專(zhuān)利名稱(chēng)：柱花草9－順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及柱花草9-順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物的生長(zhǎng)發(fā)育受到植物激素的調(diào)節(jié)作用。環(huán)境中的非生物脅迫，例如干旱、鹽堿、冷害和熱害等影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，造成農(nóng)作物的減產(chǎn)，也影響果樹(shù)、花卉、園藝觀賞植物的正常生長(zhǎng)，培育耐逆的植物品種是種植業(yè)的主要目標(biāo)之一。脫落酸(ABA)是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的一種激素，對(duì)植物胚胎發(fā)育、種子休眠、果實(shí)成熟和抗逆性等生理過(guò)程起著重要的調(diào)控作用。ABA通過(guò)誘導(dǎo)氣孔的關(guān)閉降低蒸騰速率，減少植物在逆境條件下的水分喪失。ABA參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)控抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，提高抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，減輕逆境引起的傷害。ABA在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
9-順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)是高等植物ABA生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，催化類(lèi)胡蘿卜素(C40)9-順式紫黃質(zhì)或9-順式新黃質(zhì)發(fā)生氧化裂解，生成ABA的前體物質(zhì)——黃質(zhì)醛，黃質(zhì)醛在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過(guò)兩步催化反應(yīng)生成ABA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種9-順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼上述9-順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶的基因SgNCED1。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述基因SgNCED1的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組微生物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供來(lái)源于上述核苷酸序列的核酸分子探針。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述基因SgNCED1在提供植物耐逆性中的應(yīng)用。
本發(fā)明的基因SgNCED1來(lái)源于柱花草(Stylosanthes guianensis)，該基因的核苷酸序列是以下核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO12)與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
基因SgNCED1編碼的9-順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶蛋白序列，是序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列或與序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少95％的同源性并具有基本相同功能的氨基酸序列。
本發(fā)明的SgNCED1基因進(jìn)行同源基因的克隆；用SgNCED1基因構(gòu)建植物表達(dá)載體；用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物組織或細(xì)胞；將轉(zhuǎn)化的植物組織或細(xì)胞培育成植株。
本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于SgNCED1基因序列，可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在與SgNCED1基因同源的核苷酸序列。
此外，根據(jù)本發(fā)明的SgNCED1核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)同源性的基礎(chǔ)上，篩選NCED同源基因或同源蛋白。
利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的SgNCED1基因?qū)胫参铮梢垣@得耐逆性提高的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種組成性啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行篩選及鑒定，可以對(duì)所用載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記或具有抗性的抗生素標(biāo)記物。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可以不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。攜帶有本發(fā)明SgNCED1的表達(dá)載體可通過(guò)常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞或器官，被轉(zhuǎn)化的植物可以是雙子葉植物，也可以是單子葉植物，例如煙草、大豆、苜蓿、柱花草、楊樹(shù)、花生、棉花、番茄、黃瓜、草坪草、玉米、小麥、水稻等。