專利名稱：一種抗乳房炎的奶牛育種方法
技術領域：
本發(fā)明公開一種抗乳房炎的奶牛育種方法，用抗菌肽培育具有抗乳房炎病的奶牛，屬于動物育種方法技術領域。
背景技術：
乳房炎是奶牛的多發(fā)病，泌乳奶牛乳房炎發(fā)病率在20％以上，是影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的重要病患之一。乳房炎的發(fā)病原因包括病原菌的入侵感染或機械性因素等，但在一般情況下，臨床型乳房炎和無癥狀的隱性乳房炎90％以上都是由葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等細菌性感染引起的。目前乳房炎的預防和治療國內(nèi)外多采用抗生素類藥物、抗生素合劑、化學藥物以及激素類抗炎藥物，有的采用中藥制劑。這些藥物在過去對于乳房炎的預防和治療都發(fā)揮了重要的作用，但是大部分抗生素類藥物可殘留于奶制品中。奶制品國家標準中明確規(guī)定奶中不能殘留抗生素藥物。中藥制劑是具有良好應用前景的一類制劑，除了部分可能殘留異味以外，大部分都有較好的抗菌消炎效果，但是很多中藥制劑都是復方成分，制作和使用都比較復雜，其有效成分也有待闡明。隨著奶牛業(yè)的日益規(guī)?；l(fā)展，目前相當一部分藥物已經(jīng)不能適應奶業(yè)發(fā)展的要求。
因此，研究一種對奶牛乳房炎具有抗病能力的奶牛新品種是本發(fā)明要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開一種抗乳房炎的奶牛育種方法，培養(yǎng)的奶牛具有抗乳房炎病的能力，適用于產(chǎn)業(yè)化培育生產(chǎn)。
本發(fā)明還提供了培育具有抗乳房炎病奶牛的抗菌肽。
本發(fā)明的技術解決方案如下采用抗菌肽基因構建乳腺組織特異性表達載體，轉化和篩選優(yōu)良品種(產(chǎn)奶量高)的奶牛胎兒成纖維細胞或皮膚成纖維細胞，以轉化的成纖維細胞作為核供體，以普通?；蛱蕴瓋?yōu)良品種奶牛的卵母細胞作為受體，進行核移植，再通過核移植卵母細胞(發(fā)育的)胚胎移植，獲得轉基因克隆奶牛。
本發(fā)明涉及的抗菌肽基因選自乳鐵蛋白肽基因、牛氣管抗菌肽基因、天蠶素B基因和天蠶素A-蛙皮素雜合肽基因中的一種或多種組合。
本發(fā)明是通過以下具體步驟實現(xiàn)的首先是將所述的抗菌肽基因，構建在乳腺組織特異性表達載體中，提取外源基因進行供體細胞的轉染，所有成纖維細胞均可用于核移植的供體細胞，通過篩選將獲得的陽性細胞與體外培養(yǎng)成熟的去核卵母細胞利用電融合法構建重構胚，將經(jīng)過激活的重構胚進行體內(nèi)培養(yǎng)，然后再將發(fā)育正常的重構胚用外科手術的方法移入同步情期的寄母牛子宮內(nèi)，最后獲得轉基因克隆奶牛。
一、抗菌肽基因的合成1.乳鐵蛋白肽基因的合成(1)乳鐵蛋白肽基因的設計在乳鐵蛋白部分肽核苷酸序列前后分別加上乳鐵蛋白信號肽序列和終止密碼子，5′端加上酶切位點NotI，3′端加上酶切位點BamHI，由此組成的完整序列即為目標序列Lfcin Bgcggccgc atg aag ctc ttc gtc ccc gcc ctg ctg tcc ctt gga gcc ctt gga ctgtgt ctg gct ttc aaa tgc cgc cga tgg cag tgg agg atg aag aag ctg ggt gctccc tct atc acc tgt gtg agg agg gcc ttt taa ggatcc(2)重疊引物的設計根據(jù)Lfcin B的核苷酸序列設計合成了4條引物LfcinB-F15′-gcggccgcatgaagctcttcgtccccgccctgctgtcccttggagcccttLfcinB-R15′-ctgccatcggcggcatttgaaagccagacacagtccaagggctccaagggacagLfcinB-F25′-aaatgccgccgatggcagtggaggatgaagaagctgggtgctcccLfcinB-R25′ggatccttaaaaggccctcctcacacaggtgatagagggagcacccagcttctt4條引物的特點為LfcinB-F1和LfcinB-R1的3′端互補，LfcinB-R1和LfcinB-F2的5′端互補，LfcinB-F2和LfcinB-R2的3′端互補。
(3)乳鐵蛋白肽基因的拼接通過3次PCR反應合成完整基因，第1次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM的LfcinB-F1，LfcinB-R1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、PfuDNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第一次擴增，得到產(chǎn)物LfcinB-F1R1；第2次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM LfcinB-F2，LfcinB-R2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第二次擴增，得到產(chǎn)物LfcinB-F2R2；第3次PCR反應取第1次，第2次PCR反應產(chǎn)物LfcinB-F1R1，LfcinB-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循環(huán)一次后反應產(chǎn)物作為模板，加入10μM LfcinB-F1，LfcinB-R2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積100μL，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循環(huán)25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10min進行PCR產(chǎn)物末端的加A反應。
(4)合成產(chǎn)物的回收PCR產(chǎn)物以DNA凝膠回收試劑盒回收，溶解于10μl四餾水中。
(5)合成的乳鐵蛋白肽基因在pMD-18T中的克隆第4步PCR反應結束后，將100μlPCR反應液全部上樣，在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳，回收目的片段LfcinB(149bp)，將目的片段與pMD18-T載體連接，10μl連接反應體系為4.5μl目的片段，5μl SolutionI和0.5μl pMD18-T載體，16℃過夜。將連接產(chǎn)物轉化E.coli感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定后，挑取陽性克隆測序，測序結果與目的片段Lfcin B核苷酸序列完全一致，由此獲得了含有完整乳鐵蛋白部分肽基因(Lfcin B)核苷酸序列的表達載體pT-LfcinB。
2.牛氣管抗菌肽基因的合成(1)牛氣管抗菌肽基因的設計依據(jù)GenBank登陸號為AF014106的牛氣管抗菌肽基因序列，選用真核細胞偏愛的密碼子對其進行優(yōu)化，結合真核表達載體pIRES1-neo和pMD18-T的多克隆位點，在基因兩端設計酶切位點，在5′端引入EcoRI酶切位點和NotI酶切位點，在3′端引入BamHI酶切位點，并根據(jù)酶切位點添加相應的保護堿基。改造后的序列為ggaattcgcggccgcatg agg ctc cat cac ctg ctc ctc gct ctc ctc ttc ctggtc ctg tct gct tcc tca gga ttt act caa gga gta gga aat cct gta agc tgtgtt agg aat aaa ggc atc tgt gtg cca atc agg tgt cct gga aac atg aaa cagatt ggc acc tgt gtc ggg aga gca gta aaa tgc tgt aga aag aag taaggatcccg5′端第一個G為保護堿基，下劃線的GAATTC為EcoRI酶切位點，GCGGCCGC為NotI酶切位點，3′端GGATCC為BamHI酶切位點，CG為保護堿基。
(2)重疊引物的設計設計bTAP-F1、bTAP-R1、bTAP-F2、bTAP-R2 4條引物，由上海生物工程公司合成。
