專利名稱：：通過(guò)向體內(nèi)遞送視紫紅質(zhì)核酸恢復(fù)視覺(jué)響應(yīng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物型視紫紅質(zhì)，例如光門控陽(yáng)離子選擇性膜通道通道視紫紅質(zhì)-2(channelrhodopsin-2(Chop2))在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，以在光感器發(fā)生退化的視網(wǎng)膜中將視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元轉(zhuǎn)化成光敏細(xì)胞，從而恢復(fù)視覺(jué)和視覺(jué)的各個(gè)方面。
背景技術(shù)：
：在正常情況下，當(dāng)桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞(也被稱作光感器)將光信號(hào)轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，然后通過(guò)二級(jí)和三級(jí)視網(wǎng)膜神經(jīng)元以及視神經(jīng)將所述電信號(hào)傳遞至外側(cè)膝狀體和視皮層，并在視皮層形成視覺(jué)圖像時(shí)，就產(chǎn)生了視覺(jué)(Baylor,D，1996，尸rac.7V^/.爿c^/.5W.93:560—565;W汪ssle，H,2004,AAW.仏v.臉"簡(jiǎn)c/.5:747-57)。對(duì)于因喪失光感器而導(dǎo)致視力受損的患者，可根據(jù)具體損傷的性質(zhì)通過(guò)向這些下游祌經(jīng)元位點(diǎn)中的一個(gè)施加電刺激來(lái)誘導(dǎo)視知覺(jué)。感光細(xì)胞的嚴(yán)重喪失可由先天性視網(wǎng)膜退化性疾病(例如，視網(wǎng)膜色素退化(RP))引發(fā)(Sung,CHefa/.，1991，A^/.^c^/.tAS^朋6481-85;Humphries,P"1992,5We打ce25<5:804~8;Weleber,RGd"/.,in:SJRyan,Edi幼'""，Mosby,St.Louis(1994)，pp.335466)，并可導(dǎo)致完全失明。老年性黃斑退化(agerelatedmaculardegeration，AMD)也是感光細(xì)胞退化和死亡的結(jié)果，并且可導(dǎo)致位于視野中央的最佳視覺(jué)區(qū)域的嚴(yán)重視覺(jué)損傷。因?yàn)殡S著桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞的喪失，信號(hào)很少或幾乎不能被傳遞到大腦，所以嚙齒動(dòng)物和人均會(huì)逐步失明。全世界每3000人中即有1人因遺傳性視網(wǎng)膜退化而導(dǎo)致部分或完全失明?；加蠻sher綜合征的患者在視網(wǎng)膜退化之外還發(fā)生進(jìn)行性耳聾。目前對(duì)這些病癥還不能有效治療或治愈。長(zhǎng)期以來(lái)，關(guān)于治療視網(wǎng)膜退化的基礎(chǔ)研究被分成兩種途徑(1)保存視網(wǎng)膜退化性疾病患者體內(nèi)殘存光感器的治療法，和(2)置換視網(wǎng)膜退化中喪失的光感器的方法。患有視網(wǎng)膜疾病的患者通常將自身列入試圖尋找方法以減緩其喪失日益減損的視覺(jué)的組群，以及由于遺傳性眼病或外傷而導(dǎo)致光感器的喪失從而符合法定失明標(biāo)準(zhǔn)("無(wú)光感")的組群。對(duì)于第一種途徑，使用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的神經(jīng)保護(hù)法(LaVail,MM"1992，Ato/.5b/.卵:11249-53)和基于病毒載體遞送野生型基因以取代隱性無(wú)義突變的方法(Acland,GM2001,TVw.25:92-95)最多已達(dá)到I/II期臨床試驗(yàn)階段(Hauswirth，WW,2005,Retina25,S60;Jacobson,S，Protocol#0410-677,因f寺網(wǎng)地址Wg&eCOT/^reW6'gS丄'Off2/w'foj6"http://6/mw2005.fa附/9，針對(duì)禾U伯氏先天性黑內(nèi)障(Leber'sCongenitalAmaurosis(LCA)，視網(wǎng)膜退化的一種具體形式)的腺相關(guān)病毒(AAV)介導(dǎo)的基因置換療法已在美國(guó)獲得批準(zhǔn)。遺憾的是，這種途徑對(duì)于晚期視網(wǎng)膜退化的患者并不適合，這種患者必須置換感光細(xì)胞。對(duì)于置換途徑，一種方法包括將患病視網(wǎng)膜移植(置換)成正常組織或細(xì)胞。另一種方法包括使用視網(wǎng)膜植入物替換受損感光細(xì)胞(假體置換)對(duì)殘余非視覺(jué)神經(jīng)元進(jìn)行電刺激。然而，這兩種方法均面臨很多障礙。例如，為進(jìn)行成功移植，植入的組織或細(xì)胞必須功能性地整合到受體視網(wǎng)膜中。電剌激方法則面臨機(jī)械和技術(shù)方面的困難，以及與植入的仿生設(shè)備缺乏長(zhǎng)期生物相容性相關(guān)的問(wèn)題?？偠灾?，針對(duì)遺傳性致盲性疾病目前尚沒(méi)有有效恢復(fù)視覺(jué)的療法。如本文所述，本發(fā)明人的策略需要合適的分子形式的"光傳感器"。先前的研究報(bào)道了果蠅視紫紅質(zhì)的異源表達(dá)(Zemelman,BVetal.，2002,Neuron33:15-22)，并且近期報(bào)道了推定的內(nèi)源光敏視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的感光色素黑視蛋白(melanopsin)的異源表達(dá)(Melyan,Z.etal.,2005,Nature433:741-5;Panda,S.etal.，2005,Science307:600-604;Qiu,X.etal.,2005，Nature433:745-9)。然而，這些感光色素都通過(guò)G蛋白信號(hào)級(jí)聯(lián)與膜通道偶聯(lián)，并使用順式視黃醛作為其發(fā)色團(tuán)。因此就需要表達(dá)多個(gè)基因以獲得光敏感性。此外，這些感光色素的光響應(yīng)動(dòng)力學(xué)也相當(dāng)慢。當(dāng)前研究的目標(biāo)是改進(jìn)描述光敏K+通道工程改造的時(shí)間分辨力(Banghartetal.,2004,Nat.Neurosci.7:1381-6)，雖然這種改進(jìn)需要引入外源"分子鏈"(moleculartether)并使用紫外線以開啟所述通道。這種工程改造的通道有希望用于恢復(fù)退化視網(wǎng)膜的光敏感性，但尚不清楚其在視網(wǎng)膜神經(jīng)元中的表達(dá)和功能。本發(fā)明使用與細(xì)菌視紫紅質(zhì)相似的微生物型視紫紅質(zhì)(Oesterhelt,DWa/.,，1973,尸rac.A^/.Jcfld5W.70:2853-7)，該微生物型視紫紅質(zhì)的構(gòu)象變化是由其發(fā)色團(tuán)基團(tuán)(全反式視黃醛)的可逆光致異構(gòu)化造成的，并且與通過(guò)膜的離子運(yùn)動(dòng)相偶聯(lián)(Oesterhelt,D.,1998,CumOpin.Struct.Biol.8:489-500)?，F(xiàn)已從萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)克隆出兩種微生物型視蛋白channelopsin-l禾卩channelopsin-2(Chopl禾口Chop2)(Nagel,G.etal"2002,Science296:2395-8;Sineshchekov,OAetal"2002,Pro"Natl.Acad.Sci.USA99:8689-94;Nagel,G.etal.,2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100，13940-45)，并且發(fā)現(xiàn)在存在全反式視黃醛的情況下在非洲爪蟾卵母細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，所述兩種微生物型視蛋白直接形成光門控膜通道。具有7次跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)Chop2在與全反式視黃醛發(fā)色團(tuán)結(jié)合后成為光控開關(guān)。因?yàn)樯黻?yáng)離子能夠穿透Chop2的功能性光敏通道，即帶有發(fā)色團(tuán)的通道視紫紅質(zhì)-2(Chop2retinalidene，縮寫為ChR2)，所以Chop2特別引人注意。與僅與11-順式構(gòu)象結(jié)合的動(dòng)物視紫紅質(zhì)不同，Chop2結(jié)合全反式視黃醛異構(gòu)體，從而不再需要由脊椎動(dòng)物視覺(jué)循環(huán)提供的全反式到11-順式的異構(gòu)化反應(yīng)。然而，在本發(fā)明之前仍不清楚一般情況下ChR2在體內(nèi)天然神經(jīng)元中表達(dá)的長(zhǎng)期相容性以及視網(wǎng)膜神經(jīng)元中ChR2介導(dǎo)的光響應(yīng)的具體性質(zhì)。由于在光感器退化的動(dòng)物模型中(Chang,B.""/.,2002,i仏W:517-25;Olshevskaya,EVd"/"2004,/7Vewmsc/.24:6078-85)和因RP而幾乎導(dǎo)致完全喪失光感器的尸檢患者眼部(Santos,AH""/.,1997,Ac/z.775:511-15;Milam,AHaa/.，1998,Prag.五yeWas.〃:175-205)進(jìn)行的組織學(xué)研究都表明有顯著數(shù)量的視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元得到保留，所以本發(fā)明的策略是可行的。目前認(rèn)為，視網(wǎng)膜基因療法可能是人類的一個(gè)治療選擇。例如，美國(guó)專利第5,827,702號(hào)涉及在細(xì)胞攝取外源核酸以進(jìn)行表達(dá)的條件下，使細(xì)胞與外源核酸相接觸，從而產(chǎn)生經(jīng)基因工程改造的眼部細(xì)胞的方法。所述外源核酸為逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒或質(zhì)粒。也可參見(jiàn)WO00/15822(2000年3月23日)禾卩WO98/48097(1998年10月29日)。此類基因療法主要致力于減緩嚙齒動(dòng)物原發(fā)性光感器疾病模型的視網(wǎng)膜退化?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)遞送至光感器的正常基因和特異性突變的核酸酶可延長(zhǎng)這些細(xì)胞的壽命，而這些細(xì)胞在其他情況下會(huì)不可避免地發(fā)生凋亡性細(xì)胞死亡(Bennett,J.，da/.1996淑.Med2，649-54;Bennett,J.，da/.1998，G匿T7zera/^5,1156-64;Kumar-Singh,R&a/.，1998//m附.Tkfo/.G^"d.7,1893-900;Lewin，AS&a/.1998,艦Med《967-71;Ali,Ra/.2000,腺.G匿A25,306-10;Takahashi,M.da/.，1999,/Fra/.73,7812-6;Lau,D.，d2000，/騰化0盧/w/膨/.Sc/.仏3622-33;andLaVail,MM,Wa/.2000,尸rac淑/加"c/腦97,11488-93)?，F(xiàn)已在正常靈長(zhǎng)動(dòng)物中證實(shí)可使用重組腺相關(guān)病毒(rAAV)將綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因轉(zhuǎn)移至視網(wǎng)膜中(Bennett,J"a/.1999尸rac.A^/.5W.96,9920-25)。然而，對(duì)于患有由視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)和/或光感器細(xì)胞的基因缺陷而導(dǎo)致的致盲性疾病的動(dòng)物，特別是對(duì)于人類和其他哺乳動(dòng)物而言，尚不能恢復(fù)其視力。JeanBennett及其同事描述了在RP65基因突變的光感器快速退化模型中使用基因療法維護(hù)光感器的方法，以及使用正?；蛱娲蛉〈蛔兓虻闹脫Q療法。參見(jiàn)，例如Acland、Bennett及其同事的美國(guó)專利公開2004/0022766。此療法在自然發(fā)生的惡性視網(wǎng)膜退化疾病的犬模型RPE65突變?nèi)?類似于人類LCA)中顯示出一定成效。本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)包括不需要引入外源細(xì)胞和組織或物理設(shè)備從而避免了很多現(xiàn)有方法存在的困難；本發(fā)明可用于逆轉(zhuǎn)由多種視網(wǎng)膜退化性疾病導(dǎo)致的視覺(jué)喪失(或視覺(jué)受損)或失明。本發(fā)明通過(guò)基于病毒的基因療法在病變視網(wǎng)膜中的殘存視網(wǎng)膜神經(jīng)元中表達(dá)光敏膜通道或分子，可產(chǎn)生對(duì)視覺(jué)喪失或失明的持久性治療，且恢復(fù)的視覺(jué)具有高時(shí)空分辨力。9由于可通過(guò)上述公開文獻(xiàn)或其他公開文獻(xiàn)中具體公開的內(nèi)容在一定程度上預(yù)期本發(fā)明某些一般方面，所以應(yīng)理解本發(fā)明的公開包括一個(gè)或多個(gè)附帶條件，所述附帶條件排除或放棄先前公開的此類內(nèi)容。