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明從柱花草(Stylosanthes guianensis)中克隆了9-順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶的編碼基因，命名為SgNCED1。該基因表達(dá)受干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫的誘導(dǎo)。非生物脅迫是限制農(nóng)作物和其他經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)量的重要因素之一，ABA可以提高植物的耐逆性，NCED是高等植物ABA合成步驟中的關(guān)鍵酶。將本發(fā)明的基因應(yīng)用于植物逆境基因工程，可提高植物的耐逆性，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為SgNCED1的Southern雜交結(jié)果圖；圖2為SgNCED1受低溫逆境誘導(dǎo)的情況；圖3為SgNCED1受脫水逆境誘導(dǎo)的情況；圖4為SgNCED1受高鹽逆境誘導(dǎo)的情況；圖5為對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和耐旱性鑒定比較圖。
其中，圖5中，A為0.9％NaCl耐鹽性結(jié)果比較圖，B為10％PEG耐旱性結(jié)果比較圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 SgNCED1的克隆根據(jù)GenBank中檢索出的菜豆(Phasealus vugaris)、豇豆(Vignaunguiculata)和豌豆(Pisum sativum)的NCED同源序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物ZG33 5’GCCGG(G/T)CACCACTTCTTCGACGG 3’ZG34 5’CTCTTCAAACTCTC(C/G/A)TCGCAATC 3’取脫水的柱花草葉片提取總RNA，用Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA第一鏈作為模板，以ZG33和ZG34為引物，用PCR的方法擴(kuò)增出約800bp的片段，將該片段克隆到T載體，獲得SgNCED1的部分編碼序列。
為了獲得全長(zhǎng)cDNA，根據(jù)3’-RACE的原理，依此序列設(shè)計(jì)3’RACE引物3’端上游引物ZG77 5’CCAGAGTGCTTCTGCTTCCATCT 3’3’端下游引物ZG60 5’CTGATCTAGAACGCGTGGATCC 3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約1100bp的片段，克隆到T載體，獲得SgNCED1的3’端，序列，含有polyA尾巴。
利用大連TaKaRa生產(chǎn)的5’-RACE試劑盒和已知的SgNCED1部分序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物ZG45 5’P-CGTAACGGCCAAC 3’ZG42 5’GCCACGCCCATTCCGTTTTTACCGT 3’
ZG43 5’TCTTGGCGATGTCCGAAGATG 3’ZG36 5’CGGAGTGGCCGTGGAGTTCTCCGA 3’ZG44 5’TCACGTGCGCGTCACGCCAAG 3’按照5’-RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法，擴(kuò)增出了約700bp的片段，克隆到T載體，獲得了5’端序列。
用Omiga2.0分析軟件將SgNCED1的部分編碼序列、3’端和5’端的序列拼接起來(lái)，得到cDNA全長(zhǎng)序列，為序列表中的SEQ ID NO1，由2241個(gè)堿基組成，包括5’端非編碼區(qū)(5’UTR)60bp，開(kāi)放閱讀框架(ORF)1809bp和3’端非編碼區(qū)(3’UTR)372bp，最后以polyA結(jié)尾。其中開(kāi)放閱讀框位于第61到第1869位，共1809個(gè)堿基，編碼序列表中SEQ ID NO2蛋白質(zhì)。
實(shí)施例2 SgNCED1基因在柱花草基因組中的拷貝數(shù)分析應(yīng)用Southern雜交技術(shù)分析了SgNCED1基因在柱花草基因組中的拷貝數(shù)。用CTAB法提取柱花草DNA，分別用以下限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I、Sac I和EcoR V消化基因組DNA，電泳，轉(zhuǎn)膜。SgNCED1的部分編碼序列(764bp)作探針模板，用TaKaRa的探針標(biāo)記試劑盒，用[α-32P]dCTP同位素標(biāo)記探針，進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果如圖1所示。在SgNCED1編碼區(qū)內(nèi)沒(méi)有EcoR I、EcoR V的酶切位點(diǎn)，雜交結(jié)果只有一條帶；在SgNCED1編碼區(qū)內(nèi)有一個(gè)Sac I酶切位點(diǎn)，雜交結(jié)果有兩條帶。說(shuō)明SgNCED1在柱花草基因組中以單拷貝的形式存在。
實(shí)施例3 SgNCED1受逆境誘導(dǎo)的表達(dá)情況將苗齡8周的柱花草葉片剪下，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)吹風(fēng)，使葉片脫水，進(jìn)行脫水處理；將苗齡8周的柱花草約10厘米長(zhǎng)的頂端剪下，立即插于盛有3％NaCl溶液的50ml三角瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，進(jìn)行鹽脅迫處理；將苗齡8周的柱花草置于光照14h、黑暗10h的人工氣候箱內(nèi)在7℃下培養(yǎng)3d，進(jìn)行低溫處理。
