專利名稱：一種水溶性o－殼聚糖衍生物及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水溶性O(shè)-殼聚糖衍生物及其應用。屬于殼聚糖衍生物的應用技術(shù)。
背景技術(shù)：
殼聚糖，這種自然界中迄今發(fā)現(xiàn)的唯一堿性多糖，已被證明對于脂肪具有明顯的吸附作用，并開始被應用于最新的減肥藥物中。在日本殼聚糖減肥藥品發(fā)展迅猛，已有成為減肥藥主流的趨勢。日本厚生省1985年撥款60億日元給一些醫(yī)科大學，作為甲殼素基礎(chǔ)研究和應用開發(fā)的費用。日本的幾丁聚糖保健品“救多善”，1996年進入中國市場，一年就從中國拿回10億人民幣，折合143億日元，是厚生省當年撥款的2.3倍。1999年，《健康產(chǎn)業(yè)新聞》對全日本70家食品店鋪和藥品店鋪調(diào)查了主要暢銷的減肥食品材料，在藥店系統(tǒng)中位居第一的就是殼聚糖減肥藥。
但是殼聚糖作為聚陽離子化合物，一般不能與中性油發(fā)生吸附反應，對脂肪物質(zhì)在胃中會分解的膽固醇、甾醇、甘油三酸酯等中性油吸附能力不強；而且由于殼聚糖與脂肪不能互溶，極大的限制了殼聚糖與脂肪及脂肪酸的相互作用；再者由于殼聚糖在腸道環(huán)境中為不溶解狀態(tài)，降低了對脂肪酸的吸附效率；最后單純使用殼聚糖會引起便秘等副作用。因此人們開始通過對殼聚糖進行改性，提高其溶解性，使用其衍生物來提高吸附油脂的效率，考察其可能潛在的分子水平的減肥機理。本發(fā)明專利涉及的一種水溶性殼聚糖衍生物作為減肥藥物的方法尚未見任何報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種水溶性O(shè)-殼聚糖衍生物及其應用，該殼聚糖衍生物易于制取，用于大鼠減肥具有明顯效果。
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加以實現(xiàn)的所述的水溶性O(shè)-殼聚糖衍生物是以殼聚糖為原材料，合成出的殼聚糖環(huán)碳6位-OH上取代的衍生物，包括O-羧甲基殼聚糖和O-羥乙基殼聚糖，其結(jié)構(gòu)特征是 其中R＝-CH2COOH，或-CH2OH
該殼聚糖衍生物粘均分子量是5萬-100萬，脫乙?；却笥?0％，碳6位O取代度為0.5-0.9，熱分解溫度為220～250℃，溶解度≥10g/100ml水。
上述水溶性O(shè)-殼聚糖衍生物的應用，其特征在于將該水溶性O(shè)-殼聚糖衍生物添加到飼料中喂養(yǎng)大鼠，對大鼠的肥胖具有明顯治療和預防作用1.將這種水溶性O(shè)-殼聚糖衍生物，添加到動物基礎(chǔ)飼料(合成飼料)中，其添加質(zhì)量百分比為2.5-7.5％，用來喂養(yǎng)營養(yǎng)性肥胖大鼠(在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上增加全蛋粉、豬油、膽固醇、奶粉及白糖配制出高脂飼料，以此連續(xù)喂養(yǎng)6周形成營養(yǎng)性肥胖大鼠模型；將70只肥胖動物按照體重隨機分為7組，每組10只。)。
實驗結(jié)果表明自第四周開始治療組(殼聚糖衍生物各劑量添加組)大鼠體重的下降趨勢逐漸突出，至實驗結(jié)束時治療組大鼠體重明顯降低，高劑量組大鼠分別比對照組下降18～35％，體脂含量下降40～80％，差異具有顯著性(P＜0.01)；動物的肝/體比同時明顯下降，各劑量組肝臟膽固醇和脂肪含量均明顯低于喂飼基礎(chǔ)飼料的對照組(P＜0.05)，肝臟膽固醇含量下將40～60％，肝臟脂肪含量下降30～40％；營養(yǎng)性肥胖大鼠糞便中脂肪含量明顯增加，高劑量組大鼠糞脂含量與對照相比增加20～40％(P＜0.01)。
2.將這種水溶性O(shè)-殼聚糖衍生物，添加到高脂飼料中，添加質(zhì)量百分比為5％，用來喂養(yǎng)清潔級SD雄性大鼠(體重60～70g，按體重將動物隨機分為4組，每組10只)。
