)或被加工的水解物質(zhì)，將以使其口味和/或氣味可被食用者觀察到的有效量來使用。特別優(yōu)選，將它以提高所述食品可口性的有效量應(yīng)用。通常，可以0.1-1.0重量％，優(yōu)選至多0.5重量％的量來應(yīng)用它。其精確比例依靠幾項(xiàng)因素，不僅僅是該產(chǎn)物所加入的食物的性質(zhì)，應(yīng)用的方式或包括它們的逐項(xiàng)(inclusion)等。合適的水平可容易為本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。
本文所述水解產(chǎn)物可被用作傳統(tǒng)酵母衍生物的替代物。可加入所述產(chǎn)物的食物包括人和動(dòng)物食物。例如，可以將它摻入人食用的食品如湯，肉汁，調(diào)味品(dressings)，肉食品如肉球，乳液如蛋黃醬(mayonnaise)，等。本文所述的產(chǎn)物特別可用于濕和干的寵物食品，優(yōu)選干的寵物食品中的調(diào)味料。例如，它可以用作狗食的添加劑。
本文所述方法的副產(chǎn)物是在分離所述自溶物質(zhì)之后生產(chǎn)的殘留物(retentate)(即不可溶部分)。此產(chǎn)物一般包含組分如細(xì)胞壁碎片并具有高的營養(yǎng)價(jià)值。例如，此產(chǎn)物可具有如下特性水含量(根據(jù)M1011測(cè)定)1-10wt.％，例如約4wt.％；灰分含量(據(jù)歐共體委員會(huì)指示(EU Commission Directive)No.162/67/E F測(cè)定)3-12wt.％，例如約10wt.％；粗脂肪(根據(jù)歐共體委員會(huì)指示No.93/28/E F測(cè)定)10-20wt.％，例如約15wt.％；粗蛋白質(zhì)(根據(jù)歐共體委員會(huì)指示No.72/199/E 測(cè)定)40-60wt.％，例如約54wt.％；RNA(根據(jù)M1052測(cè)定)4-10wt.％，例如約6wt.％；DNA(根據(jù)M1052測(cè)定)2-5wt.％，例如約3wt.％；總氨基酸含量(根據(jù)M2953測(cè)定)39-41wt.％；總碳水化合物(根據(jù)M1404測(cè)定)最多15％wt，例如1-12％wt，通常約10％wt；并且體外可消化性(根據(jù)M1505測(cè)定)65-85％N，例如約65％N。
1樣品中的水在105℃過夜蒸發(fā)。通過干燥之前和之后稱重來測(cè)定所述水含量。
2見Herbert等，Chemical Analysis of Microbial cells，Methods Microbiol.5B285-328，1971。
3見Waters AccQ.Tag Chemistry Package．Instruction Manual 052874TP，Rev.1，和Wandeln等Journal of Chromatography A，763，11-22。
4見Herbert等，Chemical Analysis of Microbial cells，Methods Microbiol.5B267-269，1971。
5見Boiscn，CAB International，p.135-145，1991。
此副產(chǎn)品可用于食品，特別作為動(dòng)物飼料的營養(yǎng)添加劑。此產(chǎn)物及其在食品形式中的用途是本發(fā)明其他方面。
本發(fā)明現(xiàn)用如下非限制性實(shí)施例來更具體地詳述，參考附


圖1，該圖闡述用來實(shí)施本發(fā)明方法的裝置。