相對(duì)于這些公開文獻(xiàn)中公開的內(nèi)容，本發(fā)明中不能通過(guò)此類公開文獻(xiàn)進(jìn)行預(yù)期的方面，至少部分為本文所公開或提出的預(yù)期不到的優(yōu)良結(jié)果是具有非顯而易見(jiàn)性的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及光感器發(fā)生退化或已經(jīng)死亡的視網(wǎng)膜中殘存的光失敏性視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元到直接光敏性神經(jīng)元細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化，從而使所述視網(wǎng)膜具有光敏感性并使患有此類退化疾病的受試者恢復(fù)一個(gè)或多個(gè)方面的視覺(jué)響應(yīng)和功能性視覺(jué)。本發(fā)明通過(guò)恢復(fù)視網(wǎng)膜(由于疾病原因?qū)е鹿饷舾行匀笔?的光敏感性，提供了視覺(jué)所需的最基本的光響應(yīng)機(jī)制。換句話說(shuō)，本發(fā)明將"光傳感器"引入到通常不具有光傳感器的視網(wǎng)膜神經(jīng)元中，從而補(bǔ)償視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的喪失。本發(fā)明人和同事研究了對(duì)已發(fā)生桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞退化的視網(wǎng)膜使用Chop2/ChR2以恢復(fù)其光敏感性的可行性。本文所述結(jié)果顯示了Chop2/ChR2在嚙齒動(dòng)物體內(nèi)視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元的長(zhǎng)期表達(dá)。所述結(jié)果還顯示這些視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元可表達(dá)足量的功能性ChR2通道，從而在沒(méi)有補(bǔ)充外源全反式視黃醛的情況下產(chǎn)生顯著的膜去極化或動(dòng)作電位激發(fā)。此外，本發(fā)明人證明在光感器缺陷型小鼠模型中表達(dá)ChR2不僅能夠使視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞編譯光信號(hào)，還能恢復(fù)視覺(jué)在視皮層中誘發(fā)的響應(yīng)。本發(fā)明涉及對(duì)個(gè)體視覺(jué)喪失的恢復(fù)，其中所述個(gè)體已經(jīng)因視網(wǎng)膜光感器退化而喪失視覺(jué)(或使視覺(jué)受損)或失明。本發(fā)明能夠通過(guò)在這些視網(wǎng)膜神經(jīng)元中表達(dá)光敏性膜通道或分子使此類病變視網(wǎng)膜中的視網(wǎng)膜神經(jīng)元對(duì)光做出響應(yīng)。優(yōu)選的光敏通道或分子是微生物型光門控通道視紫紅質(zhì)例如ChR2、ChRl，光驅(qū)動(dòng)的離子泵例如細(xì)菌視紫紅質(zhì)(Lanyi，JK,2004，^""wievP/^/o/.66:665-88)、嗜鹽視紫紅質(zhì)(halorhodopsins)(Lanyi,JK,1990,iev.70:319-30)，及其衍生物。根據(jù)本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向神經(jīng)元細(xì)胞膜中插入被稱為通道視紫紅質(zhì)-2(ChR2)的綠藻蛋白質(zhì)或其生物活性片段或保守性氨基酸替代變體時(shí)，失明10小鼠視網(wǎng)膜中通常對(duì)光不敏感(直接不敏感)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元(例如，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)和雙極細(xì)胞)能夠?qū)庾龀鲰憫?yīng)。所述試驗(yàn)在模擬人RP癥狀的小鼠模型中進(jìn)行，其中所述小鼠模型經(jīng)基因培育而在視網(wǎng)膜中缺失了光敏細(xì)胞(桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞)。除RP之外，本方法還可治療多種形式的視網(wǎng)膜退化性眼病。如本文所公開的，在桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞死亡后，可通過(guò)賦予視網(wǎng)膜中其他殘存細(xì)胞光敏性質(zhì)來(lái)恢復(fù)視覺(jué)功能。本發(fā)明人使用DNA轉(zhuǎn)移方法在桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞死亡后將吸光蛋白ChR2引入到殘存的小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元中。這些細(xì)胞成為光敏細(xì)胞，并通過(guò)視神經(jīng)和高級(jí)視覺(jué)通路向產(chǎn)生視知覺(jué)的視皮層發(fā)送信號(hào)。使用電生理方式顯示，在大部分經(jīng)ChR2處理的小鼠中信號(hào)都可傳達(dá)到視皮層。所述光敏感性可持續(xù)至少6個(gè)月，提示使用本文公開的其他策略，例如在其他類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞中表達(dá)ChR2或調(diào)節(jié)ChR2的光敏感性和/或調(diào)節(jié)ChR2的波長(zhǎng)選擇性，或使用類似的微生物蛋白質(zhì)從而產(chǎn)生不同的光敏通道也可改進(jìn)正常視力恢復(fù)的效果，可使受試者重新獲得可用的視覺(jué)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，此策略代表"本領(lǐng)域的示范性轉(zhuǎn)變"，涉及"將視網(wǎng)膜中間神經(jīng)元工程改造成經(jīng)遺傳修飾的'假體'細(xì)胞的新領(lǐng)域"。本發(fā)明"開啟了對(duì)殘存視網(wǎng)膜中間神經(jīng)元進(jìn)行遺傳修飾以使其作為置換感光器發(fā)揮功能成為可能"(Flannery,JandGreenberg,K.，2006,iVewra".50:1-3;writtenasapreviewtoapublicationinthesameissueofthepresentinventorsandcolleagues,BiJ.d臉wraw50,23-33,2006)。利用本領(lǐng)域的不斷進(jìn)步，本發(fā)明人使用病毒載體將基因轉(zhuǎn)入視網(wǎng)膜感光細(xì)胞中(FlanneryJG"a/.,1997,iVoc.iVw/.爿cad何:6916-21)。光失敏性視網(wǎng)膜中間神經(jīng)元向光敏細(xì)胞的轉(zhuǎn)化為致盲性視網(wǎng)膜退化的治療指出了全新的方向。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，向視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞、特定無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)Chop2DNA，從而在功能上將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)化成具有桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞功能的光敏細(xì)胞。視網(wǎng)膜中的細(xì)胞分層使感光細(xì)胞激發(fā)雙極細(xì)胞，而雙極細(xì)胞激發(fā)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以將信號(hào)傳遞至視皮層。優(yōu)選在ON型雙極細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的通道視蛋白。使用玻璃體內(nèi)注射和/或視網(wǎng)膜下注射遞送DNA分子和病毒載體以使其到達(dá)靶細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子來(lái)源于Grm6基因(GenBank登記號(hào)BC041684)的mGluR6啟動(dòng)子區(qū)，Grm6基因是控制代謝型谷氨酸受體-6表達(dá)的基因(UedaYetal.,1997,JNe畫cl7:3014-23)。基因組序列示于GenBank登記號(hào)AL627215。如圖8所示，來(lái)自以上GenBank記錄的所述啟動(dòng)子區(qū)序列的優(yōu)選實(shí)例是由11023個(gè)核苷酸組成的SEQIDN0:9。Umeda等人的最初研究中使用了10kb的啟動(dòng)子，但是可以通過(guò)增加或減少片段長(zhǎng)度來(lái)調(diào)整所述啟動(dòng)子以及包含Grm6控制元件的序列的實(shí)際長(zhǎng)度。在期望靶細(xì)胞中選擇并驗(yàn)證來(lái)自Grm6基因的具有最佳長(zhǎng)度的片段在驅(qū)動(dòng)選定編碼序列(優(yōu)選Chop2)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)上的作用是一種常規(guī)測(cè)試，其中所述靶細(xì)胞優(yōu)選富含谷氨酸受體的雙極細(xì)胞，特別是占視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞大多數(shù)的"ON"型雙極細(xì)胞(藍(lán)ajima,Y.,"a/"1993,C/zem雄l1868-73)。本發(fā)明涉及恢復(fù)視網(wǎng)膜光敏感性的方法，所述方法包含(a)向視網(wǎng)膜神經(jīng)元遞送核酸表達(dá)載體，其中所述載體編碼可在神經(jīng)元中表達(dá)的光門控通道視紫紅質(zhì)或光驅(qū)動(dòng)離子泵視紫紅質(zhì)，所述載體包含編碼視紫紅質(zhì)的開放閱讀框、與開放閱讀框可操作連接的啟動(dòng)子序列和任選的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；和(b)在所述神經(jīng)元中表達(dá)所述載體，從而恢復(fù)光敏感性。所述視紫紅質(zhì)優(yōu)選為通道視紫紅質(zhì)-2(Chop2)或其生物活性片段或其保守性氨基酸替代變體。所述載體優(yōu)選為rAAV病毒載體。所述啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子，例如雜合的CMV增強(qiáng)子/雞P-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(CAG)(如以下所示SEQIDNO:l的一部分)或CMV啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子也可以是(0誘導(dǎo)型或(ii)細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子，后者的優(yōu)選實(shí)例是mGluR6啟動(dòng)子(即SEQIDNO:9啟動(dòng)子序列的一部分)、Pcp2(L7)啟動(dòng)子或神經(jīng)激肽-3(NK-3)啟動(dòng)子。上述方法中的優(yōu)選載體包含CAG啟動(dòng)子、土撥鼠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)和?；蛉松L(zhǎng)激素多聚腺苷序列。在本方法中，視網(wǎng)膜神經(jīng)元選自于ON型或OFF型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、視網(wǎng)膜桿狀雙極細(xì)胞、All無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞以及ON型和OFF型視網(wǎng)膜錐狀雙極細(xì)胞。優(yōu)選地，所述載體耙向ON型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和/或ON型雙極細(xì)胞，并在ON型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和/或ON型雙極細(xì)胞中表達(dá)。如果所述載體包含NK-3啟動(dòng)子，則所述載體優(yōu)選靶向OFF型錐狀雙極細(xì)胞。本發(fā)明還涉及使視覺(jué)喪失或失明受試者的視網(wǎng)膜神經(jīng)元恢復(fù)光敏感性的方法，其中所述受試者的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞正發(fā)生退化或已經(jīng)發(fā)生退化和死亡，所述方法包含(a)向受試者的視網(wǎng)膜遞送核酸載體，其中所述載體編碼可在神經(jīng)元中表達(dá)的光門控通道視紫紅質(zhì)或光驅(qū)動(dòng)離子泵視紫紅質(zhì)，所述載體包含編碼視紫紅質(zhì)的開放閱讀框、與開放閱讀框可操作連接的啟動(dòng)子序列和任選的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；(b)在神經(jīng)元中表達(dá)所述載體，其中所述視紫紅質(zhì)的表達(dá)可賦予所述神經(jīng)元光敏感性，從而恢復(fù)視網(wǎng)膜的光敏感性。