實驗結(jié)果表明第3周時肥胖模型組大鼠體重明顯高于正常對照組(P＜0.01)，從第5周開始預防組(殼聚糖衍生物添加組)大鼠體重均明顯低于模型組(P＜0.01)，實驗結(jié)束時體重增量比模型組低30～40％；肝膽固醇含量與高脂飼料組大鼠相比下降幅度超過50％，其水平與基礎(chǔ)飼料組相當；殼聚糖衍生物具有降低血糖、升高血清胰島素水平的作用，與高脂飼料組相比較，殼聚糖能夠降低體內(nèi)瘦素的水平；殼聚糖衍生物均能促進脂肪由糞便的排出，與高脂飼料組相比增加35～50％(P＜0.01)。
本發(fā)明制備的殼聚糖衍生物通過對殼聚糖進行改性，增強其在水中的溶解能力和對脂肪、膽固醇等的吸附能力；加之殼聚糖的刺激性、急性毒牲、亞急性毒性、慢性毒性和過敏性通過實驗證明是合格的，使其更適宜作為健康、綠色、源于自然的減肥藥物。而且，水溶性殼聚糖衍生物更容易和膽汁酸結(jié)合并全部排出體外，為了保持膽汁酸正常含量就必須在肝臟中將膽固醇轉(zhuǎn)化膽汁酸，其結(jié)果是血液中的膽固醇含量必然下降，從而使其具有顯著地減肥功能。本發(fā)明殼聚糖減肥產(chǎn)品與市場化的減肥藥物相比，具有天然、無毒、減肥效果明顯而又對人體無副作用等優(yōu)點。本發(fā)明殼聚糖減肥產(chǎn)品可用于肥胖病癥的治療；還可以用于肥胖的預防。
具體實施例方式
實施例一、O-羥乙基殼聚糖的制備
1.殼聚糖的輻射降解分子量108萬、脫乙?；?5％的殼聚糖由Co60輻射源，經(jīng)60kGy輻射劑量的照射，獲得分子量10萬～20萬、脫乙?；?6％的殼聚糖低聚物A。
2.O-羥乙基殼聚糖的制備①N-鄰苯二甲酰殼聚糖的制備0.83g鄰苯二甲酸溶液溶于含有6ml 5％(v/v)水的N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.3g殼聚糖，在氮氣下攪拌并加熱至120℃。反應8小時后，淡棕色混合物冷卻至室溫，然后倒入冰水。過濾后，將沉淀用150ml甲醇洗滌1小時，干燥得到0.444g淡棕色粉末物質(zhì)B。
②O-羥乙基殼聚糖的制備稱取5gB，加入25ml質(zhì)量百分數(shù)為50％的NaOH溶液攪拌均勻，然后置于冰柜中在-18℃放置48小時。解凍后，擠壓出多余的NaOH，然后加入10ml異丙醇，攪拌均勻后，緩慢加入50ml的氯乙醇，在80℃反應24h后，用乙醇洗滌，過濾，使用氫氧化鈉水溶液和一水合肼(N2H4.H2O)脫除氨基保護，干燥得到白色固體粉末。
實施例二、O-羥乙基殼聚糖對肥胖大鼠的治療作用1.飼料配制及營養(yǎng)性肥胖模型的建立選用合成飼料作為動物基礎(chǔ)飼料，在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上增加了全蛋粉、豬油、膽固醇、奶粉及白糖等來調(diào)整飼料中能量、但固醇及脂肪的含量，配制出了高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)6周形成營養(yǎng)性肥胖大鼠模型。
2.動物分組及研究方法待模型構(gòu)建成功之后，將70只肥拌動物按照體重隨機分為7組，每組10只。各組喂飼的飼料如下①肥胖鼠對照組(C組)喂基礎(chǔ)飼料；②O-羥乙基殼聚糖(HECS)減肥實驗組(TA1-3)TA1組基礎(chǔ)飼料+2.5％HECS，TA2基礎(chǔ)飼料+5％HECS，TA3基礎(chǔ)飼料+7.5％HECS；動物采用不銹鋼鼠籠單籠飼養(yǎng)，自由飲水、統(tǒng)一食量，以便控制能量攝入。每周稱一次體重，試驗結(jié)束前一周用代謝籠收集實驗動物72h的糞便，用于測定糞便中的脂肪含量。6周末隔夜禁食，解剖大鼠在相同部位切取部分肝臟用于檢測肝臟脂肪及膽固醇含量；取腎周及睪周脂肪墊，稱重用于計算體脂含量；將心、主動脈弓及部分肝葉置于中性福爾馬林固定液中待做病理檢查。