從葉片提取總RNA，用常規(guī)Northern雜交方法分析SgNCED基因的表達(dá)，并用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定ABA含量，結(jié)果如圖2。從圖2中看出，SgNCED1的表達(dá)受低溫、脫水和高鹽脅迫的誘導(dǎo)。SgNCED1在低溫脅迫6個(gè)小時(shí)開(kāi)始表達(dá)，在低溫脅迫第二天，表達(dá)量最高，常溫恢復(fù)一天以后，停止表達(dá)；SgNCED1在脫水處理0.5小時(shí)開(kāi)始表達(dá)，在處理5個(gè)小時(shí)達(dá)到最高峰；在高鹽脅迫3個(gè)小時(shí)開(kāi)始表達(dá)，在7個(gè)小時(shí)達(dá)到最高峰。ABA含量的變化與SgNCED1的表達(dá)一致。表明SgNCED1能夠響應(yīng)逆境的誘導(dǎo)。
實(shí)施例4 SgNCED1植物表達(dá)載體的構(gòu)建和功能檢驗(yàn)SgNCED1植物表達(dá)載體的構(gòu)建按常規(guī)方法進(jìn)行。將用Xba I和Sma I進(jìn)行雙酶切的SgNCED1和雙元表達(dá)載體pBI121用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，篩選出陽(yáng)性重組子，獲得SgNCED1基因插入pBI121多克隆位點(diǎn)的重組表達(dá)載體，命名為pBI-SgNCED1。用電擊法將pBI-SgNCED1轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105。
用常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將帶有重組質(zhì)粒pBI-SgNCED1的農(nóng)桿菌EHA105浸染煙草葉片。經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)和抗生素篩選得到抗卡那霉素的植株，經(jīng)過(guò)PCR檢驗(yàn)，表明SgNCED1基因已整合到煙草中。
將在MS培養(yǎng)基(含100mg/l卡那霉素)上培養(yǎng)2-4周、長(zhǎng)出3-6片真葉的轉(zhuǎn)基因煙草小苗和野生型對(duì)照煙草分別移栽到含0.9％NaCl的MS培養(yǎng)基，或者移栽到含10％PEG6000的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)3-4周后，轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)發(fā)育良好，而野生型植株逐漸死亡，如圖3所示。證明表達(dá)SgNCED1基因的轉(zhuǎn)基因植株提高了耐鹽性和耐旱性。
SEQUENCE LISTING<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>柱花草9-順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶及其編碼基因與應(yīng)用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2241<212>DNA<213>柱花草(Stylosanthes guianensis)<220>
<221>CDS<222>(61)..(1866)<400>1tctcatacac agtaatagta acctcttcac tattcacact ttcaaaatag agaaacaacc 60atg gca gca act tca aac aca tgg atc aat acc aaa ctt cca tca tca108Met Ala Ala Thr Ser Asn Thr Trp Ile Asn Thr Lys Leu Pro Ser Ser1 5 10 15tgc tcc tct tta aaa ggt gca tca tgt tca cct caa aca cca tcc tca156Cys Ser Ser Leu Lys Gly Ala Ser Cys Ser Pro Gln Thr Pro Ser Ser20 25 30ttc act atg agg agt agt aac aag agg agg acc aat tgc aac aca atc204Phe Thr Met Arg Ser Ser Asn Lys Arg Arg Thr Asn Cys Asn Thr Ile35 40 45aaa tgc tcc ctc caa aca ctc cac ttc cca aaa cag tta caa cca act252Lys Cys Ser Leu Gln Thr Leu His Phe Pro Lys Gln Leu Gln Pro Thr50 55 60acc acc acc aca aca aca aca aaa cca tca aca aaa tca ata cca acc300Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Lys Pro Ser Thr Lys Ser Ile Pro Thr65 70 75 80aaa gaa aat aaa acc gca aat gac tgg aac ctt ata caa aag gcg gca348Lys Glu Asn Lys Thr Ala Asn Asp Trp Asn Leu Ile Gln Lys Ala Ala85 90 95tcc atg gca ata gac ttc gcc gaa tcc gcc tta gcc tca cac gag cgc396Ser Met Ala Ile Asp Phe Ala Glu Ser Ala Leu Ala Ser His Glu Arg100 105 110aaa cac ccg ctc cca aag act gcc gat ccc cgc gtt cag atc gct gga444Lys His Pro Leu Pro Lys Thr Ala Asp Pro Arg Val Gln Ile Ala Gly115 120 125aac ttc gcg ccg gtg ccg gag cat ccc gtt act cag aac ctc cca atc492Asn Phe Ala Pro Val Pro Glu His Pro Val Thr Gln Asn Leu Pro Ile130 135 140gcc gga aaa ctc ccg gaa tgc att gac gga gtc tat gtc cgc aac ggc540Ala Gly Lys Leu Pro Glu Cys Ile Asp Gly Val Tyr Val Arg Asn Gly145 150 155 160gcc aac ccg atg tac gag cca ctc gcc gga cac cac ctc ttc gac ggc588Ala Asn Pro Met Tyr Glu Pro Leu Ala Gly His His Leu Phe Asp Gly165 170 175gac ggc atg gtc cac gcc ttg aaa ttc cac aac ggc tcc gcc agc tac636Asp Gly Met Val His Ala Leu Lys Phe His Asn Gly Ser Ala Ser Tyr180 185 190tcc tgc cgg ttc acc gaa aca aac cgc ctc gtc caa gag aaa tcc ctc684Ser Cys Arg Phe Thr Glu Thr Asn Arg Leu Val Gln Glu Lys Ser Leu