在此方法中，所述視紫紅質(zhì)優(yōu)選為Ch叩2或其生物活性片段或其保守性氨基酸替代變體。所述載體優(yōu)選為rAAV病毒載體。優(yōu)選的啟動(dòng)子如上述實(shí)施方案中所述。所述載體的優(yōu)選靶細(xì)胞如上文所述。優(yōu)選地，使用上述方法恢復(fù)光敏感性可導(dǎo)致受試者視覺(jué)的恢復(fù)?？赏ㄟ^(guò)以下方法中的一種或多種測(cè)定視覺(jué)(i)暴露于光刺激后受試者的光察覺(jué)響應(yīng)；(ii)暴露于光刺激后受試者的光投影響應(yīng)；(iii)受明暗相間圖案的視覺(jué)刺激(lightversusadarkpatternedvisualstimulus)后受試者的光分辨力；(iv)視皮層對(duì)閃光剌激或圖案視覺(jué)刺激響應(yīng)的電記錄。在上文此方法中，所述視覺(jué)喪失或失明可能是退化性疾病，優(yōu)選色素性視網(wǎng)膜炎或老年性黃斑退化的結(jié)果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在遞送所述載體之前、同時(shí)或之后還向所述受試者提供視覺(jué)假體(visualprosthesis)。優(yōu)選的視覺(jué)假體包括視網(wǎng)膜植入物、皮層植入物、外側(cè)膝狀體植入物或視神經(jīng)植入物。采用上述方法時(shí)，可使用一種或多種視覺(jué)刺激訓(xùn)練受試者的視覺(jué)響應(yīng)。優(yōu)選通過(guò)以下方法中的一種或多種完成所述訓(xùn)練(a)適應(yīng)性訓(xùn)練，其特征是訓(xùn)練受試者識(shí)別(i)不同水平的光和/圖案剌激，和/或(ii)來(lái)自普通光源或物體的環(huán)境刺激；和(b)方向性和運(yùn)動(dòng)性訓(xùn)練，其特征是訓(xùn)練受試者通過(guò)視覺(jué)發(fā)現(xiàn)局部物體，并且與未接受訓(xùn)練相比可更有效地在這些物體間移動(dòng)。圖1A-1I:Chop2-GFP在體內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)元中的表達(dá)。圖1A顯示rAAV-CAG-Chop2-GFP-WPRE表達(dá)盒。CAG:雜合的CMV增強(qiáng)子/雞(3-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。WPRE:土撥鼠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。BGHpA:牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷序列。(圖1B和圖1C):在低放大倍率(圖1B)和高放大倍率(圖1C)下對(duì)注射病毒載體兩個(gè)月后的眼部進(jìn)行觀察。(圖1D):神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的共聚焦圖像，其中顯示疊合圖像(左圖)和單光學(xué)截面的圖像(右圖)。(圖1E):水平細(xì)胞中的Chop2-GFP熒光，其中顯示體細(xì)胞、軸突、遠(yuǎn)端軸突末端的GFP。(圖1F和圖1G):無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(圖1F)和視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞(圖1G)中的Chop2-GFP熒光。圖1H和圖II顯示由注射Chop2-GFP病毒載體12個(gè)月后的視網(wǎng)膜獲得的熒光圖像(圖1H)和相襯圖像(圖11)。(圖1B至圖1E)中的圖像均由平鋪整裝的大鼠視網(wǎng)膜獲得。(圖1F至圖II)中的圖像均由大鼠視網(wǎng)膜垂直切片獲得。比例尺(圖1B)200,;(圖1C)100,;(圖1D)15(im;(圖1E)、(圖1H)和(圖II)50^m;(圖1F)禾口(圖1G)25pm。ONL:外核層；INL:內(nèi)核層；IPL:內(nèi)網(wǎng)層；GCL:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。圖2A-圖2H:表達(dá)ChR2的視網(wǎng)膜神經(jīng)元的光誘發(fā)電流的性質(zhì)。圖2A):從接受載體注射的眼中分離的GFP-陽(yáng)性視網(wǎng)膜神經(jīng)元的相襯圖像(左圖)和熒光圖像(右圖)。比例尺25pm。(圖2B):使用420580nm波長(zhǎng)的光刺激具有Chop2-GFP熒光的視網(wǎng)膜細(xì)胞所獲得的記錄。其光強(qiáng)度在1.0-1.6x10'8光子cm-V1。(圖2C):由光強(qiáng)度為2.2x1015至1.8x1018光子cm—2s"的460nm波長(zhǎng)的光刺激激發(fā)的電流的代表性記錄。(圖2D):在放大的時(shí)間尺度中顯示的圖2C中光刺激發(fā)生后的電流跡線。所示曲線顯示通過(guò)指數(shù)函數(shù)I(tra。+aix(l-eXp[-t/Tl])+a2x(exp[-t/t2])擬合的一條電流跡線，其中1和t2分別代表激活時(shí)間常數(shù)和失活時(shí)間常數(shù)。(圖2E):在放大的時(shí)間尺度中顯示的圖2C中光刺激結(jié)束后的電流跡線。所示曲線顯示通過(guò)單指數(shù)函數(shù)Ict產(chǎn)ao+a^(exp[-t/7T])擬合的一條電流跡線，其中T代表去活時(shí)間常數(shù)。(圖2F):光強(qiáng)度響應(yīng)曲線。所示數(shù)據(jù)點(diǎn)利用單Logistic函數(shù)曲線擬合。(圖2F和圖2H):由圖2D所示擬合獲得的光強(qiáng)度和激活時(shí)間常數(shù)的關(guān)系(圖2G)，以及光強(qiáng)度和失活時(shí)間常數(shù)的關(guān)系(圖2H)。所有記錄均在-70mV的恒定電位下獲得。圖2F-圖2H中的數(shù)據(jù)點(diǎn)以平均值士SD(n=7)表示。圖3A-圖3C:表達(dá)ChR2的視網(wǎng)膜神經(jīng)元中光誘發(fā)的電壓響應(yīng)的性質(zhì)。(圖3A):由GFP-陽(yáng)性非尖峰視網(wǎng)膜神經(jīng)元獲得的代表性記錄。由電流鉗中460nm波長(zhǎng)、強(qiáng)度在2.2x1015至1.8x1018光子cm—2s—1范圍內(nèi)的四個(gè)遞增光刺激激發(fā)的電壓響應(yīng)。虛線表示飽和的電位水平。(圖3B):使用重復(fù)光刺激GFP陽(yáng)性非尖峰神經(jīng)元獲得的代表性記錄。顯示相同細(xì)胞中的光激發(fā)電流響應(yīng)(上圖)和電壓響應(yīng)(下圖)。左圖為在放大的時(shí)間尺度中顯示的第一(紅)和第二(黑)跡線的疊加。虛線表示電流(上圖)和平臺(tái)期膜電位(下圖)的持續(xù)分量。(圖3C):使用重復(fù)光誘發(fā)GFP陽(yáng)性尖峰神經(jīng)元獲得的代表性記錄。圖3B和圖3C中的響應(yīng)由460nm波長(zhǎng)、強(qiáng)度1.8x10188光子cm-2s"的光誘發(fā)。圖4A-圖41:W7/W7小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元中ChR2的表達(dá)和光響應(yīng)性質(zhì)。(圖4A):在15月齡小鼠的平鋪整裝視網(wǎng)膜中觀察到的Chop2-GFP熒光，其中所述小鼠在9月齡時(shí)接受Chop2-GFP病毒載體注射。(圖4B):在6月齡小鼠的視網(wǎng)膜垂直切片中觀察到的Chop2-GFP熒光，其中所述小鼠在3月齡時(shí)接受Chop2-GFP病毒載體注射。(圖4C):5月齡小鼠(出生后第一天注射Chop2-GFP病毒載體)視網(wǎng)膜半薄垂直切片的光學(xué)顯微鏡圖像。比例尺(圖4A)50(圖4B和圖4C)30pm。(圖4D-圖4E):瞬時(shí)尖峰GFP陽(yáng)性神經(jīng)元(圖4D)和持續(xù)尖峰GFP陽(yáng)性神經(jīng)元(圖4E)的代表性記錄。使用波長(zhǎng)為460nm的四個(gè)強(qiáng)度遞增的光來(lái)激發(fā)所述響應(yīng)。不計(jì)中性密度(Log1=0)的光強(qiáng)度為3.6x10卩光子cm—V1。所有記錄均在-70mV的恒定電位下獲得。右圖為在放大的時(shí)間尺度中顯示的第二(黑色實(shí)線)和第四(虛線或紅色實(shí)線)電流和電壓跡線的疊加。(圖4F-圖4I):顯示光強(qiáng)度與電流幅值(圖4F)、膜去極化(圖4G)、尖峰數(shù)量(圖4H)、達(dá)到首次尖峰頂所需時(shí)間(圖4D的關(guān)系。所述記錄獲自^4月齡的W7/n^小鼠。數(shù)據(jù)點(diǎn)以平均{直±SD(圖4F-圖4H中n=6;圖41中n=4)表示。圖5A-圖5D:來(lái)自小鼠中表達(dá)ChR2的視網(wǎng)膜的多電極陣列記錄。(圖5A):W7/k/7小鼠(24月齡)視網(wǎng)膜的光激發(fā)尖峰活性的一個(gè)樣品記錄。該記錄是在存在CNQX(25|iM)禾nAP5(25[iM)的條件下進(jìn)行的記錄。在58個(gè)電極中，有49個(gè)電極觀察到顯著的光誘發(fā)尖峰活性(電極15接地；電極34存在缺陷)。(圖5B):在三個(gè)遞增光強(qiáng)度下，由單電極記錄樣品的光誘發(fā)尖峰。(圖5C):起源于單個(gè)神經(jīng)元的30個(gè)連續(xù)光激發(fā)尖峰的光柵圖。(圖5D):平均尖峰率的柱狀圖。無(wú)中性密度的濾光片(Log1=0)的光強(qiáng)度為8.5x1017光子cm—V1。圖5A中所示響應(yīng)由無(wú)中性密度的濾光片的單光脈沖激發(fā)。圖6A-圖6E:W〃W7小鼠中表達(dá)Chop2-GFP的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的中心投影和視覺(jué)誘發(fā)電位。(圖6A):腹側(cè)外側(cè)膝狀體()和背側(cè)外側(cè)膝狀體中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的GFP標(biāo)記的末梢分枝(terminalarbor)。(圖6B):上丘腦中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的GFP標(biāo)記的末梢分枝。OT:光學(xué)示蹤；vLGN:腹側(cè)外側(cè)膝狀體；dLGN:背側(cè)外側(cè)膝狀體；SC:上丘腦。比例尺圖6A200pm;圖6B100)im。(圖6C):在野生型小鼠中記錄的VEP。在460nm和580nm波長(zhǎng)下都觀察到所示響應(yīng)。(圖6D):在接受Chop2-GFP病毒載體注射的W7/W/7小鼠中記錄的VEP。所示響應(yīng)的激發(fā)僅由460nm波長(zhǎng)引起，而在580nm波長(zhǎng)下沒(méi)有引起。(圖6E):在注射僅攜帶GFP的病毒載體的rc/〃W/小鼠中沒(méi)有觀察到可檢測(cè)到的VEP。在角膜表面測(cè)定的460nm和580nm波長(zhǎng)的光強(qiáng)度分別為5.5x10"光子cm-2s"和5.2x1016光子cm—V1。(圖6F)用Chop2-GFP病毒載體注射的小鼠的放大的VEP對(duì)波長(zhǎng)為420nm、460nm、500nm、520nm、540nm的不同光強(qiáng)度的曲線。相對(duì)于460nm處獲得的峰響應(yīng)對(duì)每個(gè)眼睛的響應(yīng)進(jìn)行歸一化(標(biāo)準(zhǔn)化)。數(shù)據(jù)以平均值士SD(n=3個(gè)眼)表示。如虛線所示，將各波長(zhǎng)下的光譜靈敏度定義為產(chǎn)生40%歸一化峰響應(yīng)的插補(bǔ)光強(qiáng)度的倒數(shù)。(圖6G):通過(guò)基于維生素Ai的視覺(jué)色素模板(波長(zhǎng)峰為461nm)擬合靈敏度數(shù)據(jù)點(diǎn)。圖7:病毒表達(dá)構(gòu)建物rAAV2-CAG-Chop2-GFP-WPRE(SEQIDNO:l)的圖譜，該構(gòu)建物包含Chop2-GFP片段、可操作性連接的雜合的CMV增強(qiáng)子/雞(3-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(CAG)、土撥鼠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)和牛生長(zhǎng)激素(BGH)多聚腺苷序列。圖8(第1-3頁(yè))顯示Grm6基因(GenBank第BC041684號(hào))的mGluR6啟動(dòng)子區(qū)的11023nt序列(SEQIDNO:9)?；蚪M序列由GenBank第AL627215號(hào)提供。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了治療人類、其他哺乳動(dòng)物或其他動(dòng)物受試者眼部疾病的方法。特別地，所述眼部疾病是涉及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或感光細(xì)胞中突變基因或缺失基因的疾病。本發(fā)明的方法包括通過(guò)玻璃體內(nèi)或視網(wǎng)膜下注射向所述受試者施用有效量的重組病毒的步驟，其中所述重組病毒攜帶編碼正常眼細(xì)胞特異性基因的核酸序列，所述核酸序列可操作地連接啟動(dòng)子序列或受所述啟動(dòng)子序列的控制，所述啟動(dòng)子序列指導(dǎo)所述基因產(chǎn)物在眼細(xì)胞中表達(dá)并取代所述突變基因或缺失基因的表達(dá)缺失或錯(cuò)誤表達(dá)。眼部疾病本方法針對(duì)的并可使用本方法改善的一個(gè)或多個(gè)視覺(jué)參數(shù)的眼部疾病包括但不限于影響眼睛前段和后段的發(fā)育異常。