3.對營養(yǎng)性肥胖大鼠體重及體脂含量的降低作用本次試驗正常對照組與肥胖模型組分別給予基礎(chǔ)飼料和高脂飼料6周后，試驗結(jié)果顯示肥胖模型組的體重增量達到了正常對照組的1.96倍，證明肥胖大鼠模型的建立比較成功。
表1反映了各組間動物體重的動態(tài)變化，實驗初始時各組間大鼠體重比較接近，自第四周開始治療組大鼠體重的下降趨勢逐漸突出，至實驗結(jié)束時殼聚糖添加組大鼠體重比對照組低90.22g，差異具有顯著性(P＜0.01)。
表1 Chitosan 對大鼠體重及體脂含量的影響(x±s)
分N 大鼠體重(g)體脂含量組W1 W4 W6 (％)C10 369.12±34.76 349.45±30.67366.95±24.82 1.0714±0.3520TA1 10 375.08±31.69 347.13±23.79343.07±22.07*0.7336±0.5103TA2 9 382.33±51.71 338.43±37.06323.88±26.47**0.4377±0.2171**TA3 10 371.66±30.37 307.69±27.01**276.73±31.74**0.2291±0.1184***與Control組相比P＜0.05，**與Control組相比P＜0.014.對營養(yǎng)性肥胖大鼠肝臟的影響HECS的加入使大鼠的肝/體比明顯下降，肝臟膽固醇和脂肪含量也明顯低于對照組(P＜0.05)，且隨著HECS添加劑量增高，這種降低作用更為明顯(表2)。
表2 大鼠肝/體比與肝臟脂肪含量情況(x±s)分組 N 肝/體比(％) 肝臟膽固醇含量(μg) 肝臟脂肪含量(％)C103.1191 ±0.2619 347.47±66.72 0.055±0.014TA1 102.8745±0.3276*289.60±48.93*0.039±0.003*TA2 9 2.7432±0.2301**236.82±32.83*0.044±0.006TA3 102.6364±0.1994**194.40±29.27**0.035±0.009**與Control組相比P＜0.05，**與Control組相比P＜0.015.對營養(yǎng)性肥胖大鼠糞便中脂肪含量的影響采用索氏提取的方法測定糞便中脂肪含量，結(jié)果顯示HECS殼聚糖高劑量組大鼠糞脂含量與對照相比增加30～40％，P＜0.01，差異具有顯著性。
實施例四、O-羥乙基殼聚糖對大鼠肥胖的預防作用1.動物分組及研究方法清潔級SD雄性大鼠40只，體重(60～70g)，按體重將動物隨機分為4組，每組10只。正常對照組(C組)喂基礎(chǔ)飼料，肥胖模型組(F組)喂高脂飼料，預防組(P組)喂高脂飼料+5％O-羥乙基殼聚糖。
動物單籠飼養(yǎng)，自由飲水，限制攝食，使每只大鼠平均攝食量相同，以便控制能量攝入。每周稱一次體重，試驗結(jié)束前一周用代謝籠收集實驗動物的糞便，用于測定糞便中的脂肪含量。連續(xù)飼養(yǎng)6周后，解剖大鼠在相同部位切取部分肝臟用于檢測肝臟脂肪及膽固醇含量；取腎周及睪周脂肪墊，稱重用于計算體脂含量；將心、主動脈弓及部分肝葉置于中性福爾馬林固定液中待做病理檢查。
2.對大鼠體重、體脂含量的影響實驗初始時各組間大鼠體重差異不具有顯著性；至第3周時肥胖模型組大鼠體重明顯高于正常對照組，差異具有顯著性(P＜0.01)；從第5周開始可預防組大鼠體重明顯低于模型組，差異具有顯著性(P＜0.01)，至實驗結(jié)束時這種差異更為顯著(表3)。
表3 各組間大鼠體重的變化及體脂含量(x±s)