bTAP-F15′-aattcgcggccgcatgaggctccatcacctgctcctcctctcctcttcctggtcctgtctgcttcctcabTAP-R15′-ctttattcctaacacagcttacaggatttcctactccttgagtaaatcctgaggaagcagacaggacbTAP-F25′-gctgtgttaggaataaaggcatctgtgtgccaatcaggtgtcctggaaacatgaaacagattggcaccbTAP-R25′-cgggatccttacttctttctacagcattttactgctctcccgacacaggtgccaatctgtttcat引物bTAP-F1，bTAP-R1的3′端18個堿基互補，引物bTAP-F2，bTAP-R2的3′端18個堿基互補，引物bTAP-R1，bTAP-F2的5′端18個堿基互補。
(3)氣管抗菌肽基因的拼接通過3次PCR反應合成完整基因，第1次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM bTAP-F1，bTAP-R1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第一次擴增，得到產(chǎn)物bTAP-B-F1R1；第2次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM bTAP-F2，bTAP-R2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第二次擴增，得到產(chǎn)物bTAP-F2R2；第3次PCR反應取第1次，第2次PCR反應產(chǎn)物bTAP-F1R1，bTAP-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循環(huán)一次后反應產(chǎn)物作為模板，加入10μMbTAP-F1，bTAP-R2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積100μL，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循環(huán)25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10mi n進行PCR產(chǎn)物末端的加A反應。
(4)成產(chǎn)物的回收PCR產(chǎn)物以DNA凝膠回收試劑盒回收，溶解于10μl四餾水中。
(5)成牛氣管抗菌肽基因在pMD-18T中的克隆將上述回收的PCR產(chǎn)物目的片段與pMD18-T載體連接，10μl連接反應體系為4.5μl目的片段，5μl SolutionI和0.5μl pMD18-T載體，16℃過夜。將連接產(chǎn)物轉化E.coli感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定后，挑取陽性克隆測序，測序結果與目的片段bTAP核苷酸序列完全一致，測序正確的重組表達載體命名為pT-bTAP。
3.天蠶素B基因的合成(1)天蠶素B基因的設計參考Genbank登陸號為D11113的天蠶素B基因序列，選用真核細胞偏愛的密碼子的對其進行優(yōu)化，同時結合表達載體pIRES1-neo和pMD-18T的多克隆位點，考慮克隆后能保持正確的閱讀框架。在兩端設計酶切位點。在5｀端引入EcoRI酶切位點和NotI酶切位點，在3｀端引入BamHI酶切位點，根據(jù)酶切位點添加相應的保護堿基。改造后的序列為ggaattcgcggccgc atg aat ttc gca aag atc cta tcc ttc gtc ttc gct ctggtg ctg gct ttg agc atg acc agc gct gct ccc gag ccc agg tgg aag atc ttcaag aaa att gaa aaa atg ggc agg aac att aga gac ggc atc gtc aaa gct ggccca gct atc gag gtc ctt ggt agc gct aaa gct ata gga aaa tgaggatccgc5′端第一個G為保護堿基，下劃線的GAATTC為EcoRI酶切位點，GCGGCCGC為NotI酶切位點，GGATCC為BamHI酶切位點，3′端GC為保護堿基(2)疊引物的設計設計cecF1、cecR1、cecF2、cecR2 4條引物，由上海生物工程公司合成。
cecF15′-ggaattcgcggccgcatgaatttcgcaaagatcctatccttcgtcttcgctctggtgctggctttgagcatgcecR15′-ttcaattttcttgaagatcttccacctgggctcgggacagcgctggtcatgctcaaagccagcaccecF25′-atcttcaagaaaattgaaaaaatgggcaggaacattagagacggcatcgtcaaagctggcccagctcecR25′-gcggtacctcattttcctatagctttagcgctaccaaggacctcgatagctgggccagctttgac|引物cecF1，cecR1的3′端18個堿基互補，引物cecF2，cecR2的3′端18個堿基互補，引物cecR1，cecF2的5′端18個堿基互補。
(3)蠶素B基因的拼接通過3次PCR反應合成完整基因，第1次PCR反應在100μL反應體系中加入10μMcecF1，cecR1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第一次擴增，得到產(chǎn)物cecB-F1R1；第2次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM cecF2，cecR2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第二次擴增，得到產(chǎn)物cecB-F2R2；第3次PCR反應取第1次，第2次PCR反應產(chǎn)物cecB-F1R1，cecB-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循環(huán)一次后反應產(chǎn)物作為模板，加入10μM cecF1，cecR2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積100μL，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循環(huán)25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10min進行PCR產(chǎn)物末端的加A反應。
(4)成產(chǎn)物的回收PCR產(chǎn)物以DNA凝膠回收試劑盒回收，溶解于10μl四餾水中。
(5)合成天蠶素B基因在pMD-18T中的克隆上述回收的PCR產(chǎn)物在如下體系內(nèi)，12℃進行連接反應過夜Ligation solution I 5μl回收的天蠶素B基因片段約100ngpMD-18T載體 1μl
加水補至總體積10μl取過夜連接產(chǎn)物5μl，轉化E.coli DH5α，涂布氨芐青霉素抗性LB-瓊脂平板，挑取重組菌落4個進行測序，測序正確的重組表達載體命名為pT-cecB。
4.天蠶素A-蛙皮素雜合肽基因CM的合成(1)雜合肽基因的設計取天蠶素A1-8位氨基酸和蛙皮素1～12位氨基酸組成雜合肽，在該雜合肽核苷酸序列前后分別加上乳鐵蛋白信號肽序列和終止密碼子序列，并在其5′和3′分別加上酶切位點NotI和BamHI。由此組成的完整核苷酸序列即為設計的天蠶素A-蛙皮素雜合肽(CM)基因核苷酸序列gcggccgc(NotI)atg aag ctc ttc gtc ccc gcc ctg ctg tcc ctt gga gcc cttgga ctg tgt ctg gct(singal peptide)aag tgg aag ctg ttc aag aaa atc ggtatc ggg aag ttc ctg cat tca gct aag aag ttc taa ggatcc(BamHI)(2)據(jù)CM的核苷酸序列設計合成4條引物CM-F15′-gcggccgcatgaagctcttcgtccccgccctgctgtcccttggagcccttCM-R15′-cagcttccacttagccagacacagtccaagggctccaagggacagCM-F25′-ctggctaagtggaagctgttcaagaaaatcggtatcgggaagttcctgCM-R25′-ggatccttagaacttcttagctgaatgcaggaacttcccgatacc4條引物的特點為CMF1和CMR1的3′端互補，CMR1和CMF2的5′端互補，CMF2和CMR2的3′端互補。