前段疾病包括青光眼、白內(nèi)障、角膜營(yíng)養(yǎng)不良、圓錐形角膜。后段疾病包括由視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良和視網(wǎng)膜退化造成的光感器功能障礙和/或死亡所導(dǎo)致的致盲性疾病。視網(wǎng)膜疾病包括先天性靜止性夜盲、老年黃斑退化、錐狀細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良和大部分與色素性視網(wǎng)膜炎(RP)相關(guān)的疾病。這些疾病包括在多個(gè)年齡階段發(fā)生的由基因引起的視網(wǎng)膜中感光細(xì)胞、桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞的死亡。在這些疾病中有嚴(yán)重的視網(wǎng)膜病變，例如隨年齡發(fā)展并在兒童期和成年早期致盲的RP亞型，和RP相關(guān)疾病，例如常在兒童期(早至一歲)導(dǎo)致視力喪失的遺傳性LCA亞型。后一類疾病的特征通常為感光細(xì)胞、桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞的嚴(yán)重減少且通常為完全喪失(Trabulsi,EI,ed.，G^w幼.c￡feeosas￡Jye，OxfordUniversityPress,NY,1998)。特別地，本方法可用于治療因眼部疾病喪失視力的受試者和/或恢復(fù)其至少部分視力，所述眼部疾病的實(shí)例有RPE相關(guān)的視網(wǎng)膜病變，其特征是盡管功能喪失但可長(zhǎng)期保持眼組織結(jié)構(gòu)，以及功能喪失和受試者眼細(xì)胞中正?；虻娜毕莼蛉笔чg具有關(guān)聯(lián)。己知多種此類眼部疾病，例如兒童期發(fā)作的致盲性疾病、色素性視網(wǎng)膜炎退化、黃斑退化和糖尿病視網(wǎng)膜病變，以及本領(lǐng)域已知的眼部致盲性疾病。預(yù)期也可使用本方法成功地治療這些疾病，以及目前病因未知而今后表征為上述相同特征的致盲性疾病。因此，通過(guò)本方法17治療的特定眼部疾病包括上述疾病以及目前尚未如此表征的多種疾病。通過(guò)以下兩種途徑在視網(wǎng)膜中加工視覺(jué)信息發(fā)出光ON信號(hào)的ON途徑和發(fā)出光OFF信號(hào)的OFF途徑(Wassle，如上)。通常認(rèn)為ON和OFF途徑的存在對(duì)于增強(qiáng)對(duì)比度敏感度非常重要。ON途徑中的視覺(jué)信號(hào)由ON錐狀雙極細(xì)胞傳遞到ON神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。ON錐狀雙極細(xì)胞和ON神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均發(fā)生去極化以對(duì)光作出響應(yīng)。另一方面，OFF途徑中的視覺(jué)信號(hào)由OFF錐狀雙極細(xì)胞傳遞到OFF神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。OFF錐狀雙極細(xì)胞和OFF神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均發(fā)生超極化以對(duì)光作出響應(yīng)。負(fù)責(zé)昏暗光線下視覺(jué)能力(暗視覺(jué))的桿狀雙極細(xì)胞為ON雙極細(xì)胞(去極化以對(duì)光作出響應(yīng))。桿狀雙極細(xì)胞通過(guò)All無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(一種ON型視網(wǎng)膜細(xì)胞)將視覺(jué)信號(hào)傳遞至ON和OFF錐狀雙極細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)施例中顯示了使用CAG啟動(dòng)子在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中表達(dá)普遍表達(dá)的光敏感通道(即ChR2)的功能性結(jié)果，并提出這足以恢復(fù)有用的視覺(jué)。然而，靶向ON型視網(wǎng)膜神經(jīng)元的去極化膜通道(例如ChR2)可產(chǎn)生較好的可用視覺(jué)。此外，在較遠(yuǎn)視網(wǎng)膜神經(jīng)元(例如雙極細(xì)胞)中表達(dá)光傳感器將利用退化視網(wǎng)膜的殘余信號(hào)加工功能。此外，通過(guò)在ON型視網(wǎng)膜神經(jīng)元(ON型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和/或ON型雙極細(xì)胞)中表達(dá)去極化光傳感器(例如ChR2)并在OFF型視網(wǎng)膜神經(jīng)元(OFF型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和/或OFF型雙極細(xì)胞)中表達(dá)超極化光傳感器(例如氯化物泵嗜鹽視紫紅質(zhì)(halorhodopsin))可在光感器退化的視網(wǎng)膜中產(chǎn)生ON和OFF途徑。另一個(gè)方法通過(guò)在桿狀雙極細(xì)胞或All無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞中表達(dá)去極化光傳感器(例如ChR2)實(shí)現(xiàn)視網(wǎng)膜中ON和OFF途徑的恢復(fù)。這是因?yàn)闂U狀雙極細(xì)胞或All無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的去極化可導(dǎo)致錐狀雙極細(xì)胞和下游視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞水平上的ON和OFF響應(yīng)，并以此保持視網(wǎng)膜中固有的ON和OFF途徑(Wassle,2004)。根據(jù)本發(fā)明，使用以下方法恢復(fù)視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元的光敏感性(1)采用如ChR2的普遍表達(dá)的光敏感通道在所有類型的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(ON神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和OFF神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)或所有類型的雙極細(xì)胞(桿狀雙極細(xì)胞以及ON和OFF錐狀雙極細(xì)胞)中產(chǎn)生膜去極化。如本文例證，帶有CAG啟動(dòng)子的AAV載體已經(jīng)在嚙齒動(dòng)物中部分地實(shí)現(xiàn)了本方法。(2)使如ChR2的去極化光傳感器耙向ON型視網(wǎng)膜神經(jīng)元，例如ON型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或ON型雙極細(xì)胞。Dr.J.G.Flannery研究小組的試驗(yàn)已經(jīng)鑒定出人間隙連接蛋白(connexin-36)啟動(dòng)子片段，以通過(guò)使用AAV-2病毒載體耙向ON型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的GFP(GreenbergKP"a/.，2007,WvoD/sewe.^KC^Z^ra"，2M7入易包裝的較短形式的mGluR6啟動(dòng)子(<2.5kb)可靶向ON型雙極細(xì)胞(桿狀雙極細(xì)胞和ON型錐狀雙極細(xì)胞)中的ChR2。(3)使用細(xì)胞特異性啟動(dòng)子靶向特異類型的視網(wǎng)膜神經(jīng)元。可靶向桿狀雙極細(xì)胞的啟動(dòng)子是Pcp2(L7)啟動(dòng)子(Tomomura,M"a/.,2001,五wr/A^"myc/.W:57-63)?；钚詥?dòng)子的長(zhǎng)度優(yōu)選小于2.5Kb，這樣就能包裝到AAV病毒盒中。(4)使如ChR2的去極化光傳感器靶向ON型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或ON型錐狀雙極細(xì)胞，并且使如嗜鹽視紫紅質(zhì)的超極化光傳感器靶向OFF型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或OFF型錐狀雙極細(xì)胞以產(chǎn)生ON和OFF途徑。如上所述，足夠短(可包裝)形式的mGluR6啟動(dòng)子(<2.5kb)可靶向ON型雙極細(xì)胞中的ChR2?？墒褂蒙窠?jīng)激肽-3(NK-3)啟動(dòng)子靶向OFF型錐狀雙極細(xì)胞中的嗜鹽視紫紅質(zhì)(Haverkamp，Se/"/"2002，JC畫/置加VgJVg"ro/agv,455:463-76)。載體根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案，可在這些方法中使用多種已知的核酸載體，例如重組病毒(如重組腺相關(guān)病毒(rAAV)、重組腺病毒、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組痘病毒和本領(lǐng)域的其他己知病毒)以及質(zhì)粒、粘粒和噬菌體等。本領(lǐng)域熟知的很多公開文獻(xiàn)討論了多種此類載體在遞送基因中的應(yīng)用。參見(jiàn)，例如Ausubelefa/.,Cw/reWPratoco/sM^ecw/arJohnWiley&Sons,NewYork,最新版；Kay,MA."a/.，2001,TVaf.MW.,7:33-40;和WaltherW"a/.,2000,Dr卿60:249-71。組裝重組載體的方法是眾所周知的。參見(jiàn)，例如WO00/15822和其引用的其他參考文獻(xiàn)，所有以上文獻(xiàn)均通過(guò)引用并入本文。各種病毒載體系統(tǒng)均具有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。在選擇使用哪種系統(tǒng)時(shí)，起決定性作用的一個(gè)因素是所述系統(tǒng)對(duì)所包裝DNA的大小的限制。rAAV的包裝極限通常為約4.5kbDNA，而慢病毒(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒)系統(tǒng)可容納4-5kb。AAV載體腺相關(guān)病毒是小型單鏈DNA病毒，需要輔助病毒以進(jìn)行有效復(fù)制(Bems,KI,戶arwv/nViae:f/zev/mses1朋t/f/zez>p.1007-1041(vol.2),inFields,BNda/"Fwwdamewto/Wro/ogy,3rdEd"(Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia(1995))。AAV4.7kb的基因組中具有兩個(gè)反向末端重復(fù)(ITR)和分別編碼Rep蛋白和Cap蛋白的兩個(gè)開放閱讀框(ORF)。Rep閱讀框編碼分子量為78、68、52和40kDa的四個(gè)蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的主要功能是調(diào)控AAV復(fù)制，并且將AAV解脫并整合到宿主染色體中。Cap閱讀框編碼形成病毒病毒衣殼的三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，其分子量分別為85kDa(VPl)、72kDa(VP2)和61kDa(VP3)(Bems，如上)。VP3占全部AAV病毒粒子蛋白質(zhì)的>80%。在rep和copORF的5'-禾t13，-末端的側(cè)翼是兩個(gè)145bpITR，該ITR的前125bp可形成Y形或T形的雙鏈結(jié)構(gòu)。這兩個(gè)ITR是AAV復(fù)制、釋放、包裝和向基因組整合所必須的唯一順式元件。AAVITR以被稱為"flip"和"flop"的兩種構(gòu)型存在(Snyder,ROda/.，1993,JWra/.，67:6096-6104;Bems，KI,1990M/craWo/Wev，54:316-29)?？蓪⑼暾膔ep和cap域切除并替換成轉(zhuǎn)基因，例如報(bào)告子或治療性轉(zhuǎn)基因(Carter,BJ,in/Za"必ooA:o/7^rwv/msey，P.Tijsser,ed"CRCPress,pp.155-168(1990))?，F(xiàn)已在很多種類的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)AAV，包括靈長(zhǎng)動(dòng)物、犬、家禽和人類(Murphy,FAda/"7TzeC7as^yca"o"朋c/jVo/wewc/art^eq/^'n^as:i，o/f/ze/"f7Gomme7^xowow_yo/Fn/>ses,Jrc/zFro/，Springer-Verlag,1995)。已知六種靈長(zhǎng)類血清型(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5禾卩AAV6)。采用AAVITR序列和其他AAV序列產(chǎn)生微基因、載體和衣殼，并且可由多個(gè)來(lái)源獲得本發(fā)明中使用的其他構(gòu)建物。例如，可由任意的上述6種AAV血清型或其他AAV血清型或其他濃核病毒(包括目前已知的人AAV和尚未鑒定的血清型)提供所述序列。類似地，本發(fā)明分子和構(gòu)建物中使用的ITR可來(lái)自于已知感染其他動(dòng)物種類的AAV?？蓪?lái)自多種AAV血清型的衣殼與具有其他載體組分的多種混合物進(jìn)行組合(例如，通過(guò)引用并入本文的WO01/83692(2001年11月8日))。