195 200 205gga aaa ccg gtg ttc ccg aaa gcc atc gga gaa ctc cac ggc cac tcc732Gly Lys Pro Val Phe Pro Lys Ala Ile Gly Glu Leu His Gly His Ser210 215 220gga atc gct cgc ctc ctc ttg ttc tac gca cgc ggc ctt ttc ggc ctc780Gly Ile Ala Arg Leu Leu Leu Phe Tyr Ala Arg Gly Leu Phe Gly Leu225 230 235 240gtc gac ggt aaa aac gga atg ggc gtg gca aac gcc ggt ctg gtc tac828Val Asp Gly Lys Asn Gly Met Gly Val Ala Asn Ala Gly Leu Val Tyr245 250 255ttc aat aac cac ctc ttg gcg atg tcc gaa gat gat ttg cct tat cac876Phe Asn Asn His Leu Leu Ala Met Ser Glu Asp Asp Leu Pro Tyr His260 265 270gtg cgc gtc acg cca agc ggt gac tta aaa acc gtt ggc cgt tac gac924Val Arg Val Thr Pro Ser Gly Asp Leu Lys Thr Val Gly Arg Tyr Asp275 280 285ttt aac ggc caa ctg aaa tcc acg atg atc gca cat ccc aag gtg gat972Phe Asn Gly Gln Leu Lys Ser Thr Met Ile Ala His Pro Lys Val Asp290 295 300cca gtc tca ggg gag ctc ttc gct cta agc tac gac gtc gtt tca aag 1020Pro Val Ser Gly Glu Leu Phe Ala Leu Ser Tyr Asp Val Val Ser Lys305 310 315 320cct tac ctc aag tac ttc aag ttc aac aaa gac gga acg aag tcg aag 1068Pro Tyr Leu Lys Tyr Phe Lys Phe Asn Lys Asp Gly Thr Lys Ser Lys325 330 335gac gtt gag att ccg ttg aag gtt cca acg atg atg cac gat ttc gcg 1116Asp Val Glu Ile Pro Leu Lys Val Pro Thr Met Met His Asp Phe Ala340 345 350ata acc gaa aat ttc gtg gtg gta ccg gac cag cag gtg gtt ttc aag 1164Ile Thr Glu Asn Phe Val Val Val Pro Asp Gln Gln Val Val Phe Lys355 360 365ctt ggc gag atg atg aag ggt ggt tca ccg gtt gtt tac gac aaa gag 1212Leu Gly Glu Met Met Lys Gly Gly Ser Pro Val Val Tyr Asp Lys Glu370 375 380aag gtg tct cgg ttt ggg att ctt gac aag aat gcc acc gat tca gac 1260Lys Val Ser Arg Phe Gly Ile Leu Asp Lys Asn Ala Thr Asp Ser Asp385 390 395 400ggt atc cgg tgg att gag gcg cca gag tgc ttc tgc ttc cat ctg tgg 1308Gly Ile Arg Trp Ile Glu Ala Pro Glu Cys Phe Cys Phe His Leu Trp405 410 415aat gcg tgg gag gag aag gaa acc gat gag gtt gtt gtg att gga tcg 1356Asn Ala Trp Glu Glu Lys Glu Thr Asp Glu Val Val Val Ile Gly Ser420 425 430tgc atg acc cct gcc gac tcc att ttc aac gag tgc gac gag aat ttg 1404Cys Met Thr Pro Ala Asp Ser Ile Phe Asn Glu Cys Asp Glu Asn Leu435 440 445aag agt gtg tta tcg gag ata agg ttg aac ttg aag aca ggg aaa tca 1452Lys Ser Val Leu Ser Glu Ile Arg Leu Asn Leu Lys Thr Gly Lys Ser450 455 460aca agg aga gct ata atc cgt gaa gaa gaa cag gtg aat ttg gag gca 1500Thr Arg Arg Ala Ile Ile Arg Glu Glu Glu Gln Val Asn Leu Glu Ala465 470 475 480ggg atg gtg aac aag aac aag ctt gga agg aag tca cag ttc gca tac 1548Gly Met Val Asn Lys Asn Lys Leu Gly Arg Lys Ser Gln Phe Ala Tyr485 490 495ttg gcg cta gca gag cca tgg cct aag gtc tct ggt ttc gcc aag gtt 1596