(3)蠶素A-蛙皮素雜合肽基因的拼接通過3次PCR反應合成完整基因，第1次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM的CM-F1，CM-R1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第一次擴增，得到產(chǎn)物CM-F1R1；第2次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM CM-F2，CM-R2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第二次擴增，得到產(chǎn)物CM-F2R2；第3次PCR反應取第1次，第2次PCR反應產(chǎn)物CM-F1R1，CM-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循環(huán)一次后反應產(chǎn)物作為模板，加入10μM CM-F1，CM-R2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積100μL，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循環(huán)25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10min進行PCR產(chǎn)物末端的加A反應。
(4)成產(chǎn)物的回收PCR產(chǎn)物以DNA凝膠回收試劑盒回收，溶解于10μl四餾水中。
(5)成的天蠶素A-蛙皮素雜合肽基因在pMD-18T中的克隆第4步PCR反應結束后，將100μl PCR反應液全部上樣，在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳，回收目的片段CM，將目的片段與pMD18-T載體連接，10μl連接反應體系為4.5μl目的片段，5μl SolutionI和0.5μl pMD18-T載體，16℃過夜。將連接產(chǎn)物轉化E.coli感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定后，挑取陽性克隆測序，測序結果與目的片段CM核苷酸序列完全一致，由此獲得了含有完整天蠶素A-蛙皮素雜合肽基因(CM)核苷酸序列的表達載體pT-LfcinB。
二、含有抗菌肽基因質(zhì)粒的構建(一)含有單個抗菌肽基因的質(zhì)粒pIB-LfcinB-neo、pIB-CecB-neo、pIB-CM-neo和pIB-bTAP-neo(見附圖1、2、3、4)圖1、2、3、4分別是本發(fā)明中含有牛乳鐵蛋白肽基因、天蠶B基因、雜合肽基因和牛氣管抗菌肽基因的質(zhì)粒結構，其基礎框架為商業(yè)化表達載體pIRES1-neo。圖示中，neo為新霉素抗性基因、bcp為beta-酪蛋白啟動子、LfcinB為乳鐵蛋白部分肽基因(CecB為天蠶素B基因、CM為雜合肽基因、bTAP為牛氣管抗菌肽基因)、IVS及IRES分別為合成內(nèi)含子和內(nèi)源性核糖體結合位點、polyA為牛生長激素多聚A信號。
①.各部分來源a.bcp山羊β-酪蛋白啟動子序列，全長1132bp，由本室克隆于莎能奶山羊基因組，GenBankAY311384。
b.LfcinB人乳鐵蛋白部分肽基因，由本室設計序列，委托上海博亞生物技術公司化學合成。
c.CecB天蠶素B抗菌肽基因，由本室設計序列，委托上海博亞生物技術公司化學合成。
d.bTAP牛氣管抗菌肽基因，由本室設計序列，委托上海博亞生物技術公司化學合成。
e.CM天蠶素A和蛙皮素雜合肽基因，由本室設計序列，委托上海博亞生物技術公司化學合成。
f.IVS、IRES、poly(A)、Amp均來自商業(yè)化表達載體pIRES1-neo。
②.含乳鐵蛋白肽基因質(zhì)粒pIB-LfcinB-neo的構建以商品化表達載體pIRES1-neo為載體框架，載體pT-LfcinB、pT-bcp分別提供乳鐵蛋白肽基因和山羊β-酪蛋白啟動子。
③.含天蠶素B基因質(zhì)粒pIB-CecB-neo的構建以商品化表達載體pIRES1-neo為載體框架，載體pT-CecB、pT-bcp分別提供天蠶素B抗菌肽基因和山羊β-酪蛋白啟動子。
④.含牛氣管抗菌肽基因質(zhì)粒pIB-bTAP-neo的構建以商品化表達載體pIRES1-neo為載體框架，載體pT-bTAP、pT-bcp分別提供牛氣管抗菌肽基因和山羊β-酪蛋白啟動子。
⑤.含雜合肽CM基因質(zhì)粒pIB-CM-neo的構建以商品化表達載體pIRES1-neo為載體框架，載體pT-CM、pT-bcp分別提供雜合肽基因和山羊β-酪蛋白啟動子。
(二)含有雙抗菌肽基因的質(zhì)粒pLN-bCP-LfcinB-CE-MA、pLN-bCP-cecB-bTAP、pLN-bCP-LfcinB-CecB和pLN-bCP-LfcinB-bTAP的構建以NotI和XhoI雙酶切本研究組保存的質(zhì)粒pIRES-bCP-LfcinB-CM、pIRES-bCP-cecB-bTAP、pIRES-bCP-LfcinB-CecB、pIRES-bCP-LfcinB-bTAP和pLN-bCP-LK(R)，分別回收1.6kb和7.2kb的基因片段，用T4DNA Ligase連接，構建成含牛乳鐵蛋白肽和天蠶素A-蛙皮素雜合肽基因的載體pLN-bCP-LfcinB-CM、含牛氣管抗菌肽和天蠶素B基因的載體pLN-bCP-cecB-bTAP；含牛乳鐵蛋白肽和天蠶素B基因的載體pLN-bCP-LfcinB-CecB；含牛乳鐵蛋白肽和牛氣管抗菌肽基因的載體pLN-bCP-LfcinB-bTAP(見附圖5、6、7、8)。
三、核移植轉基因動物的制備方法
(1)抗菌肽表達載體的制備首先提取足量的含有抗菌肽基因的質(zhì)粒，然后用特定的限制性內(nèi)切酶切下載體上所需的外源基因。DNA樣品通過0.7％～1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，割下含有所需外源DNA條帶的凝膠，用電洗脫方法回收DNA，上離子交換柱(Qiagen)脫鹽濃縮。
(2)體細胞的選擇與培養(yǎng)哺乳動物體細胞核內(nèi)含有全部基因組信息，即核的全能性，因此分化的體細胞能夠經(jīng)核移植使其發(fā)育程序逆轉，重新發(fā)育成個體。我們選擇奶牛胎兒成纖維細胞和小牛皮膚成纖維細胞為轉基因的中間受體。
(3)體細胞的轉染脂質(zhì)體是人工合成的陽離子去垢劑和二油酰脂酰乙醇胺的混合物。因其表面帶有陽離子，可與帶負電的DNA相互作用，形成陽離子脂質(zhì)層，包裹DNA分子，脂質(zhì)體-DNA復合物則通過靜電引力作用被細胞吸附，通過細胞融合或胞吞作用使脂質(zhì)體-DNA復合物進入細胞質(zhì)、再進入細胞核，最終使外源DNA整合到細胞染色體上達到轉基因目的。在脂質(zhì)體轉染時，不同的脂質(zhì)體濃度，DNA濃度和轉染時間都影響細胞的轉染效率。濃度太高或太低，細胞克隆數(shù)均降低，這可能是脂質(zhì)體與DNA的不恰當包裝所至。另外，高濃度的脂質(zhì)體和DNA對細胞的毒性較大，其結果影響了轉染效率轉染的時間短也會降低轉染效率，然而隨著轉染時間的延長，細胞死亡率增加，最好將轉染時間控制在8～12小時。
(4)轉染后供體細胞的篩選只有很少的機會可以通過細胞的形態(tài)來鑒定核篩選被轉染的細胞，通?？偸抢棉D入一個基因(稱為篩選標志基因)，其表達產(chǎn)物能賦予細胞一個特性，如使細胞產(chǎn)生對特定藥物的抗性或產(chǎn)生熒光等，從而將轉染細胞和無轉染細胞區(qū)分開來。常用的篩選標志基因有很多，我們選用的是新霉素抗性基因(neo)。新霉素抗性基因(neo)的表達產(chǎn)物能滅活新霉素類似物G418對哺乳動物細胞蛋白合成的抑制作用。
篩選物或多或少對細胞有毒性作用，要保證準確篩選情況下使其對細胞的毒性降低到最低程度，保證轉染細胞的正常生長發(fā)育，就要測定篩選物的毒性，并確定其用量(300～400μg/ml)。
(5)卵母細胞的體外成熟卵巢卵母細胞體外成熟是獲得廉價成熟卵母細胞的主要方法。利用此技術可以獲得大量體外成熟的卵母細胞，用于核移植，從而充分利用實驗材料，大大降低實驗成本。
將得到的卵丘卵母細胞復合體(COC)進行分級，只有包被1層以上致密卵丘細胞、形態(tài)正常的卵母細胞才能用于成熟培養(yǎng)。
研究表明一定的基礎培養(yǎng)液能使卵母細胞發(fā)育成熟。我們選擇近年來報道最多的TCM199(Earle’salt)為培養(yǎng)液，應用這種培養(yǎng)液后卵母細胞體外成熟率均可達到80％以上。
在基礎培養(yǎng)液中添加胎牛血清(FCS)可獲得更高的成熟率。在基礎培養(yǎng)液中添加促性腺激素對卵母細胞體外成熟具有十分重要的作用。