這些病毒株或血清型中的一些可由美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC,Manassas,VA.)獲得，或可得自其他多種途徑(研究院或商購(gòu))。期望使用已知技術(shù)并根據(jù)公開的AAV序列(例如，可由多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的AAV序列)合成用于制備本發(fā)明載體和病毒的序列。沒(méi)有對(duì)用于制備本發(fā)明構(gòu)建物的序列的來(lái)源進(jìn)行限制。類似地，對(duì)AAV血清型和種類(來(lái)源)的選擇是本領(lǐng)域已知的技術(shù)，且沒(méi)有進(jìn)行限制。微基因本發(fā)明所使用AAV序列的形式通常是包裝到rAAV病毒顆粒中的rAAV構(gòu)建物(例如，微基因或基因盒)。rAAV微基因最少由AAVITR和向宿主細(xì)胞遞送的異源核酸分子形成。最適宜地，所述微基因包含位于異源序列5'和3'的ITR。然而，包含串聯(lián)排列(例如5'至3'或頭部至尾部)的5'ITR和3'ITR的微基因也是可取的。其他實(shí)施方案包括具有多拷貝ITR的微基因，或者5'ITR(或相反地3'ITR)位于異源序列5'和3'兩端的微基因。ITR序列可位于緊鄰異源序列的上游和/或下游，可存在有插入序列。ITR可來(lái)自AAV5或任意其他AAV血清型。微基因可包括來(lái)自一個(gè)血清型的5，ITR和來(lái)自另一個(gè)血清型的3，ITR。優(yōu)選使用的AAV序列為145bp的順式作用的5'和3'ITR序列(例如，Carter,BJ，如上)。盡管也可以接受微小的修飾，但優(yōu)選使用完整的ITR序列。修飾這些ITR序列的方法是眾所周知的(例如，Sambrook,J.Wa/.,M/ecw/arC7ow/"g:爿丄a6orato/"yMa做a/，3rdEdition,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY,2001;Brent,RW"/.,eds.,CWrewf戶ratoco/s/"M/ecw/arJohnWiley&Sons,Inc.,2003;Ausubel,FMg/"eds.,幼(9W/Votoco/s/"Mo/ecw/(3t歷o/ogy，5thedition,CurrentProtocols,2002;Carter"wpra;andFisher,K"a/.,1996Hra/.70:520-32)。通常使用已知方法改造rAAV病毒(例如，Bennett,Jda/.1999，如上)。本發(fā)明中使用的此分子的實(shí)例是包含兩側(cè)帶有5'和3'AAVITR序列的異源序列(優(yōu)選Chop2序列)的"順式作用"質(zhì)粒。所述異源序列編碼期望遞送至細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明涉及在選定啟動(dòng)子和其他常規(guī)載體調(diào)控組分控制下的Chop2序列。所靶向和表達(dá)的轉(zhuǎn)基因在一個(gè)最優(yōu)選實(shí)施方案中，所述異源序列是起轉(zhuǎn)基因作用的核酸分子。本文所用術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因"是指對(duì)AAV序列而言為異源并且編碼期望產(chǎn)物(優(yōu)選Chop2)的核酸序列，以及指導(dǎo)或調(diào)節(jié)所述核酸在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和/或翻譯從而能夠在所述細(xì)胞中表達(dá)編碼產(chǎn)物的調(diào)控序列。優(yōu)選能被遞送到眼部，特別是遞送到視網(wǎng)膜神經(jīng)元的多肽產(chǎn)物?？蛇f送和表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因以治療或改進(jìn)受試者的視力狀況，其中所述受試者患有由任意多個(gè)病因?qū)е碌难鄄考膊?，所述病因包括正常的光感器特異性基因的突變。所靶向的眼?xì)胞可以是感光細(xì)胞(如果沒(méi)有完全退化)，或更優(yōu)選其他視網(wǎng)膜神經(jīng)元，即雙極細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。使用可操作性地連接到Chop2視蛋白編碼序列的mGluR6啟動(dòng)子和報(bào)告子基因(例如GFP或其他熒光蛋白)時(shí)，優(yōu)選約4.5kb的插入物——視蛋白lkb、報(bào)告子0.7kb、mGluR6啟動(dòng)子區(qū)10kb以及約0.4kb的常規(guī)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。因?yàn)椴煌ǖ赖鞍拙哂胁煌淖畲笪辗?，所以可使用不同的視蛋白基因以選擇所需的波長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將報(bào)告子基因移動(dòng)至可見(jiàn)光譜的紅色部分。類似地，根據(jù)本文報(bào)道的試驗(yàn)，在轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜中刺激誘發(fā)電位所需的光亮度說(shuō)明更需要具有增強(qiáng)的光敏感性的通道視蛋白。這一點(diǎn)可通過(guò)選擇合適的天然存在視蛋白(例如其他微生物型視紫紅質(zhì))，或通過(guò)改變Chop2的光敏感性及其它性質(zhì)(例如離子選擇性、光譜敏感性)從而生產(chǎn)更符合恢復(fù)視覺(jué)需要的不同光敏感性通道來(lái)實(shí)現(xiàn)?？墒褂貌煌霓D(zhuǎn)基因編碼待遞送蛋白質(zhì)的單個(gè)亞基，或編碼需要共表達(dá)的不同多肽。如果單個(gè)轉(zhuǎn)基因包括編碼各亞基的多個(gè)DNA，則可以通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)分離編碼各亞基的DNA，這優(yōu)選用于編碼短亞基的DNA序列(例如，包含IRES的總DNA的全長(zhǎng)〈5kB)。不使用IRES的其他方法，例如使用第二內(nèi)在啟動(dòng)子、選擇性剪接信號(hào)、共翻譯或翻譯后酶切策略等，可用于共表達(dá)(以上均為本領(lǐng)域已知技術(shù))。優(yōu)選針對(duì)將要在其中進(jìn)行表達(dá)的物種，對(duì)本文所用的編碼序列或非編碼序列核酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化。此類密碼子優(yōu)化是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。盡管優(yōu)選編碼全長(zhǎng)多肽(優(yōu)選Chop2(SEQIDNO:6))的轉(zhuǎn)基因，但是本發(fā)明還涉及編碼Chop2(或本發(fā)明將在視網(wǎng)膜神經(jīng)元中表達(dá)的任意其他多22肽)的生物活性片段或其保守性氨基酸替代變體的載體?？捎闷蔚姆窍薅ㄐ詫?shí)例是具有序列SEQIDNO:3和SEQIDNO:8的多肽。所述片段或變體由轉(zhuǎn)化的靶細(xì)胞表達(dá)，其賦予細(xì)胞的光敏感性在功能上等同于全長(zhǎng)或基本全長(zhǎng)多肽賦予細(xì)胞的光敏感性，并且所述全長(zhǎng)或基本全長(zhǎng)多肽具有天然的氨基酸序列而非變體的氨基酸序列。生物活性片段或變體是"功能等價(jià)物"——這是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語(yǔ)并在本文中得到進(jìn)一步的詳細(xì)定義。所需生物活性片段或變體、使用本文公開或本領(lǐng)域已知的任意方法構(gòu)建的活性通道蛋白具有相對(duì)于野生型天然多肽的以下活性約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%和其任意衍生范圍，例如約70%至約80%，和更優(yōu)選約81%至約90%，或再優(yōu)選約91%至約99%。應(yīng)理解由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性，表達(dá)相同多肽序列的本發(fā)明核酸和載體編碼序列的任意變體也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。使用通?；谔囟〝?shù)學(xué)算法的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)測(cè)定本發(fā)明變體的氨基酸序列一致性。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用已并入GCG軟件包(可在htt。:〃www.gcg.com獲得)中GAP程序的Needleman禾口Wunsch算法(《/Afo/.編.祉444-453(1970))，Blossom62矩陣或PAM250矩陣和16、14、12、10、8、6或4的間隔權(quán)重以及1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重來(lái)測(cè)定兩條氨基酸序列間的一致性百分比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用GCG軟件包(可在http://www.gcg.com獲得)中的GAP程序，NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的間隔權(quán)重以及1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重測(cè)定兩條核苷酸序列間的一致性百分比。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用已并入ALIGN程序(2.0版)的Meyers和Miller算法(CABIOS,4:11-17(1989))、PAM120權(quán)重殘基表、間隔長(zhǎng)度罰分12和間隔罰分4來(lái)測(cè)定兩條氨基酸或核酸序列間的一致性百分比?？蛇M(jìn)一步將本發(fā)明的核苷酸序列和氨基酸序列作為"査詢序列"(querysequence)在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，用來(lái)例如，鑒定其他家族成員或相關(guān)序列?？墒褂肗BLAST和XBLAST程序(AltschulWa/.(1990)/Mo/.S/o/.2/5:403-10)進(jìn)行此類檢索。使用NBLAST程序、記分(score)=100、詞長(zhǎng)(wordlength)=12進(jìn)行的BLAST核苷酸檢索可獲得與例如萊茵衣藻(C."zWz"Wri/)中編碼Chop2的DNA同源的核苷酸序列。使用XBLAST程序、記分=50、詞長(zhǎng)=3的BLAST蛋白質(zhì)檢索可獲得與適當(dāng)參考蛋白質(zhì)(例如Chop2)同源的氨基酸序列?？墒褂瞄g隔BLAST(GappedBLAST)獲得間隔比對(duì)以達(dá)到比較的目的(Altschulaa/.(1997)A^c/e/ci饑25:3389-3402)。利用BLAST和間隔BLAST程序時(shí)，可使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST))的缺省參數(shù)。參見(jiàn)因特網(wǎng)地址ncbi,nhiLnih.g;ov。優(yōu)選的氨基酸序列變體與天然全長(zhǎng)通道視蛋白多肽(優(yōu)選萊茵衣藻Chop2(SEQIDNO:6))或其片段(例如SEQIDNO:3或8)間的序列一致性為以下程度約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約71%、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%，或約99%和其任意衍生范圍，例如約70%至約80%，和更優(yōu)選約81%至約90%，或再優(yōu)選約91%至約99%的一致性。優(yōu)選的生物活性片段包含SEQIDNO:3或由SEQIDNO:3組成，其對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:6中1-315殘基，或包含SEQIDNO:8或由SEQIDNO:8組成?？墒褂萌我舛喾N已知的重組方法生產(chǎn)編碼所述片段或變體的DNA分子。對(duì)于變體的生產(chǎn)，通常在編碼序列中引入突變以產(chǎn)生本發(fā)明所需的氨基酸序列變體。產(chǎn)生定點(diǎn)突變是一種眾所周知的技術(shù)，其過(guò)程和試劑均可在市場(chǎng)獲得(例如，Zoller,MJ"a/"1982,7Vwc/Jc/A/0:6487畫6500;Adelman,JP"1983，2:183-93)。這些突變包括簡(jiǎn)單的刪除或插入、系統(tǒng)性刪除、堿基簇的插入或取代或單個(gè)堿基的取代。本領(lǐng)域技術(shù)人員可充分理解，對(duì)于術(shù)語(yǔ)"功能等價(jià)物"，"生物功能等價(jià)的"蛋白質(zhì)、多肽、基因或核酸定義的內(nèi)在涵義，是表示這樣的概念，即可在所述分子的指定部分進(jìn)行有限數(shù)量的改變且仍獲得具有可接受水平的等價(jià)生物活性的分子。因此，本文將生物功能等價(jià)肽定義為對(duì)特定(而非大部分或所有)氨基酸進(jìn)行取代的那些肽。特別地，多肽的長(zhǎng)度越短，則氨基酸變化的發(fā)生應(yīng)越少。較長(zhǎng)的片段可具有中間數(shù)量的變化。