Leu Ala Leu Ala Glu Pro Trp Pro Lys Val Ser Gly Phe Ala Lys Val500 505 510gat ctt tcc acc ggt gaa gta aag aag tac atc tat ggc gac gag aaa1644Asp Leu Ser Thr Gly Glu Val Lys Lys Tyr Ile Tyr Gly Asp Glu Lys515 520 525ttc ggc ggt gag ccg atg ttt ctt cca aga tcg cca tct tct gac agg1692Phe Gly Gly Glu Pro Met Phe Leu Pro Arg Ser Pro Ser Ser Asp Arg530 535 540gaa gat gac ggt tac att ctt gca ttt gtt cat gac gag aag gag tgg1740Glu Asp Asp Gly Tyr Ile Leu Ala Phe Val His Asp Glu Lys Glu Trp545 550 555 560aag tct gag ctt cag gtt gtg aat gcc atg act ctg gag ctt gaa gcc1788Lys Ser Glu Leu Gln Val Val Asn Ala Met Thr Leu Glu Leu Glu Ala565 570 575aca att gag tta cct tca aga gtg cct tat ggt ttc cat ggc aca ttc1836Thr Ile Glu Leu Pro Ser Arg Val Pro Tyr Gly Phe His Gly Thr Phe580 585 590att caa tcc aag gat ctc cgg aag cag gct tgattcgatt tccgttgaga 1886Ile Gln Ser Lys Asp Leu Arg Lys Gln Ala595 600catttcttct tcttaatttt tcttatttgc ttttagatcc ttctctgtgt gagtgaggga 1946ggtggagatt tttacctgtg ggattgtttg cagatatgtc cccggaatct ccatcctctg 2006ttattttcaa gcagaagtag aggctcgtgt ttctctctgc attctttttt tttttttttt 2066ttaaattatt atttttatta ttaagtttgg ggagttttga gtgagaggtt ttgggggacc 2126atagcttgta gcttttgggt gtagtatagc aaaatgaaag ctcagctggg tctctgctta 2186ttctttcact tcaattttag atgtcatgaa tagtgttaag aaaaaaaaaa aaaaa 2241<210>2<211>602<212>PRT<213>柱花草(Stylosanthes guianensis)<400>2Met Ala Ala Thr Ser Asn Thr Trp Ile Asn Thr Lys Leu Pro Ser Ser1 5 10 15Cys Ser Ser Leu Lys Gly Ala Ser Cys Ser Pro Gln Thr Pro Ser Ser20 25 30Phe Thr Met Arg Ser Ser Asn Lys Arg Arg Thr Asn Cys Asn Thr Ile35 40 45Lys Cys Ser Leu Gln Thr Leu His Phe Pro Lys Gln Leu Gln Pro Thr50 55 60Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Lys Pro Ser Thr Lys Ser Ile Pro Thr65 70 75 80Lys Glu Asn Lys Thr Ala Asn Asp Trp Asn Leu Ile Gln Lys Ala Ala85 90 95Ser Met Ala Ile Asp Phe Ala Glu Ser Ala Leu Ala Ser His Glu Arg100 105 110
Lys His Pro Leu Pro Lys Thr Ala Asp Pro Arg Val Gln Ile Ala Gly115 120 125Asn Phe Ala Pro Val Pro Glu His Pro Val Thr Gln Asn Leu Pro Ile130 135 140Ala Gly Lys Leu Pro Glu Cys Ile Asp Gly Val Tyr Val Arg Asn Gly145 150 155 160Ala Asn Pro Met Tyr Glu Pro Leu Ala Gly His His Leu Phe Asp Gly165 170 175Asp Gly Met Val His Ala Leu Lys Phe His Asn Gly Ser Ala Ser Tyr180 185 190Ser Cys Arg Phe Thr Glu Thr Asn Arg Leu Val Gln Glu Lys Ser Leu195 200 205Gly Lys Pro Val Phe Pro Lys Ala Ile Gly Glu Leu His Gly His Ser210 215 220Gly Ile Ala Arg Leu Leu Leu Phe Tyr Ala Arg Gly Leu Phe Gly Leu225 230 235 240Val Asp Gly Lys Asn Gly Met Gly Val Ala Asn Ala Gly Leu Val Tyr245 250 255Phe Asn Asn His Leu Leu Ala Met Ser Glu Asp Asp Leu Pro Tyr His260 265 270Val Arg Val Thr Pro Ser Gly Asp Leu Lys Thr Val Gly Arg Tyr Asp275 280 285Phe Asn Gly Gln Leu Lys Ser Thr Met Ile Ala His Pro Lys Val