實(shí)施例1-制備生物量將包含莢膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)，DB3(菌株NCIMB13287)和DB5(菌株NCIMB 13289)的微生物培養(yǎng)物在環(huán)狀發(fā)酵罐中生產(chǎn)，該生產(chǎn)是通過在氨/礦物鹽培養(yǎng)基(AMS)在45℃，pH 6.5連續(xù)有氧發(fā)酵天然氣進(jìn)行的。每升此AMS培養(yǎng)基含如下物質(zhì)10mg NH3，75mg H3PO4·2H2O，380mg MgSO4·7H2O，100mg CaCl2·2H2O，200mg K2SO4，75mgFeSO4·7H2O，1.0mg CuSO4·5H2O，0.96mg ZnSO4·7H2O，120μgCoCl2·6H2O，48μg MnCl2·4H2O，36μg H3BO3，24μg NiCl2·6H2O和1.20μg NaMoO4·2H2O。
該發(fā)酵罐充滿在125℃被熱處理10秒的水。根據(jù)消耗量(consumption)調(diào)節(jié)加入不同的營養(yǎng)物。隨時(shí)間逐漸積累，用1-3％生物量(以干重為基)來進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。
在工業(yè)連續(xù)離心機(jī)中以3,000rpm離心所述生物量，從而生產(chǎn)含有占生物量約為12重量％的產(chǎn)物。
實(shí)施例2-制備水解產(chǎn)物方法根據(jù)下述方法制備水解產(chǎn)物1.離心沉降(centrifuge down)根據(jù)實(shí)施例1生產(chǎn)的2L生物量(ca.14g/L)，在上清中重懸為約250mL。
2.將所述生物量加溫到80-95℃，15分鐘。
3.冷卻到65℃。
4.將pH調(diào)為5.505.加入56mg Nuclease RP-1。
6.溫育2小時(shí)。
7.將溫度降到50℃。
8.加入36mg Deamizyme 50000。
9.溫育1小時(shí)。
10.加溫到85℃，5分鐘。
11.冷卻到40-50℃。
12.UF過濾(最少50mL產(chǎn)物)。
13.分析所述產(chǎn)物的干物質(zhì)含量，然后凍干。
14.分析所述凍干的產(chǎn)物5′-GMP，5′-IMP，N，OPA，灰分，脂肪，碳水化合物(anthron方法)含量。
結(jié)果分析所得產(chǎn)物并發(fā)現(xiàn)其具有下述特征化學(xué)組合物 干物質(zhì) 94.0-98.0(每100g產(chǎn)物的g數(shù))5′-GMP(HPLC) 5.0-7.55′-IMP(HPLC) 5.0-7.5MSG(酶法) 1.0-3.5氯化鈉 0.0總氮(EA) 8.0-11.0蛋白質(zhì)和核苷酸(N×6.25)50-63總碳水化合物(Anthrone) 10-20灰分(5501)10-15脂肪(EC，84/4/EEC) ＜0.1物理性質(zhì) 溶解度 水中10％pH(10％溶液) 5.0-5.510％溶液顏色 棕色產(chǎn)物顏色 米黃色(beige)實(shí)施例3-制備水解產(chǎn)物方法根據(jù)下述方法制備水解產(chǎn)物1.離心沉降根據(jù)實(shí)施例1生產(chǎn)的2L生物量(ca.14g/L)并在上清中重懸為約250mL。
2.將所述生物量加溫到80-95℃，15分鐘。
3.冷卻到65℃。
4.將pH調(diào)為5.505.加入56mg Nuclease RP-1。
6.溫育2小時(shí)。
7.將溫度降到50℃。
8.加入40mg Deamizyme 50000和252mg Flavourzyme。
9.溫育16小時(shí)。
10.加溫到85℃，5分鐘。
11.冷卻到40-50℃。
12.UF過濾(最少50mL產(chǎn)物)。
13.分析所述產(chǎn)物的干物質(zhì)含量，然后凍干。
14.分析所述凍干的產(chǎn)物5′-GMP，5′-IMP，N，OPA，灰分，脂肪，碳水化合物(anthron方法)，和氨基酸組分。
結(jié)果分析所得產(chǎn)物并發(fā)現(xiàn)其具有下述特征化學(xué)組合物 干物質(zhì) 94.0-98.0(每100g產(chǎn)物的g數(shù))5′-GMP(HPLC) 2.5-3.55′-IMP(HPLC) 2.5-3.5MSG(酶法) 2.0-3.0氯化鈉 0.0氨基氮(OPA) 4.0-5.0總氮(EA)10.0-12.0蛋白質(zhì)和核苷酸(N×6.25) 63-75總碳水化合物(Anthrone) 8-14灰分(5501) 5-10脂肪(EC，84/4/EEC) ＜0.1氨基酸組合物 丙氨酸5.4 精氨酸4.1