全長(zhǎng)多肽蛋白的容許量最大，可具有較大數(shù)目的變化?？沙浞掷斫?，如果發(fā)現(xiàn)特定殘基對(duì)于結(jié)合區(qū)或活性位點(diǎn)中多肽殘基的生物或結(jié)構(gòu)性質(zhì)特別重要，那么對(duì)于此類殘基一般不進(jìn)行替換。以此方式，本文將功能等價(jià)物定義為可基本保持其天然生物活性的那些多肽。關(guān)于蛋白質(zhì)化學(xué)和結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述，可參見(jiàn)Schulz,GE"7V/wc^/mo//Vote/w浙wc似re,Springer-Verlag，NewYork,1978禾口Creighton，T.E.,尸rate/mv浙wc/wrea"t/Mo/ecw/ar/VopeWes,W.H.Freeman&Co"SanFrancisco,1983，以上文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。可在蛋白質(zhì)分子中產(chǎn)生的取代類型取決于不同物種同源蛋白質(zhì)間氨基酸變化頻率的分析，例如Schulz"W.(如上)中表1-2所示和Creighton(如上)中表3-9所示的分析?；诖祟惙治?，本文將保守性取代定義為在以下5組之一內(nèi)的替換<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>上表中括號(hào)中的三種氨基酸殘基在蛋白質(zhì)構(gòu)建中具有特殊作用。甘氨酸(Gly)是唯一缺少側(cè)鏈的殘基，并因此使鏈具有彈性。脯氨酸(Pro),由于其獨(dú)特的幾何結(jié)構(gòu)可使鏈緊密收縮。胱氨酸(Cys)可參與二硫鍵的形成，而二硫鍵對(duì)于蛋白質(zhì)折疊非常重要。在選擇變體時(shí)還要考慮氨基酸的親水指數(shù)?，F(xiàn)已根據(jù)其疏水性和帶電特征設(shè)定了各氨基酸的親水指數(shù)lie(+4.5)、Val(+4.2)、Leu(+3.8)、Phe(+2.8)、Cys(+2.5)、Met(+1.9)、Ala(+1.8)、Glycine(-0.4)、Thr(-0.7)、Ser(-0.8)、Trp(-0.9)、Tyr(-1.3)、Pro(-1.6)、His(-3.2)、Glu(-3.5)、Gin(-3.5)、Asp(-3.5)、Asn(-3.5)、Lys(-3.9)和Arg(-4.5)。本領(lǐng)域通?？梢岳斫庥H水指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)分子相互作用的生物學(xué)功能方面的重要性(KyteandDoolittle,1982,/Mo/.Ao/."7:105-32)。已知可將特定氨基酸取代為具有類似親水指數(shù)或分?jǐn)?shù)并仍保留類似的生物活性的其他氨基酸。在基于親水指數(shù)進(jìn)行改變的過(guò)程中，優(yōu)選氨基酸親水指數(shù)的差值在土2之間的取代，特別優(yōu)選所述差值在土l之間的取代，更特別優(yōu)選差值在±0.5之間的取代。還應(yīng)理解，在本領(lǐng)域可基于親水性有效地進(jìn)行相似氨基酸的取代，特別是在由此產(chǎn)生的生物功能等價(jià)多肽打算用于本發(fā)明某些實(shí)施方案的情況下。美國(guó)專利第4,554,101號(hào)公開了由相鄰氨基酸的親水性控制的蛋白質(zhì)分子的最大局部平均親水性與所述分子的生物性質(zhì)相關(guān)。關(guān)于親水值可參見(jiàn)美國(guó)專利第4,554,101號(hào)。在根據(jù)類似的親水值進(jìn)行改變的過(guò)程中，優(yōu)選氨基酸親水值在士2之間的取代，特別優(yōu)選所述值在±1之間的取代，更特別地優(yōu)選差值在士0.5之間的取代。調(diào)控序列本發(fā)明的微基因或轉(zhuǎn)基因包括與編碼序列或ORF可操作地相連的適當(dāng)序列以促進(jìn)所述編碼序列或ORF在耙宿主細(xì)胞中的表達(dá)。"可操作地相連的"序列包括與編碼序列相連的表達(dá)調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子)，以及以反式或遠(yuǎn)距離方式控制多肽產(chǎn)物表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列。表達(dá)調(diào)控序列包括適合的轉(zhuǎn)錄起始序列、終止序列、啟動(dòng)子序列和增強(qiáng)子序列；有效的RNA加工信號(hào)，例如剪接和多腺苷化信號(hào);穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mRNA的序列；提高翻譯效率的序列(例如，Kozak共有序列)；提高核酸或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；和如果需要，提高蛋白質(zhì)加工和/或分泌的序列。本領(lǐng)域已知多種不同表達(dá)調(diào)控序列，包括天然和非天然、組成型、誘導(dǎo)性和/或組織特異性表達(dá)調(diào)控序列，并且在本發(fā)明中可根據(jù)所需的表達(dá)類型使用所述表達(dá)調(diào)控序列。真核細(xì)胞的表達(dá)調(diào)控序列通常包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子，例如來(lái)自免疫球蛋白基因、SV40、CMV等的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及可包括剪接供體和受體位點(diǎn)的多腺苷化序列。多腺苷化序列通常插入到編碼序列的3'端，以及3'ITR序列的5，端。來(lái)自牛生長(zhǎng)激素的PolyA是適合的序列?？稍诒景l(fā)明中使用的調(diào)控序列還可包含內(nèi)含子，例如位于啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列與編碼序列之間的內(nèi)含子。一個(gè)可用內(nèi)含子序列來(lái)自于SV40，并被稱為SV40T內(nèi)含子序列。另一個(gè)內(nèi)含子序列包括土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后元件(參見(jiàn)，例如WangLandVerma,I,1999,A^7L/5^，96:3906-10)?？墒褂蒙鲜鯥RES序列或其他適合的系統(tǒng)從單個(gè)轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生一條以上的多肽。IRES的實(shí)例為支持在光感器、RPE以及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的脊髓灰質(zhì)炎病毒IRES。優(yōu)選地，所述IRES位于rAAV載體中編碼序列的3'端。所述啟動(dòng)子也可選自于能夠驅(qū)動(dòng)所選轉(zhuǎn)基因在眼部環(huán)境，優(yōu)選在視網(wǎng)膜26神經(jīng)元中表達(dá)的多個(gè)組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。優(yōu)選"細(xì)胞特異性"啟動(dòng)子意味著所選啟動(dòng)子在特定類型的眼細(xì)胞(例如感光細(xì)胞)中指導(dǎo)所選基因的表達(dá)?？捎玫慕M成型啟動(dòng)子的實(shí)例包括例示的CMV前早期增強(qiáng)子/雞P-肌動(dòng)蛋白(CPA)啟動(dòng)子-外顯子1-內(nèi)含子1元件、RSVLTR啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、SV40啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動(dòng)子和磷酸甘油激酶(PGK)啟動(dòng)子。W.W.Hauswirthda/.,1998,W098/48027和A.M.Timmers""/.,2000,WO00/15822中公開了其他可用的啟動(dòng)子。發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)驅(qū)動(dòng)RPE細(xì)胞特異性基因表達(dá)的啟動(dòng)子包括(1)小鼠ll-順式視黃醇脫氫酶(RDH)基因的528-bp啟動(dòng)子區(qū)(第l-528石咸基)(Driessen,CA"a/"1995,/"veW.C>p/2//2"/wo.,.巧i5W.36:1988-96;Simon,A.da/"1995,說(shuō)o/.C7zew270:1107-12,1995;Simon,A."a/"1996,Ge"wmb36:424-3)，Genbank登記號(hào)X97752);(2)來(lái)自人細(xì)胞視黃醛結(jié)合蛋白rCi^丄^Pj基因的2274-bp啟動(dòng)子區(qū)(Intres,Re/a/.，1994,J".S/o/.C/zew.2^:25411-18;Kennedy,BNda/.，1998,/273:5591-8,1998),Genbank登記號(hào)L34219);和(3)來(lái)自人RPE65的1485-bp啟動(dòng)子區(qū)(Nicoletti,Ada/"1998,/騰"(9;滅a/腳/.■>SW.，637-44,Genbank登記號(hào)U20510)。這三個(gè)啟動(dòng)子(在WO00/15822中標(biāo)記為SEQIDNo.2、3和3(2.3amd3))促進(jìn)GFP的PRE-細(xì)胞特異性表達(dá)。預(yù)見(jiàn)在本文所述的多種啟動(dòng)子和啟動(dòng)子區(qū)域中的微小序列變化，無(wú)論該變化為添加、刪除或突變，也不管該變化為自然發(fā)生的或體外引入的，都不會(huì)影響其在本發(fā)明靶細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的能力。此外，使用特征為在視網(wǎng)膜細(xì)胞(特別是雙極或神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)中進(jìn)行大量和/或特異性表達(dá)的其他啟動(dòng)子，即使該啟動(dòng)子還沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，均特異地包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?？墒褂谜T導(dǎo)型啟動(dòng)子控制眼細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的產(chǎn)生量和產(chǎn)生時(shí)間。如果所述基因產(chǎn)物在過(guò)量積累時(shí)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生例如毒性的某些不良影響，則可以使用此類啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括本領(lǐng)域已知的，例如Zn誘導(dǎo)的綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動(dòng)子、地塞米松(Dex)誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌病毒(MMTV)啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、昆蟲蛻皮激素啟動(dòng)子、四環(huán)素抑制系統(tǒng)、四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)、RU486誘導(dǎo)系統(tǒng)和雷帕霉素誘導(dǎo)系統(tǒng)?？墒褂檬艿絿?yán)格調(diào)控并且對(duì)特定類型的眼部耙細(xì)胞具有特異性的任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。其他可用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子類型是受特定生理狀態(tài)，例如溫度、急性期、細(xì)胞復(fù)制或分化狀態(tài)調(diào)控的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。對(duì)用于本發(fā)明的多種載體和調(diào)控元件的選擇是常規(guī)、成熟且容易獲得的技術(shù)。參見(jiàn)，例如Sambrook"fl/.,如上和Ausubel如上。很容易理解，不是所有載體和表達(dá)調(diào)控序列都以同樣良好的功能表達(dá)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因(優(yōu)選Chop2)。很明顯，基于一般常識(shí)和本文提供的指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在已知表達(dá)調(diào)控序列中進(jìn)行常規(guī)選擇，而不脫離本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇一條或多條表達(dá)調(diào)控序列，可操作地將其連接到將表達(dá)的編碼序列上以產(chǎn)生微基因，將所得微基因或載體插入AAV載體，并遵循已知的rAAV包裝方法將所述載體包裝到感染性顆?；虿《绢w粒中。rAAV的生產(chǎn)可使用本文所述以及本領(lǐng)域熟知的材料和方法構(gòu)建并生產(chǎn)本發(fā)明中使用的rAAV。