(6)重構胚的建立①卵母細胞的去核采用的方法是Mc Greath和Solter等1983年創(chuàng)造的一步法。其方法是先用固定針吸住卵母細胞，使極體處于適當位置；然后用去核針刺破透明帶，從極體的下部將第一極體及其附近細胞質(zhì)一起去除。
②核移植的方法融合法(透明帶下注射法)是將一個供體細胞沿去核切口注入卵周隙，使注入細胞的細胞膜與去核卵母細胞的質(zhì)膜緊密接觸。然后通過細胞融合將整個細胞溶入去核卵母細胞。由于此法融合效率高、重復性好，此法被廣泛地使用。用0.3mol/L甘露醇，0.1mmo/L，CaCl2，0.2mmol/L MgSO4，0.5mmol/L HEPES和0.05％FAF-BSA配制成的融合液，以兩次2.26kV/cm，16μs的直流電脈沖進行操作，得到了93.6％的融合率。
③重構胚的激活在自然受精或人工條件下受精，精子必須穿過透明帶進入卵母細胞。在精子胞質(zhì)內(nèi)存在某些可溶性蛋白質(zhì)分子，在精卵質(zhì)膜融合后，他們作為一種信號分子通過融合孔進入卵子胞質(zhì)中，從而激活卵子內(nèi)的鈣釋放系統(tǒng)而使卵子活化。精子誘發(fā)卵母細胞內(nèi)一系列Ca2+離子瞬間升高。Ca2+離子的瞬間升高是以波的形式擴散到整個卵母細胞，引發(fā)皮質(zhì)反應使卵母細胞退出分裂中期而進入間期。在Ca2+離子介導的卵母細胞激活過程中，其中激酶MPF的滅活是中期向間期過渡的前提。在目前的實驗中使用的任何激活方法都不能完全模擬精子誘發(fā)卵母細胞激活的過程。
核移植胚必須激活后才能啟動發(fā)育。常用的激活方法有電激活法和化學激活法。
電激活時，在瞬間高壓電場的作用下，引起細胞膜發(fā)生瞬間的變化，使細胞膜瞬間形成很多微孔，溶液中的Ca2+離子通過微孔進入細胞質(zhì)，使細胞內(nèi)Ca2+離子呈脈沖式升高激活卵子。多次電刺激引起的Ca2+離子的多次脈沖式升高，可以模擬在自然條件下發(fā)生的受精過程。有效地提高了卵母細胞的人工激活率，融合時的電刺激也具有部分激活的作用。在哺乳動物體細胞核移植中，此法被廣泛地應用。
四、轉基因后代的鑒定(1)DNA的提取選擇出生兩周左右時間的新生幼仔尾部或耳部組織用于提取DNA供分子檢測，因為這些組織的采集方便且對幼仔傷害較小。
(2)鑒定方法①PCR鑒定②Southern雜交Southern雜交是目前公認的最好的最可靠的分子檢測方法。Southern雜交使用的探針是根據(jù)被轉移基因的序列特別設計合成的DNA序列。Southern雜交的底物是基因組DNA。
③Northern雜交用Northern雜交來檢測目標基因是否表達、表達強弱和在哪些組織中表達。Northern雜交的底物是RNA，與探針進行RNA/DNA雜交。底物是從不同組織提取的總RNA。
(3)轉基因奶牛乳腺中表達產(chǎn)物的檢測采集獲得的轉基因奶牛泌乳期不同時間的乳汁進行抑菌活性檢測，結果表明乳汁中的表達產(chǎn)物對乳房炎主要病原菌具有很好的抑菌活性，陰性對照為正常非轉基因奶牛泌乳期采集的奶牛乳汁。抑菌活性檢測結果如圖9、10、11。
本發(fā)明的積極效果在于培育的奶牛不得乳腺炎疾病，也避免了預防和治療乳腺炎過程中藥物的殘留和副作用，該轉基因克隆牛在泌乳期具有抵抗細菌感染、從而避免乳房炎發(fā)生的能力，建立了一種奶牛乳房炎抗病育種的新方法。
本發(fā)明涉及的抗菌肽是普遍存在于生物體內(nèi)的一類由特定基因編碼的具有廣譜抗菌功能的小分子多肽，它們對真核細胞沒有殺傷作用。大量的研究已經(jīng)表明，抗菌肽在動物體內(nèi)對細菌、真菌等都有較強的殺傷作用。
泌乳期乳腺是蛋白合成表達最旺盛的組織之一，我們經(jīng)過試驗證實，乳腺組織特異性啟動子可指導外源蛋白在乳腺組織局部的高效表達，如能使抗菌肽在乳腺組織獲得表達，將可發(fā)揮其抗菌的生物學特性，并將達到預防及治療乳房炎的目的。


圖1含有牛乳鐵蛋白肽基因的質(zhì)粒結構圖。
圖2中含有天蠶B基因的質(zhì)粒結構圖。
圖3含有雜合肽基因的質(zhì)粒結構圖。
圖4含有牛氣管抗菌肽基因的質(zhì)粒結構圖。
圖5含牛乳鐵蛋白肽和天蠶素A-蛙皮素雜合肽基因的載體pLN-bCP-LfcinB-CM。
圖6含牛氣管抗菌肽和天蠶素B基因的載體pLN-bCP-cecB-bTAP。
圖7含牛乳鐵蛋白肽和天蠶素B基因的載體pLN-bCP-LfcinB-CecB。
圖8含牛乳鐵蛋白肽和牛氣管抗菌肽基因的載體pLN-bCP-LfcinB-bTAP。
圖9乳中表達產(chǎn)物對鏈球菌抑菌活性檢測結果。
圖10乳中表達產(chǎn)物對大腸桿菌抑菌活性檢測結果。
圖11乳中表達產(chǎn)物對金葡球菌抑菌活性檢測結果。
圖12胚胎成纖維細胞。
圖13陽性細胞克隆。
具體實施例方式
實施例1(一)乳鐵蛋白肽基因的合成1.乳鐵蛋白肽基因的設計在乳鐵蛋白部分肽核苷酸序列前后分別加上乳鐵蛋白信號肽序列和終止密碼子，5′端加上酶切位點NotI，3′端加上酶切位點BamHI，由此組成的完整序列即為目標序列Lfcin Bgcggccgc atg aag ctc ttc gtc ccc gcc ctg ctg tcc ctt gga gcc ctt gga ctgtgt ctg gct ttc aaa tgc cgc cga tgg cag tgg agg atg aag aag ctg ggt gctccc tct atc acc tgt gtg agg agg gcc ttt taa ggatcc2.重疊引物的設計根據(jù)Lfcin B的核苷酸序列設計合成了4條引物LfcinB-F15′-gcggccgcatgaagctcttcgtccccgccctgctgtcccttggagcccttLfcinB-R15′-ctgccatcggcggcatttgaaagccagacacagtccaagggctccaagggacagLfcinB-F25′-aaatgccgccgatggcagtggaggatgaagaagctgggtgctcccLfcinB-R25′ggatccttaaaaggccctcctcacacaggtgatagagggagcacccagcttctt4條引物的特點為LfcinB-F1和LfcinB-R1的3′端互補，LfcinB-R1和LfcinB-F2的5′端互補，LfcinB-F2和LfcinB-R2的3′端互補。
3.乳鐵蛋白肽基因的拼接通過3次PCR反應合成完整基因，第1次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM的LfcinB-F1，LfcinB-R1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、PfuDNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第一次擴增，得到產(chǎn)物LfcinB-F1R1；第2次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM LfcinB-F2，LfcinB-R2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第二次擴增，得到產(chǎn)物LfcinB-F2R2；第3次PCR反應取第1次，第2次PCR反應產(chǎn)物LfcinB-F1R1，LfcinB-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循環(huán)一次后反應產(chǎn)物作為模板，加入10μM LfcinB-F1，LfcinB-R2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積100μL，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循環(huán)25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10min進行PCR產(chǎn)物末端的加A反應。
4.合成產(chǎn)物的回收PCR產(chǎn)物以DNA凝膠回收試劑盒回收，溶解于10μl四餾水中。
5.合成的乳鐵蛋白肽基因在pMD-18T中的克隆第4步PCR反應結束后，將100μlPCR反應液全部上樣，在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳，回收目的片段Lfcin B(149bp)，將目的片段與pMD18-T載體連接，10μl連接反應體系為4.5μl目的片段，5μl SolutionI和0.5μl pMD18-T載體，16℃過夜。將連接產(chǎn)物轉化E.coli感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定后，挑取陽性克隆測序，測序結果與目的片段LfcinB核苷酸序列完全一致，由此獲得了含有完整乳鐵蛋白部分肽基因(LfcinB)核苷酸序列的表達載體pT-LfcinB。