Asp290 295 300Pro Val Ser Gly Glu Leu Phe Ala Leu Ser Tyr Asp Val Val Ser Lys305 310 315 320Pro Tyr Leu Lys Tyr Phe Lys Phe Asn Lys Asp Gly Thr Lys Ser Lys325 330 335Asp Val Glu Ile Pro Leu Lys Val Pro Thr Met Met His Asp Phe Ala340 345 350Ile Thr Glu Asn Phe Val Val Val Pro Asp Gln Gln Val Val Phe Lys355 360 365Leu Gly Glu Met Met Lys Gly Gly Ser Pro Val Val Tyr Asp Lys Glu370 375 380Lys Val Ser Arg Phe Gly Ile Leu Asp Lys Asn Ala Thr Asp Ser Asp385 390 395 400Gly Ile Arg Trp Ile Glu Ala Pro Glu Cys Phe Cys Phe His Leu Trp405 410 415
Asn Ala Trp Glu Glu Lys Glu Thr Asp Glu Val Val Val Ile Gly Ser420 425 430Cys Met Thr Pro Ala Asp Ser Ile Phe Asn Glu Cys Asp Glu Asn Leu435 440 445Lys Ser Val Leu Ser Glu Ile Arg Leu Asn Leu Lys Thr Gly Lys Ser450 455 460Thr Arg Arg Ala Ile Ile Arg Glu Glu Glu Gln Val Asn Leu Glu Ala465 470 475 480Gly Met Val Asn Lys Asn Lys Leu Gly Arg Lys Ser Gln Phe Ala Tyr485 490 495Leu Ala Leu Ala Glu Pro Trp Pro Lys Val Ser Gly Phe Ala Lys Val500 505 510Asp Leu Ser Thr Gly Glu Val Lys Lys Tyr Ile Tyr Gly Asp Glu Lys515 520 525Phe Gly Gly Glu Pro Met Phe Leu Pro Arg Ser Pro Ser Ser Asp Arg530 535 540Glu Asp Asp Gly Tyr Ile Leu Ala Phe Val His Asp Glu Lys Glu Trp545 550 555 560Lys Ser Glu Leu Gln Val Val Asn Ala Met Thr Leu Glu Leu Glu Ala565 570 575Thr Ile Glu Leu Pro Ser Arg Val Pro Tyr Gly Phe His Gly Thr Phe580 585 590Ile Gln Ser Lys Asp Leu Arg Lys Gln Ala595 600
權(quán)利要求
1.一種柱花草9-順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶，其特征是其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，或是與SEQ ID NO2具有至少95％的同源性序列，或是將SEQ ID NO2經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柱花草9-順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶，其特征是其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.編碼權(quán)利要求1所述柱花草9-順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶的基因SgNCED1的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述基因SgNCED1的核苷酸序列，如SEQ ID NO1所示。
5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的重組表達(dá)載體。
6.權(quán)利要求5所述重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
7.一種核酸分子探針，其來(lái)源于權(quán)利要求3或4所述的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求3或4所述基因在提高植物耐逆性中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及柱花草9－順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明從柱花草(Stylosanthes guianensis)中克隆了9－順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶的編碼基因，命名為SgNCED1。該基因表達(dá)受干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫的誘導(dǎo)。非生物脅迫是限制農(nóng)作物和其他經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)量的重要因素之一，ABA可以提高植物的耐逆性，NCED是高等植物ABA合成步驟中的關(guān)鍵酶。將本發(fā)明的基因應(yīng)用于植物逆境基因工程，可提高植物的耐逆性，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1844377SQ20061003491
公開(kāi)日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2006年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月11日
發(fā)明者郭振飛, 楊錦芬 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)