用于生產(chǎn)本發(fā)明任意構(gòu)建物的優(yōu)選方法是常規(guī)方法，并包括基因工程、重組工程和合成技術(shù)，例如在上文引用文獻(xiàn)中列出的方法。簡(jiǎn)要而言，為了將rAAV構(gòu)建物包裝到rAAV病毒顆粒中，宿主細(xì)胞中必須存在表達(dá)AAVrep和AAVcap或其功能性片段所必須的序列，以及產(chǎn)生AAV所必須的輔助基因。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利公開2007/0015238，其中描述了編碼不同血清型AAVRep和Cap蛋白以及提供輔助功能的AdV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的rAAV假型病毒顆粒載體的產(chǎn)生。例如，可通過(guò)任意己知的方式將AAV和c，序列引入到宿主細(xì)胞中，所述方式包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂質(zhì)體遞送、膜融合、由基因槍遞送DNA包被小球、病毒感染和原生質(zhì)體融合?？稍诒景l(fā)明的范圍內(nèi)使用最近公開(例如，美國(guó)專利公開2005/0277868，并入本文作為參考)的、以基因治療為目的的特別設(shè)計(jì)用于向眼內(nèi)和眼周圍特定區(qū)域遞送DNA的基因療法的設(shè)備。例如，此類設(shè)備利用電穿孔和電遷移方式向眼內(nèi)和眼周圍特定區(qū)域遞送DNA，前題是例如具有兩個(gè)可放置于視網(wǎng)膜后的位于柔性支持物上的電極。第三電極是空心支持物的一部分，也可用于向所需區(qū)域注射所述分子。所述電極可放置在眼部周圍，包括視網(wǎng)膜后或玻璃體內(nèi)。這些序列可作為游離基因穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)或穩(wěn)定地整合到細(xì)胞的基因組中。也可以使其在宿主細(xì)胞中更加瞬時(shí)地表達(dá)。例如，可用的核酸分子由5'向3'方向依次包含啟動(dòng)子、啟動(dòng)子和/序列起始位點(diǎn)之間任選的間隔子、AAVr印序列和AAVcop序列。優(yōu)選在同一個(gè)載體中提供"p和序列以及其表達(dá)調(diào)控序列，盡管這些序列也可以單獨(dú)地存在于載體個(gè)體中。所述啟動(dòng)子可以是任意合適的組成型、誘導(dǎo)型或天然啟動(dòng)子。提供Rep和Cap蛋白的遞送分子可以為任何形式，優(yōu)選可包含其他非病毒序列(例如用作標(biāo)記物的序列)的質(zhì)粒。此類分子通常不包括AAVITR和包裝序列。為了避免出現(xiàn)同源重組，應(yīng)消除其他病毒序列，特別是腺病毒序列。優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)的質(zhì)粒。可使用引用文獻(xiàn)中所述的常規(guī)基因工程或重組DNA技術(shù)。可根據(jù)廠商說(shuō)明書，使用磷酸鈣(Clontech)或EffecteneTM試劑(Qiagen)通過(guò)三重轉(zhuǎn)染方法產(chǎn)生rAAV。也可參見(jiàn)Herzog^a/.,1999，Nat.Med.5:56-63。通過(guò)培養(yǎng)包含本文所述rAAV的宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)rAAV病毒顆粒，該細(xì)胞包括將被包裝到rAAV病毒顆粒中的rAAV構(gòu)建物、rAAVr印序列和AAVc，序列，所有以上序列均受指導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控序列的控制?？蓪⑦m合的病毒輔助基因，例如腺病毒E2A、E40rf6和VA優(yōu)選在單獨(dú)的質(zhì)粒上添加到培養(yǎng)物中。此后，在不存在污染性輔助病毒或野生型AAV的條件下，分離指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的rAAV病毒顆粒。評(píng)估特定表達(dá)調(diào)控序列是否適合給定轉(zhuǎn)基因以及選擇最適合轉(zhuǎn)基因表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列都是常規(guī)技術(shù)。例如，可在體外感染細(xì)胞，并通過(guò)Southern雜交或定量PCR監(jiān)測(cè)所述細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)量?？赏ㄟ^(guò)Northern雜交和定量RT-PCR監(jiān)測(cè)所述細(xì)胞中的RNA表達(dá)水平?？赏ㄟ^(guò)Western雜交、免疫組化，包括酶免疫測(cè)定(EIA)(例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA))、放射性免疫測(cè)定(RIA)的免疫測(cè)定或通過(guò)其他方法檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)的水平。具體實(shí)施方案描述于下文的實(shí)施例中。本發(fā)明的藥物組合物和方法應(yīng)使用常規(guī)方法評(píng)估上述用于眼部靶細(xì)胞的、包含Chop2轉(zhuǎn)基因和細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的rAAV的污染情況，并將其配制成可通過(guò)如視網(wǎng)膜下注射施用的滅菌或無(wú)菌藥物組合物。此類制劑包含藥學(xué)和/或生理上可接受的溶劑、稀釋劑、載體或賦形劑，29例如鹽緩沖液或其他緩沖液(例如HEPES)以維持生理pH。關(guān)于此類成分及其審U齊U的論述，通?？蓞⒁?jiàn)Gennaro,AE.,iew/"gto":J7ze5We"ce戶racf/ce尸/7a削aqy，LippincottWilliams&WilkinsPublishers;2003或最新版。也可參見(jiàn)WO00/15822。如果所述制劑將長(zhǎng)期保存，可進(jìn)行冷凍，例如在甘油存在下進(jìn)行冷凍。可通過(guò)任意合適的途徑向患有視覺(jué)疾病或致盲性疾病的受試者施用上述藥物組合物，優(yōu)選通過(guò)玻璃體內(nèi)或視網(wǎng)膜下注射，這取決于靶向的視網(wǎng)膜層。Bennett及其同事的公開(被本文引用)涉及對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮(即玻璃體腔最遠(yuǎn)端層)的革巴向。根據(jù)本發(fā)明，所述DNA構(gòu)建物靶向于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或雙極細(xì)胞。本文公開的玻璃體內(nèi)注射可很好地進(jìn)入神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。玻璃體內(nèi)和/或視網(wǎng)膜下注射可產(chǎn)生對(duì)雙極細(xì)胞的必要進(jìn)入，特別是在因退化而不存在感光細(xì)胞層的情況下，該情況也是本發(fā)明人期望克服的某些形式的退化疾病中的情況。為了測(cè)試通過(guò)AAV介導(dǎo)的遞送后病毒表達(dá)轉(zhuǎn)基因的能力，特別是在哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜神經(jīng)元中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的能力，可將相連接的優(yōu)選啟動(dòng)子序列-報(bào)告基因(例如LacZ或GFP)-8￥40聚腺苷序列的組合插入到質(zhì)粒中，并包裝到rAAV病毒顆粒中，濃縮，測(cè)定污染腺病毒并使用侵染中心試驗(yàn)滴定rAAV。通過(guò)視網(wǎng)膜下向多個(gè)待測(cè)受試者(優(yōu)選純系小鼠)的右眼注射約lplrAAV制劑(例如，每mL大于約l(T個(gè)感染單位)。兩周后，取出半數(shù)動(dòng)物的右眼(測(cè)試組)和左眼(對(duì)照組)，固定，并使用合適底物、抗體或其他物質(zhì)染色以顯示報(bào)告基因的存在。在接受注射的眼睛中，大部分測(cè)試視網(wǎng)膜都可顯示一個(gè)焦點(diǎn)染色區(qū)域，例如，藍(lán)色LacZ/Xgal或綠色GFP，這個(gè)結(jié)果與注射病毒產(chǎn)生的局部視網(wǎng)膜脫落的視網(wǎng)膜下小泡一致。所有作為對(duì)照的眼睛均為報(bào)告基因產(chǎn)物陰性。在注射后至少10周的時(shí)期內(nèi)，都可在隨后處死的小鼠中檢測(cè)到報(bào)告基因的表達(dá)，這表明了報(bào)告轉(zhuǎn)基因的持續(xù)表達(dá)。攜帶編碼Chop2DNA的核酸序列的rAAV病毒顆粒的有效量?jī)?yōu)選為每次約150jil至約800pl的注射體積中含約101()至約1013個(gè)rAAV感染單位，其中所述核酸序列在啟動(dòng)子的控制之下，所述啟動(dòng)子優(yōu)選為組成型CMV啟動(dòng)子或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(例如mGluR6)?？筛鶕?jù)McLaughlin,SK"a/.，1988,/Wra/62:1963測(cè)定rAAV感染單位。更優(yōu)選地，所述有效量在約101()至約1012個(gè)rAAV感染單位之間，且所述注射體積優(yōu)選在約250pl至約500pl之間?？煽紤]接受治療的受試者(優(yōu)選人)的身體狀況，包括年齡、體重、健康狀況以及特定眼部疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性，由專業(yè)治療人員選擇其他的劑量和體積，優(yōu)選在所述范圍內(nèi)選擇也可以在范圍外選擇。施用額外劑量("強(qiáng)化劑量(booster)")的本發(fā)明核酸或rAAV組合物也是可取的。例如，根據(jù)眼部靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的持續(xù)時(shí)間，可在6個(gè)月或一年后施用第二次治療，并進(jìn)行類似的重復(fù)?？紤]到所使用的途徑和劑量，預(yù)期不會(huì)產(chǎn)生AAV的中和抗體，從而可以進(jìn)行系列的重復(fù)治療。例如，可使用熟知的電生理學(xué)和其他視網(wǎng)膜和視覺(jué)測(cè)試以及視覺(jué)行為測(cè)試，由專業(yè)治療人員檢測(cè)對(duì)此類額外劑量的需要。所述專業(yè)治療人員能夠選擇應(yīng)用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)的合適測(cè)試。可使用單次劑量或多次劑量注射較大體積的所述組合物以進(jìn)一步改善相關(guān)結(jié)果參數(shù)?；謴?fù)或改善光敏感性和視覺(jué)可使用體外和體內(nèi)研究評(píng)估本發(fā)明的多種參數(shù)，該研究包括人眼部致盲性疾病的公認(rèn)動(dòng)物模型?？墒褂萌艘暰W(wǎng)膜病(例如兒童盲)的大動(dòng)物模型。本文提供的實(shí)施例可使本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地預(yù)期本方法可同樣用于治療一系列視網(wǎng)膜疾病。其他人的早期試驗(yàn)證明可通過(guò)基因治療技術(shù)延緩視網(wǎng)膜退化，而本發(fā)明證明了明確的生理功能恢復(fù)，其具有產(chǎn)生或改進(jìn)多種視覺(jué)參數(shù)(包括行為參數(shù))的前景。可使用已知的動(dòng)物模型或測(cè)試獲得行為評(píng)估，例如水迷宮行為測(cè)試，在此測(cè)試中，視覺(jué)得到不同程度保存或恢復(fù)的受試者將游向光亮處(Hayes，JM"a/"1993，5e/zavG麼f25:395-403)。在成年期誘發(fā)失明的模型中或先天性失明發(fā)展緩慢從而使個(gè)體在失明前有過(guò)視覺(jué)體驗(yàn)的模型中，可在多個(gè)測(cè)試中對(duì)所述對(duì)象進(jìn)行訓(xùn)練。這樣，在喪失視覺(jué)后重新進(jìn)行這些測(cè)試以檢測(cè)本發(fā)明組合物和方法對(duì)于其視覺(jué)恢復(fù)作用的效力時(shí)，不必在失明狀態(tài)下再讓所述動(dòng)物重新學(xué)習(xí)所述任務(wù)。其他行為測(cè)試不需要學(xué)習(xí)，而依賴于特定的本能行為。一個(gè)實(shí)例是視動(dòng)震顫試驗(yàn)(BalkemaGW"a/"1984,/"veWQp/zAa/mo/Ws5W.25:795-800;MitchinerJCefa/.,1976,Rs/o"i饑76:1169-71)。如本文的例證，使用編碼Ch叩2的DNA轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜神經(jīng)元可以向殘余視網(wǎng)膜神經(jīng)元，特別是雙極細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞提供光敏膜通道。因此，可使用強(qiáng)光刺激來(lái)測(cè)定視覺(jué)刺激向動(dòng)物視皮層(負(fù)責(zé)加工視覺(jué)信號(hào)的大腦的區(qū)域)的傳輸；由此形成一種如本文所期望的視覺(jué)形式。這種視覺(jué)可能與正常人視覺(jué)的形式不同，并可被稱為光感覺(jué)，也稱為"光感"(lightdetection,lightperception)。