(二)含有乳鐵蛋白肽基因的質(zhì)粒pIB-LfcinB-neo的構建以商品化表達載體pIRES1-neo為載體框架，表達載體pT-LfcinB、pT-bcp分別提供乳鐵蛋白部分肽基因和乳酪蛋白啟動子。質(zhì)粒pIB-LfcinB-neo的構建過程1.取表達載體pT-bcp 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶SpeI+SacII雙酶切并以Klenow補平末端，CIAP去磷后電泳，回收1.1kb的bCP啟動子序列，溶于10μl滅菌去離子水中備用；2.取表達載體pIRESl-neo 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶NruI+EcoRV雙酶切，回收4.6kb的載體片段；3.將步驟1、2獲得的二片段在10μl體系內(nèi)連接，16℃過夜，將連接產(chǎn)物轉化E.coli DH5α感受態(tài)細菌，對重組菌落進行鑒定，獲得正向插入bcp啟動子的重組質(zhì)粒，命名為pI-B(5.7kb)；4.取表達載體pI-B 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶NotI+BamHI雙酶切，回收DNA片段；5.取表達載體pT-L 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶NotI+BamHI雙酶切，回收149p的DNA片段，與步驟4中獲得的片段，以T4DNA連接酶，參照步驟3方法連接二片段，正確重組質(zhì)粒命名為pIB-LfcinB-neo；
(三)建立轉基因動物1.卵母細胞的準備供質(zhì)牛選用成年黑白花奶牛，兩次注射PG調(diào)節(jié)母牛的情期，連續(xù)3天注射FSH，每天2次，在注射LRH26～30h后，手術回收中II期卵母細胞，回收的卵母細胞在37℃，50％CO2，M2培養(yǎng)液中作短期培養(yǎng)。如卵母細胞周圍有顆粒細胞，可用透明質(zhì)酸酶去除。
2.卵母細胞的去核將卵母細胞在含有7.5μg/mL細胞松馳素(CB)+M2培養(yǎng)液組成的顯微操作液中，37℃，5％CO2培養(yǎng)30min，每次取20～30枚卵母細胞移入顯微操作液，在Olympus顯微鏡下將位于第一極體處的中期染色體和部分細胞質(zhì)去除。
3.胚胎成纖維細胞的分離和培養(yǎng)取正常懷孕的奶牛胚胎，清洗剪碎后胰蛋白酶消化，分離得到的細胞在DMEM+10％FBS的培養(yǎng)液，37℃，5％CO2中培養(yǎng)，得到貼壁的培養(yǎng)細胞(見圖8)。
4.供體細胞的轉染用NruI+XhoI酶切重組質(zhì)粒pIB-LfcinB-neo上所需的外源基因。DNA樣品通過1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離，割下含有所需外源DNA條帶的凝膠，用電洗脫方法回收DNA，上離子交換柱(Qiagen)脫鹽濃縮。通過脂質(zhì)體轉染法轉染供體細胞。
取50ml細胞培養(yǎng)瓶中處于旺盛生長期的供體細胞做1∶2傳代，37℃，5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)18～24h，待細胞75％匯片時，準備轉染。
脂質(zhì)體/DNA復合物的制備在500μl無菌Eppendorf管中配液。A液將2～3μgDNA稀釋于250μl無血清無雙抗的營養(yǎng)液中。B液將30μlLipofectamineTM2000稀釋于250μl無血清無雙抗的DMEM營養(yǎng)液中。混合AB兩液，輕微震蕩，充分混勻后，室溫放置30min，此時如果溶液渾濁，不影響轉染。如果出現(xiàn)沉淀，則停止轉染。
在DNA和Lipofectamine作用過程中，將75％匯片的細胞用無血清無雙抗的營養(yǎng)液清洗三次，加入2ml無血清無雙抗的營養(yǎng)液。將作用完畢的DNA/Lipofectamine混合物，加入到細胞上清中，輕晃搖勻，37℃，5％CO2，飽和濕度培養(yǎng)5～12h后，換入10％血清的營養(yǎng)液。
G418抗性細胞的篩選轉染后的供體細胞在37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)36h后，將細胞按1∶5，1∶10，1∶15，1∶20分傳入6孔板中，培養(yǎng)12h，待細胞貼壁后，加入含G418(大于最小致死濃度)的營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。由于G418對真核生物與原核生物細胞均具有毒性作用，增殖中的細胞對G418更為敏感并容易死亡，而轉染有重組質(zhì)粒的細胞由于可表達質(zhì)粒上的G418抗性基因，所以可以存活。根據(jù)生長情況，轉染后的細胞每三天換一次液，隨著時間的延長，未轉染重組質(zhì)粒的死亡細胞數(shù)目增加，大約10～14天，可見轉染質(zhì)粒陽性的細胞克隆(見圖9)。
5.供核細胞的饑餓將生長良好的培養(yǎng)細胞中的原培養(yǎng)液吸出，并用PBS洗2次，加入DMEM+0.5％FBS培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1～3d。饑餓培養(yǎng)的細胞用胰蛋白酶消化，懸浮細胞用作供核細胞。
6.供核細胞的移植去核卵母細胞和供核細胞在含有CB的M2培養(yǎng)液中，移核針吸取成纖維細胞，移入去核卵母細胞的卵周隙中。
7.融合和激活采用電融合法，電融合操作在室溫下進行，將經(jīng)短期恢復培養(yǎng)后的卵母細胞與供體細胞復合體移入融合液中(0.3mol/L甘露醇，0.1mmol/L MgSO4，0.05mmol/LCaCl2和3％BSA)。融合條件是1.25kV/cm，40μs；電刺激后，重構胚胎在M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)30min，檢查其融合結果。融合卵在M16中培養(yǎng)5h；在激活液(5μmol/L離子霉素+7.5μg/mLCB)中5min；然后在含有2μmol/L 6-DMAP和5μmol/LCB的M16培養(yǎng)液中5h；最后在M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
8.重構胚胎的體內(nèi)培養(yǎng)重構胚胎瓊脂包埋用1％瓊脂糖，作雙層包埋。包埋后的克隆胚胎移入同步情期牛的結扎后的輸卵管內(nèi)培養(yǎng)6d。
回收體內(nèi)培養(yǎng)的克隆胚胎手術回收體內(nèi)培養(yǎng)的克隆胚胎，在顯微鏡下判定其發(fā)育。
9.胚胎移植選擇正常發(fā)育的重構胚胎，用外科手術的方法移入同步情期的寄母牛子宮內(nèi)。一般每頭牛移植2～3枚胚胎。
10.寄母羊妊娠診斷與妊娠期的護理胚胎移植后4～6周進行超聲波檢查。用加拿大生產(chǎn)的AMI2900型B超儀，配用5M的直腸探頭進行妊娠診斷。以見到尿囊、胎兒或胎心搏動作為妊娠的判別標準。再過2～3周后復查1次，對妊娠牛隔離飼養(yǎng)，增加營養(yǎng)。
11.克隆牛的出生在預產(chǎn)期前10天進行晝夜觀察，做好產(chǎn)前和難產(chǎn)的應急準備。正常生產(chǎn)的牛及時清理口鼻粘液，消毒臍帶。難產(chǎn)牛及時破腹產(chǎn)，以保證牛犢成活。
12.外源轉基因檢測外源基因檢測采用PCR擴增法。上游引物在β-casein的5′端，下游引物在LfcinB的3′端，PCR引物5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)5′-GGATCCTTAAAAGGCCCTCCTCA-3′(LfcinB)擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，與陽性對照一致，可判定為陽性。
獲得的含有抗菌肽基因的轉基因后代在泌乳期沒有發(fā)生乳房炎。
實施例2(一)牛氣管抗菌肽基因的合成1.牛氣管抗菌肽基因的設計依據(jù)GenBank登陸號為AF014106的牛氣管抗菌肽基因序列，選用真核細胞偏愛的密碼子對其進行優(yōu)化，結合真核表達載體pIRES1-neo和pMD18-T的多克隆位點，在基因兩端設計酶切位點，在5′端引入EcoRI酶切位點和NotI酶切位點，在3′端引入BamHI酶切位點，并根據(jù)酶切位點添加相應的保護堿基。改造后的序列為ggaattcgcggccgcatg agg ctc cat cac ctg ctc ctc gct ctc ctc ttc ctggtc ctg tct gct tcc tca gga ttt act caa gga gta gga aat cct gta agc tgtgtt agg aat aaa ggc atc tgt gtg cca atc agg tgt cct gga aac atg aaa cagatt ggc acc tgt gtc ggg aga gca gta aaa tgc tgt aga aag aag taaggatcccg5′端第一個G為保護堿基，下劃線的GAATTC為EcoRI酶切位點，GCGGCCGC為NotI酶切位點，3′端GGATCC為BamHI酶切位點，CG為保護堿基。