組 例體重(g) 體脂含量(％)別 數(shù) W1 W3W5W6C 10 103.5±15.37 172.02±8.53d211.18±19.67d212.15±16.82d0.42±0.26dF 8 90.73±9.33193.44±15.84b311.20±23.96b349.11±32.44b0.95±0.21bP 10 104.53±15.33 207.37±13.43bc249.25±13.27bd267.74±14.03bd0.74±0.20ba與基礎(chǔ)飼料組相比P＜0.05，b與基礎(chǔ)飼料組相比P＜0.01c與高脂飼料組相比P＜0.05，d與高脂飼料組相比P＜0.013.對大鼠肝臟脂肪和膽固醇的影響高脂飼料組大鼠肝臟脂肪和膽固醇含量分別為(11.06±3.03)％、(136.20±33.87)g，顯著高于僅喂飼基礎(chǔ)飼料的對照組(3.11±1.44)％、(48.00±27.99)g。預防組大鼠肝臟脂肪及膽固醇含量分別為(5.94±1.26)％、(58.15±27.14)g，與高脂飼料組大鼠相比下降幅度超過50％，其水平與基礎(chǔ)飼料組相當。
4.對大鼠糞脂水平的影響從外觀看來，與基礎(chǔ)飼料組比較，高脂飼料組和殼聚糖添加組大鼠糞便顏色發(fā)白，質(zhì)地稀軟。通過經(jīng)典的索氏提取法測定各組大鼠糞便中總脂肪含量，發(fā)現(xiàn)HECS能促進脂肪由糞便的排出，與高脂飼料組相比分別增加30～40％，P＜0.01，差異具有顯著性。
權(quán)利要求
1.一種水溶性O(shè)-殼聚糖衍生物，它是以殼聚糖為原材料，合成出的殼聚糖環(huán)碳6位-OH上取代的衍生物，包括O-羧甲基殼聚糖和O-羥乙基殼聚糖，其結(jié)構(gòu)特征是該殼聚糖衍生物粘均分子量是5萬-100萬，脫乙?；却笥?0％，碳6位O取代 其中R＝-CH2COOH，或-CH2OH度為0.5-0.9，熱分解溫度為220～250℃，溶解度≥10g/100ml水。
2.一種按權(quán)利要求1所述的水溶性O(shè)-殼聚糖衍生物作為減肥藥物的應用，其特征在于將該水溶性O(shè)-殼聚糖衍生物添加到飼料中喂養(yǎng)肥胖大鼠，對大鼠的肥胖具有明顯治療和預防作用；1)將這種水溶性O(shè)-殼聚糖衍生物，添加到動物基礎(chǔ)飼料中，添加質(zhì)量百分數(shù)為2.5-7.5％，用來喂養(yǎng)營養(yǎng)性肥胖大鼠實驗6周后大鼠體重明顯降低，高劑量組大鼠分別比對照組下降18～35％，體脂含量下降40～80％；動物的肝/體比同時明顯下降，各劑量組肝臟膽固醇和脂肪含量均明顯低于喂飼基礎(chǔ)飼料的對照組，肝臟膽固醇含量下將40～60％，肝臟脂肪含量下降30～40％；營養(yǎng)性肥胖大鼠糞便中脂肪含量明顯增加，高劑量組大鼠糞脂含量與對照相比增加20～40％；2)將這種水溶性O(shè)-殼聚糖衍生物，添加到高脂飼料中，添加質(zhì)量百分數(shù)量為5％，用來喂養(yǎng)清潔級SD雄性大鼠實驗6周后添加組大鼠體重增量比模型組低30～40％；肝膽固醇含量與高脂飼料組大鼠相比下降幅度超過50％，其水平與基礎(chǔ)飼料組相當；殼聚糖衍生物均能促進脂肪由糞便的排出，與高脂飼料組相比增加35～50％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水溶性O(shè)－殼聚糖衍生物及其應用，屬于殼聚糖衍生物應用技術(shù)。所述的水溶性O(shè)－殼聚糖衍生物是以殼聚糖為原材料，合成出的殼聚糖環(huán)碳6位－OH上取代的衍生物，包括O－羧甲基殼聚糖和O－羥乙基殼聚糖。將這種水溶性O(shè)－殼聚糖衍生物，添加到動物飼料中，其添加質(zhì)量百分數(shù)為2.5－7.5％喂養(yǎng)大鼠，對大鼠的肥胖具有明顯的治療和預防作用。本發(fā)明殼聚糖減肥產(chǎn)品具有天然、無毒、減肥效果明顯而又對人體無副作用等優(yōu)點，既可用于肥胖病癥的治療又可以用于肥胖的預防。
文檔編號A23K1/16GK1594367SQ20041001996
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月12日
發(fā)明者劉曉非, 莊旭品, 管云林, 姚康德 申請人:天津大學