(每100g產(chǎn)物的g數(shù))天冬氨酸5.9 半胱氨酸0.5谷氨酸7.4 甘氨酸3.5組氨酸1.3 異亮氨酸2.8亮氨酸4.9 賴氨酸4.9蛋氨酸1.9 苯丙氨酸2.9脯氨酸3.3 絲氨酸2.3蘇氨酸2.8 酪氨酸2.4色氨酸1.1 纈氨酸5.7物理性狀 溶解度 水中10％pH(10％溶液)5.0-5.510％溶液顏色黃產(chǎn)物顏色淺米黃色
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)飼料或飼料組分的方法，所述方法包含用酶法水解作用處理包含甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌的微生物培養(yǎng)物。
2.生產(chǎn)飼料或飼料組分的方法，所述方法包含下述步驟(a)制備微生物培養(yǎng)物的水漿液，其包含甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌可選與一或多種異養(yǎng)型細(xì)菌的組合；(b)可選加熱所述漿液；并且(c)用酶法水解作用處理所得產(chǎn)物。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其還包含分離所述水解產(chǎn)物的步驟。
4.權(quán)利要求1到3任一的方法，其中所述培養(yǎng)物已經(jīng)用甲烷作為碳源來生產(chǎn)。
5.權(quán)利要求1到4任一的方法，其中所述培養(yǎng)物在所述酶法水解作用之前用細(xì)胞裂解來處理。
6.權(quán)利要求5的方法，其中通過壓力降低法來進(jìn)行細(xì)胞裂解。
7.權(quán)利要求1到6任一的方法，其中所述酶法水解作用通過將所述培養(yǎng)物與核酸切割酶接觸來進(jìn)行。
8.權(quán)利要求1到7任一的方法，其中所述酶法水解作用通過將所述培養(yǎng)物與具有5′-腺苷脫氨酶活性的酶接觸來進(jìn)行。
9.權(quán)利要求1到8任一的方法，其中所述酶法水解作用通過將所述培養(yǎng)物與蛋白酶接觸來進(jìn)行。
10.權(quán)利要求1到9任一的方法，其中所述培養(yǎng)物包含莢膜甲基球菌。
11.權(quán)利要求1到10任一的方法，其中所述培養(yǎng)物還包含異養(yǎng)型細(xì)菌。
12.通過權(quán)利要求1到11任一的方法獲得的水解產(chǎn)物。
13.衍生自含甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌的生物量的水解產(chǎn)物，所述產(chǎn)物具有的核苷酸含量為10-20重量％(以干物質(zhì)為基)。
14.權(quán)利要求13的產(chǎn)物，其具有的5′-核苷酸含量為4-15重量％(以干物質(zhì)為基)。
15.權(quán)利要求12到14任一的水解物質(zhì)或其加工衍生物，在飼料前體中或作為飼料前體的用途。
16.一種食品，其包含權(quán)利要求12到14任一的水解物質(zhì)或其加工衍生物。
17.權(quán)利要求16的食品，其為狗食或向其加入的添加劑。
18.權(quán)利要求16的食品，其為魚食。
19.權(quán)利要求18的食品，其為丸狀可擠壓的魚食。
全文摘要
生產(chǎn)飼料或飼料組分，例如可口性提高制劑的方法，所述方法包含用酶法水解作用來處理包含甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌的微生物培養(yǎng)物。
文檔編號(hào)A23K1/00GK1642438SQ03806157
公開日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月12日
發(fā)明者艾納·莫恩, 亨里克·埃里克森, 簡·拉森 申請(qǐng)人:諾弗姆公司