2.重疊引物的設計設計bTAP-F1、bTAP-R1、bTAP-F2、bTAP-R24條引物，由上海生物工程公司合成。
bTAP-F15′-aattcgcggccgcatgaggctccatcacctgctcctcctctcctcttcctggtcctgtctgcttcctcabTAP-R15′-ctttattcctaacacagcttacaggatttcctactccttgagtaaatcctgaggaagcagacaggacbTAP-F25′-gctgtgttaggaataaaggcatctgtgtgccaatcaggtgtcctggaaacatgaaacagattggcaccbTAP-R25′-cgggatccttacttctttctacagcattttactgctctcccgacacaggtgccaatctgtttcat引物bTAP-F1，bTAP-R1的3′端18個堿基互補，引物bTAP-F2，bTAP-R2的3′端18個堿基互補，引物bTAP-R1，bTAP-F2的5′端18個堿基互補。
3.氣管抗菌肽基因的拼接通過3次PCR反應合成完整基因，第1次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM bTAP-F1，bTAP-R1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第一次擴增，得到產(chǎn)物bTAP-B-F1R1；第2次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM bTAP-F2，bTAP-R2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第二次擴增，得到產(chǎn)物bTAP-F2R2；第3次PCR反應取第1次，第2次PCR反應產(chǎn)物bTAP-F1R1，bTAP-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循環(huán)一次后反應產(chǎn)物作為模板，加入10μMbTAP-F1，bTAP-R2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積100μL，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循環(huán)25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10min進行PCR產(chǎn)物末端的加A反應。
4.產(chǎn)物的回收PCR產(chǎn)物以DNA凝膠回收試劑盒回收，溶解于10μ1四餾水中。
5.牛氣管抗菌肽基因在pMD-18T中的克隆將上述回收的PCR產(chǎn)物目的片段與pMD18-T載體連接，10μl連接反應體系為4.5μl目的片段，5μl SolutionI和0.5μl pMD18-T載體，16℃過夜。將連接產(chǎn)物轉化E.coli感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定后，挑取陽性克隆測序，測序結果與目的片段bTAP核苷酸序列完全一致，測序正確的重組表達載體命名為pT-bTAP。
(二)含有牛氣管抗菌肽基因質(zhì)粒pIB-bTAP-neo的構建以商品化表達載體pIRES1-neo為載體框架，載體pT-bTAP和pT-bcp分別提供牛氣管抗菌肽基因和山羊β-酪蛋白啟動子。質(zhì)粒pIB-bTAP-neo的構建過程1.取表達載體pT-bcp 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶SpeI+SacII雙酶切并以Klenow補平末端，CIAP去磷后電泳，回收1.1kb的bCP啟動子序列，溶于10μl滅菌去離子水中備用；2.取表達載體pIRES1-neo 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶NruI+EcoRV雙酶切，回收4.6kb的載體片段；3.將步驟1、2獲得的二片段在10μl體系內(nèi)連接，16℃過夜，將連接產(chǎn)物轉化E.coli DH5α感受態(tài)細菌，對重組菌落進行鑒定，獲得正向插入bcp啟動子的重組質(zhì)粒，命名為pI-B(5.7kb)；4.取表達載體pI-B 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶NotI+BamHI雙酶切，回收DNA片段；5.取表達載體pT-bTAP 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶NotI+BamHI雙酶切，回收218p的DNA片段，與步驟4中獲得的片段，以T4DNA連接酶，參照步驟3方法連接二片段，正確重組質(zhì)粒命名為pIB-bTAP-neo；(三)建立轉基因動物重復實施例1中1～11的步驟，獲得轉基因克隆牛。
12.外源轉基因檢測外源基因檢測采用PCR擴增法。上游引物在β-casein的5′端，下游引物在bTAP的3′端，PCR引物5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)5′-CGGGATCCTTACTTCTTTCTACA-3′(bTAP)擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，與陽性對照一致，可判定為陽性。
獲得的含有抗菌肽基因的轉基因后代在泌乳期沒有發(fā)生乳房炎。
實施例3(一)蠶素B基因的合成1.天蠶素B基因的設計參考Genbank登陸號為D11113的天蠶素B基因序列，選用真核細胞偏愛的密碼子的對其進行優(yōu)化，同時結合表達載體pIRES1-neo和pMD-18T的多克隆位點，考慮克隆后能保持正確的閱讀框架。在兩端設計酶切位點。在5`端引入EcoRI酶切位點和NotI酶切位點，在3`端引入BamHI酶切位點，根據(jù)酶切位點添加相應的保護堿基。改造后的序列為ggaattcgcggccgcatg aat ttc gca aag atc cta tcc ttc gtc ttc gct ctggtg ctg gct ttg agc atg acc agc gct gct ccc gag ccc agg tgg aag atc ttcaag aaa att gaa aaa atg ggc agg aac att aga gac ggc atc gtc aaa gct ggccca gct atc gag gtc ctt ggt agc gct aaa gct ata gga aaa tgaggatcc gc5′端第一個G為保護堿基，下劃線的GAATTC為EcoRI酶切位點，GCGGCCGC為NotI酶切位點，GGATCC為BamHI酶切位點，3′端GC為保護堿基2.疊引物的設計設計cecF1、cecR1、cecF2、cecR24條引物，由上海生物工程公司合成。
cecF15′-ggaattcgcggccgcatgaatttcgcaaagatcctatccttcgtcttcgctctggtgctggctttgagcatgcecR15′-ttcaattttcttgaagatcttccacctgggctcgggacagcgctggtcatgctcaaagccagcaccecF25′-atcttcaagaaaattgaaaaaatgggcaggaacattagagacggcatcgtcaaagctggcccagctcecR25′-gcggtacctcattttcctatagctttagcgctaccaaggacctcgatagctgggccagctttgac|引物cecF1，cecR1的3′端18個堿基互補，引物cecF2，cecR2的3′端18個堿基互補，引物cecR1，cecF2的5′端18個堿基互補。
3.蠶素B基因的拼接通過3次PCR反應合成完整基因，第1次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM cecF1，cecR1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第一次擴增，得到產(chǎn)物cecB-F1R1；第2次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM cecF2，cecR2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第二次擴增，得到產(chǎn)物cecB-F2R2；第3次PCR反應取第1次，第2次PCR反應產(chǎn)物cecB-F1R1，cecB-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循環(huán)一次后反應產(chǎn)物作為模板，加入10μM cecF1，cecR2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積100μL，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循環(huán)25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10min進行PCR產(chǎn)物末端的加A反應。
4.成產(chǎn)物的回收PCR產(chǎn)物以DNA凝膠回收試劑盒回收，溶解于10μl四餾水中。
5.合成天蠶素B基因在pMD-18T中的克隆上述回收的PCR產(chǎn)物在如下體系內(nèi)，12℃進行連接反應過夜Ligation solution I 5μl回收的天蠶素B基因片段 約100ngpMD-18T載體 1μl加水補至總體積 10μl取過夜連接產(chǎn)物5μl，轉化E.coli DH5α，涂布氨芐青霉素抗性LB-瓊脂平板，挑取重組菌落4個進行測序，測序正確的重組表達載體命名為pT-cecB。
(二)含有牛氣管抗菌肽基因質(zhì)粒pIB-cecB-neo的構建以商品化表達載體pIRES1-neo為載體框架，載體pT-cecB和pT-bcp分別提供牛氣管抗菌肽基因和山羊β-酪蛋白啟動子。質(zhì)粒pIB-bTAP-neo的構建過程1.取表達載體pT-bcp 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶SpeI+SacII雙酶切并以Klenow補平末端，CIAP去磷后電泳，回收1.1kb的bCP啟動子序列，溶于10μl滅菌去離子水中備用；2.取表達載體pIRES1-neo 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶NruI+EcoRV雙酶切，回收4.6kb的載體片段；3.將步驟1、2獲得的二片段在10μl體系內(nèi)連接，16℃過夜，將連接產(chǎn)物轉化E.coli DH5α感受態(tài)細菌，對重組菌落進行鑒定，獲得正向插入bcp啟動子的重組質(zhì)粒，命名為pI-B(5.7kb)；4.取表達載體pI-B 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶NotI+BamHI雙酶切，回收DNA片段；5.取表達載體pT-cecB 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶NotI+BamHI雙酶切，回收213bp的DNA片段，與步驟4中獲得的片段，以T4DNA連接酶，參照步驟3方法連接二片段，正確重組質(zhì)粒命名為pIB-cecB-neo；(三)建立轉基因動物重復實施例1中1～11的步驟，獲得轉基因克隆牛。
(1)外源轉基因檢測外源基因檢測采用PCR擴增法。上游引物在β-casein的5′端下游引物在cecB的3′端，PCR引物5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)5′-GCGGTACCTCATTTTCCTATAGC-3′(cecB)擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，與陽性對照一致，可判定為陽性。
獲得的含有抗菌肽基因的轉基因后代在泌乳期沒有發(fā)生乳房炎。
實施例4(一)天蠶素A-蛙皮素雜合肽基因CM的合成1.雜合肽基因的設計取天蠶素A1-8位氨基酸和蛙皮素1～12位氨基酸組成雜合肽，在該雜合肽核苷酸序列前后分別加上乳鐵蛋白信號肽序列和終止密碼子序列，并在其5′和3′分別加上酶切位點NotI和BamHI。由此組成的完整核苷酸序列即為設計的天蠶素A-蛙皮素雜合肽(CM)基因核苷酸序列gcggccgcatg aag ctc ttc gtc ccc gcc ctg ctg tcc ctt gga gcc ctt gga ctgtgt ctg gct(singal peptide)aag tgg aag ctg ttc aag aaa atc ggt atc gggaag ttc ctg cat tca gct aag aag ttc taaggatcc2. 據(jù)CM的核苷酸序列設計合成4條引物CM-F15′-gcggccgcatgaagctcttcgtccccgccctgctgtcccttggagcccttCM-R15′-cagcttccacttagccagacacagtccaagggctccaagggacag
CM-F25′-ctggctaagtggaagctgttcaagaaaatcggtatcgggaagttcctgCM-R25′-ggatccttagaacttcttagctgaatgcaggaacttcccgatacc4條引物的特點為CMF1和CMR1的3′端互補，CMR1和CMF2的5′端互補，CMF2和CMR2的3′端互補。
3.蠶素A-蛙皮素雜合肽基因的拼接通過3次PCR反應合成完整基因，第1次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM的CM-F1，CM-R1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第一次擴增，得到產(chǎn)物CM-F1R1；第2次PCR反應在100μL反應體系中加入10μM CM-F2，CM-R2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25個循環(huán)做第二次擴增，得到產(chǎn)物CM-F2R2；第3次PCR反應取第1次，第2次PCR反應產(chǎn)物CM-F1R1，CM-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循環(huán)一次后反應產(chǎn)物作為模板，加入10μM CM-F1，CM-R2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水補足體積100μL，循環(huán)參數(shù)為94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循環(huán)25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10min進行PCR產(chǎn)物末端的加A反應。
4.成產(chǎn)物的回收PCR產(chǎn)物以DNA凝膠回收試劑盒回收，溶解于10μl四餾水中。
5.成的天蠶素A-蛙皮素雜合肽基因在pMD-18T中的克隆第4步PCR反應結束后，將100μl PCR反應液全部上樣，在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳，回收目的片段CM，將目的片段與pMD18-T載體連接，10μl連接反應體系為4.5μl目的片段，5μl SolutionI和0.5μl pMD18-T載體，16℃過夜。將連接產(chǎn)物轉化E.coli感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定后，挑取陽性克隆測序，測序結果與目的片段CM核苷酸序列完全一致，由此獲得了含有完整天蠶素A-蛙皮素雜合肽基因(CM)核苷酸序列的表達載體pT-LfcinB。
(二)含有雜合肽基因質(zhì)粒pIB-CM-neo的構建以商品化表達載體pIRES1-neo為載體框架，載體pT-CM和pT-bcp分別提供牛氣管抗菌肽基因和山羊β-酪蛋白啟動子。質(zhì)粒pIB-CM-neo的構建過程1.取表達載體pT-bcp 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶SpeI+SacII雙酶切并以Klenow補平末端，CIAP去磷后電泳，回收1.1kb的bCP啟動子序列，溶于10μl滅菌去離子水中備用；2.取表達載體pIRES1-neo 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶NruI+EcoRV雙酶切，回收4.6kb的載體片段；3.將步驟1、2獲得的二片段在10μl體系內(nèi)連接，16℃過夜，將連接產(chǎn)物轉化E.coli DH5α感受態(tài)細菌，對重組菌落進行鑒定，獲得正向插入bcp啟動子的重組質(zhì)粒，命名為pI-B(5.7kb)；4.取表達載體pI-B 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶NotI+BamHI雙酶切，回收DNA片段；5.取表達載體pT-CM 0.5μg，在40μl總體積內(nèi)，以限制性內(nèi)切酶NotI+BamHI雙酶切，回收213bp的DNA片段，與步驟4中獲得的片段，以T4DNA連接酶，參照步驟3方法連接二片段，正確重組質(zhì)粒命名為pIB-CM-neo；㈢建立轉基因動物重復實施例1中1～11的步驟，獲得轉基因克隆牛。
(12)外源轉基因檢測外源基因檢測采用PCR擴增法。上游引物在β-casein的5′端下游引物在CM的3′端，PCR引物5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)5′-GGATCCTTAGAACTTCTTAGCT-3′(CM)擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，與陽性對照一致，可判定為陽性。
獲得的含有抗菌肽基因的轉基因后代在泌乳期沒有發(fā)生乳房炎。
實施例5(一)牛乳鐵蛋白肽基因和天蠶素A-蛙皮素雜合肽基因CM的合成抗菌肽基因的合成方法同前面實施例(二)含有牛乳鐵蛋白肽基因和天蠶素A-蛙皮素雜合肽基因的質(zhì)粒pLN-bCP-LfcinB-CM的構建以NotI和XhoI雙酶切本研究組保存的質(zhì)粒pIRES-bCP-LfcinB-CM、分別回收1.6kb和7.2kb的基因片段，用T4 DNA Ligase連接，構建成含牛乳鐵蛋白肽和天蠶素A-蛙皮素雜合肽基因的載體pLN-bCP-LfcinB-CM。
(三)建立轉基因動物重復實施例1中1～11的步驟，獲得轉基因克隆牛。
(12)外源轉基因檢測外源基因檢測采用PCR擴增法。上游引物在β-casein的5′端，下游引物在遠離β-casein的CM的3′端，PCR引物5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)5′-6GATCCTTAGAACTTCTTAGCT-3′(CM)擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，與陽性對照一致，可判定為陽性。
獲得的含有抗菌肽基因的轉基因后代在泌乳期沒有發(fā)生乳房炎實施例6(一)牛乳鐵蛋白肽基因和天蠶素B基因的合成抗菌肽基因的合成方法同前面實施例(二)含有牛乳鐵蛋白肽基因和天蠶素B基因的質(zhì)粒pLN-bCP-LfcinB-CecB的構建以NotI和XhoI雙酶切本研究組保存的質(zhì)粒pIRES-bCP-LfcinB-CecB、分別回收1.6kb和7.2kb的基因片段，用T4 DNA Ligase連接，構建成含牛乳鐵蛋白肽和天蠶素A-蛙皮素雜合肽基因的載體pLN-bCP-LfcinB-CecB。
(三)建立轉基因動物重復實施例1中1～11的步驟，獲得轉基因克隆牛。
(12)外源轉基因檢測外源基因檢測采用PCR擴增法。上游引物在β-casein的5′端，下游引物在遠離β-casein的CecB的3′端，PCR引物5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)5′-GCGGTACCTCATTTTCCTATAGC-3′(cecB)擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，與陽性對照一致，可判定為陽性。
獲得的含有抗菌肽基因的轉基因后代在泌乳期沒有發(fā)生乳房炎實施例7
(一)牛乳鐵蛋白肽基因和牛氣管抗菌肽基因的合成抗菌肽基因的合成方法同前面實施例(二)含有牛乳鐵蛋白肽基因和牛氣管抗菌肽基因的質(zhì)粒pLN-bCP-LfcinB-bTAP的構建以NotI和XhoI雙酶切本研究組保存的質(zhì)粒pIRES-bCP-LfcinB-bTAP、分別回收1.6kb和7.2kb的基因片段，用T4 DNA Ligase連接，構建成含牛乳鐵蛋白肽和牛氣管抗菌肽基因的載體pLN-bCP-LfcinB-bTAP。
(三)建立轉基因動物重復實施例1中1～11的步驟，獲得轉基因克隆牛。
(12)外源轉基因檢測外源基因檢測采用PCR擴增法。上游引物在β-casein的5′端，下游引物在遠離β-casein的bTAP的3′端，PCR引物5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)5′-CGGGATCCTTACTTCTTTCTACA-3′(bTAP)擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，與陽性對照一致，可判定為陽性。
獲得的含有抗菌肽基因的轉基因后代在泌乳期沒有發(fā)生乳房炎實施例8(一)天蠶素B基因和牛氣管抗菌肽基因的合成抗菌肽基因的合成方法同前面實施例(二)含有天蠶素B基因和牛氣管抗菌肽基因的質(zhì)粒pLN-bCP-CecB-bTAP的構建以NotI和XhoI雙酶切本研究組保存的質(zhì)粒pIRES-bCP-CecB-bTAP、分別回收1.6kb和7.2kb的基因片段，用T4 DNALigase連接，構建成含天蠶素B和牛氣管抗菌肽基因的載體pLN-bCP-CecB-bTAP。
(三)建立轉基因動物重復實施例1中1～11的步驟，獲得轉基因克隆牛。
(12)外源轉基因檢測外源基因檢測采用PCR擴增法。上游引物在β-casein的5′端，下游引物在遠離β-casein的bTAP的3′端，PCR引物
5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)5′-CGGGATCCTTACTTCTTTCTACA-3′(bTAP)擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，與陽性對照一致，可判定為陽性。
獲得的含有抗菌肽基因的轉基因后代在泌乳期沒有發(fā)生乳房炎實驗例(預防效果的比較)實驗中共獲得轉基因克隆奶牛8頭，分別編號為轉1、2、3、4、5、6、7、8，對照組為8頭自然產(chǎn)非轉基因黑白花奶牛，分別編號為非轉1、2、3、4、5、6、7、8，兩組奶牛在相同的飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，比較泌乳期非轉基因奶牛與獲得轉有不同抗菌肽基因的轉基因奶牛乳房炎的發(fā)病率，結果如下

結論轉有抗菌肽基因的8頭奶牛泌乳期均沒有發(fā)生乳房炎，而8頭非轉基因奶牛乳房炎發(fā)病率為37.5％。該結果表明，轉基因奶牛乳汁中分泌的抗菌肽對于泌乳期乳房炎的預防起到了積極的保護作用，在乳房炎的抗病育種方面具有重要的應用前景。
權利要求
1.一種用抗菌肽培育具有抗乳房炎病奶牛的方法。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于抗菌肽基因選自乳鐵蛋白肽基因、牛氣管抗菌肽基因、天蠶素B基因和天蠶素A-蛙皮素雜合肽基因中的一種或多種組合。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，是通過以下具體步驟實現(xiàn)的首先是將所述的抗菌肽基因，構建在乳腺組織特異性表達載體中，提取外源基因進行供體細胞的轉染，所有成纖維細胞均可用于核移植的供體細胞，通過篩選將獲得的陽性細胞與體外培養(yǎng)成熟的去核卵母細胞利用電融合法構建重構胚，將經(jīng)過激活的重構胚進行體內(nèi)培養(yǎng)，然后再將發(fā)育正常的重構胚用外科手術的方法移入同步情期的寄母牛子宮內(nèi)，最后獲得轉基因克隆奶牛。
全文摘要
本發(fā)明公開一種抗乳房炎的奶牛育種方法，用抗菌肽培育具有抗乳房炎病的奶牛，首先是將抗菌肽基因，構建在乳腺組織特異性表達載體中，提取外源基因進行供體細胞的轉染，所有成纖維細胞均可用于核移植的供體細胞，通過篩選將獲得的陽性細胞與體外培養(yǎng)成熟的去核卵母細胞利用電融合法構建重構胚，將經(jīng)過激活的重構胚進行體內(nèi)培養(yǎng)，然后再將發(fā)育正常的重構胚用外科手術的方法移入同步情期的寄母牛子宮內(nèi)，最后獲得轉基因克隆奶牛。
文檔編號A01K67/027GK1970750SQ200610163220
公開日2007年5月30日 申請日期2006年12月11日 優(yōu)先權日2006年12月11日
發(fā)明者扈榮良, 張錦霞, 張守峰, 劉曄, 郭學軍, 張菲 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所