因此，本文所用術(shù)語(yǔ)"視覺(jué)"被定義為生命體有效察覺(jué)光刺激以進(jìn)行分辨或行動(dòng)的能力。所述視覺(jué)旨在涵蓋以下內(nèi)容1.光的察覺(jué)或光感辨別是否有光存在的能力；2.光投影辨認(rèn)光刺激方向的能力；3.分辨力察覺(jué)光柵或字母目標(biāo)中不同亮度水平(即對(duì)比度)的能力；4.識(shí)別力通過(guò)參考目標(biāo)內(nèi)不同對(duì)比度水平來(lái)識(shí)別可視目標(biāo)形狀的能力。因此，所述"視覺(jué)"包括簡(jiǎn)單察覺(jué)光存在的能力。這使得訓(xùn)練已接受本發(fā)明光察覺(jué)治療的患病受試者成為可能，從而使該個(gè)體能夠?qū)嚯x較遠(yuǎn)環(huán)境作出響應(yīng)，而不管此相互作用如何簡(jiǎn)單。在一個(gè)實(shí)例中，產(chǎn)生弱視患者能對(duì)其作出響應(yīng)的信號(hào)陣列，可增強(qiáng)所述患者通過(guò)較遠(yuǎn)的電子手段進(jìn)行交流或完成日常工作的能力。此外，如果接受過(guò)使用此類由"光感(光的察覺(jué))"引起的重建光感覺(jué)的訓(xùn)練，可顯著增強(qiáng)此類患者的活動(dòng)性。完全失去光感的人將無(wú)法(除聽(tīng)覺(jué)和嗅覺(jué)外)辨別任何遠(yuǎn)離其本身的事物。本發(fā)明的方法即便不能恢復(fù)完全正常的視覺(jué)也可引起光感，而且還能夠改進(jìn)或獲得控制很多生理過(guò)程(包括睡眠-覺(jué)醒周期和相關(guān)激素)的正常晝夜生理節(jié)律。盡管一些具有殘余視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的失明個(gè)體能夠使用RGC黑素蛋白介導(dǎo)其生理節(jié)律，但這樣做的個(gè)體非常罕見(jiàn)。因此，大多數(shù)失明患者具有自由運(yùn)轉(zhuǎn)的晝夜生理節(jié)律。即便此類個(gè)體的確利用了黑視蛋白途徑，其效果也非常微弱。因此預(yù)期本發(fā)明的方法能夠通過(guò)使失明個(gè)體重新獲得光線捕捉能力或改進(jìn)失明個(gè)體中生理節(jié)律的被弱化的光線捕捉能力(黑視蛋白介導(dǎo))從而改善失明個(gè)體的健康狀況。由此使這些受試者獲得較好的健康和生存狀況。除生理節(jié)律外，本發(fā)明還提供了改善其他光誘導(dǎo)生理現(xiàn)象中缺陷的基礎(chǔ)。光感器退化可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)活性在個(gè)體應(yīng)當(dāng)睡眠的晝夜循環(huán)間隔期中被不同程度地負(fù)掩蔽或抑制。另一個(gè)結(jié)果是對(duì)松果體褪黑激素的抑制。這些都有助于捕捉過(guò)程。因此，對(duì)于光感器正在或已經(jīng)退化的受試者，這些響應(yīng)或活性的改善有助于使受試者獲得與其所處真實(shí)世界的環(huán)境相對(duì)應(yīng)的睡眠覺(jué)醒周期，而這與其視力本身無(wú)關(guān)。本發(fā)明的另一個(gè)好處是使瞳孔對(duì)光的反射正?；?，這是因?yàn)檎{(diào)控瞳孔大小有助于調(diào)節(jié)光刺激在天然反饋回路中的有效性。因此，本發(fā)明促進(jìn)了此類天然反饋回路的重建，使接受如本文所述治療的受試者獲得更有效的視覺(jué)。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括在施用包含例如編碼Chop2的DNA的載體之前且優(yōu)選在施用所述載體之后測(cè)定視覺(jué)。可使用本領(lǐng)域己知或尚未建立的任意多種方法測(cè)定視覺(jué)。本文中最優(yōu)選以下視覺(jué)響應(yīng)(1)受試者暴露于光刺激后的光感響應(yīng)——其中在開燈后，尋找受試個(gè)體在光的總的方向上做出指示或運(yùn)動(dòng)的可靠響應(yīng)的跡象；(2)受試者暴露于光剌激后的光投影相應(yīng)——其中在開燈后，尋找個(gè)體在特定光方向上做出指示或運(yùn)動(dòng)的可靠響應(yīng)的跡象；(3)受試者對(duì)明暗相間圖案的視覺(jué)刺激的光分辨力，其中根據(jù)以下跡象測(cè)定受試者分辨明暗相間圖案的視覺(jué)刺激的能力(a)出現(xiàn)明顯可靠的由視動(dòng)產(chǎn)生的震顫眼動(dòng)和/或表明目標(biāo)蹤跡的相關(guān)頭部或身體運(yùn)動(dòng)(見(jiàn)上)和/或(b)出現(xiàn)區(qū)分圖案視覺(jué)刺激的可信能力并通過(guò)口頭或非口頭方式表明此類區(qū)分能力，包括例如用手指指向或按鍵或按鈕；或(4)視皮層對(duì)閃光刺激或圖案視覺(jué)刺激的電記錄，這是從被恢復(fù)的視網(wǎng)膜到視皮層的電傳遞的終點(diǎn)?？赏ㄟ^(guò)在視皮層區(qū)域的頭皮表面、皮層表面進(jìn)行的電記錄和/或視皮層細(xì)胞內(nèi)的記錄來(lái)進(jìn)行測(cè)量。本領(lǐng)域已知，通常很難讓僅具有光感的兒童意識(shí)到他們具有這種視覺(jué)。需要進(jìn)行訓(xùn)練以使此類兒童對(duì)其視覺(jué)做出響應(yīng)。在下列示例的動(dòng)物試驗(yàn)中模擬了此種情況。通過(guò)本發(fā)明組合物和方法實(shí)現(xiàn)對(duì)視覺(jué)的促進(jìn)或增強(qiáng)是很有價(jià)值的，這是因?yàn)榫哂泄飧械幕颊呓?jīng)過(guò)訓(xùn)練不僅能夠看到光，而且通常能夠察覺(jué)光的視覺(jué)方向，這樣就能夠訓(xùn)練他們?cè)谄洵h(huán)境中活動(dòng)的能力。此外，視覺(jué)受損的個(gè)體(包括使用本發(fā)明組合物和方法改善視力的那些個(gè)體)甚至可以使用基本的光感以及專門設(shè)計(jì)的電子和機(jī)械設(shè)備來(lái)完成特定的日常工作。在33此之外并根據(jù)其狀況，所述個(gè)體甚至可以接受分辨力任務(wù)的訓(xùn)練，例如，特征識(shí)別，乃至于在其受損狀況允許的條件下進(jìn)行閱讀。因此，預(yù)期本發(fā)明能夠增強(qiáng)視覺(jué)受損受試者的視覺(jué)，從而通過(guò)應(yīng)用額外的訓(xùn)練方法使所述個(gè)體達(dá)到完成以上目標(biāo)的水平?；加幸姑ぐY患者的癥狀類似于低敏感視覺(jué)，色素性視網(wǎng)膜炎(RP)是夜盲癥的實(shí)例，其患者很難適應(yīng)所處環(huán)境的光水平，并且可能使用光放大設(shè)備，例如補(bǔ)光設(shè)備和/或夜視設(shè)備。因此，對(duì)于人類而言，下文所述動(dòng)物研究中描述的視覺(jué)恢復(fù)可使患者獲得低端的視覺(jué)功能。此外，所述水平的獲得具有顯著的益處，因?yàn)?，獲得該水平的這些個(gè)體能夠接受活動(dòng)能力的訓(xùn)練和潛在地接受低級(jí)分辨任務(wù)的訓(xùn)練，這些訓(xùn)練將向其提供大大超過(guò)全盲個(gè)體的水平提高的視覺(jué)獨(dú)立性。本發(fā)明實(shí)施例中的試驗(yàn)小鼠完全沒(méi)有光感器，這即使在最嚴(yán)重的人疾病中也非常罕見(jiàn)。與其最相似的人狀態(tài)是RP。在大多數(shù)RP病例中，直到最后仍保留有中央視覺(jué)。相反，在試驗(yàn)小鼠模型中，小鼠出生后不久即完全失明。J.Tasca禾口E.A.Deglin在E^ewf/a/so/丄cwJ^S7.ow戶rac"ce，R丄.Brilliant,W.，ButterworthHeinemannPubl.，1999的第六章中描述了導(dǎo)致低視力的常見(jiàn)疾病，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文。存在有關(guān)于類似退化疾病的參照物，但是這些參照物顯示出可作為視覺(jué)靈敏度測(cè)量的形態(tài)視覺(jué)。在所有形式的RP中都沒(méi)有保留神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，因此，本發(fā)明的方法對(duì)此類疾病不起作用。在將本發(fā)明的方法應(yīng)用到患有嚴(yán)重RP病癥的人類時(shí)，期望將在一段時(shí)間內(nèi)保持相當(dāng)?shù)退降闹醒胍曈X(jué)，同時(shí)首先在外周視網(wǎng)膜發(fā)生退化。這類退化視網(wǎng)膜是使用本發(fā)明進(jìn)行再活化的目標(biāo)。實(shí)際上，這些個(gè)體在其逐漸失明的過(guò)程中，能夠保留其運(yùn)動(dòng)視覺(jué)。期望本發(fā)明的治療有益于患有黃斑退化的受試者，其中黃斑退化的特征是中央"最佳(sweetspot)"視覺(jué)區(qū)(黃斑)內(nèi)喪失光感器，在這種情況下，由于人黃斑中具有更加高的神經(jīng)元密度，預(yù)計(jì)恢復(fù)的視力可具有較高的分辨能力。盡管預(yù)期利用日光和人工光的明亮光照足以使視力受損的個(gè)體利用由本發(fā)明治療恢復(fù)的視覺(jué)進(jìn)行多種視覺(jué)活動(dòng)，但是也可以根據(jù)需要使用光放大設(shè)備，從而進(jìn)一步增強(qiáng)受損個(gè)體的視覺(jué)敏感性。人的視覺(jué)系統(tǒng)能夠在10個(gè)對(duì)數(shù)34單位的亮度范圍內(nèi)起作用。另一方面，如ChR2的微生物性視紫紅質(zhì)，可在高達(dá)3個(gè)對(duì)數(shù)單位的亮度范圍內(nèi)起作用。此外，患者遇到的光條件可能位于光感受器的作用范圍之外。為了均衡多種光條件，可使用光預(yù)放大或衰減設(shè)備來(lái)放大光條件的作用范圍。此類設(shè)備可包括可由現(xiàn)有技術(shù)組裝的相機(jī)、圖像加工系統(tǒng)和微型顯示器，例如，夜視鏡和/或3D冒險(xiǎn)和娛樂(lè)系統(tǒng)(參見(jiàn)，例如因特網(wǎng)地址eniagin.com/)本發(fā)明可與本領(lǐng)域已知的其他形式的視覺(jué)療法組合使用。這些視覺(jué)療法的主要部分是使用視覺(jué)假體，包括視網(wǎng)膜植入物、皮層植入物、外側(cè)膝狀體植入物或視神經(jīng)植入物。因此，在使用本方法對(duì)殘留視網(wǎng)膜神經(jīng)元進(jìn)行基因修飾之外，也可以在實(shí)施分子方法之前、期間或之后向接受治療的受試者提供視覺(jué)假體。可通過(guò)對(duì)個(gè)體進(jìn)行訓(xùn)練來(lái)改進(jìn)視覺(jué)假體的效力，以此按本文的預(yù)期增強(qiáng)對(duì)患者細(xì)胞Chop2轉(zhuǎn)化的潛在影響。訓(xùn)練方法的實(shí)例可在US2004/0236389(Fink"fl/.)中找到，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。該訓(xùn)練方法可包括基于參照?qǐng)D像，向帶有視覺(jué)假體的患者提供非視覺(jué)參照刺激。所述非視覺(jué)參照剌激的目的是向所述患者提供將由假體引發(fā)的期望視覺(jué)圖像。非視覺(jué)參照刺激的實(shí)例有插接板、Braille盲文或口頭交流。視覺(jué)假體使用一系列剌激圖像刺激患者的神經(jīng)細(xì)胞(包括已通過(guò)表達(dá)本文公開的Chop2來(lái)改進(jìn)其響應(yīng)的那些細(xì)胞)，從而嘗試誘發(fā)與患者對(duì)來(lái)自非視覺(jué)參考刺激的期望知覺(jué)相匹配的視知覺(jué)?；颊咛峁┓答佉哉f(shuō)明所述一系列剌激模式中的哪一個(gè)引發(fā)了與期望知覺(jué)最相近的知覺(jué)。將患者的反饋用作"適應(yīng)度函數(shù)"(也稱為成本函數(shù)或能量函數(shù))。隨后，至少部分地基于患者先前關(guān)于哪一個(gè)圖像引發(fā)了與期望知覺(jué)最匹配的知覺(jué)的反饋，通過(guò)視覺(jué)假體向所述患者提供隨后的剌激。所述隨后的剌激模式也可以至少部分地基于適應(yīng)度函數(shù)的優(yōu)化算法，例如模擬退火算法或遺傳算法。因此，在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，改進(jìn)或恢復(fù)受試者視覺(jué)的方法還包含對(duì)受試者進(jìn)行如上所述的訓(xùn)練。訓(xùn)練方法的優(yōu)選實(shí)例有(a)適應(yīng)性訓(xùn)練，其特征是訓(xùn)練受試者識(shí)別(0變化水平的光和/圖案刺激，和/或(ii)如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的來(lái)自普通光源或物體的環(huán)境刺激;和(b)方向性和運(yùn)動(dòng)性訓(xùn)練，其特征是訓(xùn)練受試者通過(guò)視覺(jué)發(fā)現(xiàn)局部物體，并且與未接受訓(xùn)練相比可更有效地在這些物體間移動(dòng)。實(shí)際上，常用于復(fù)原低視力領(lǐng)域中的任何視覺(jué)刺激技術(shù)都可以在本文中應(yīng)用。由光感器退化引發(fā)的視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元重塑引起了對(duì)光感器死亡后基于視網(wǎng)膜的補(bǔ)救策略的關(guān)注(StrettoiandPignatelli2000,PracA^/97:11020-5;Jones,BWa"/.，2003，/CwwpTVewra/464:1-16;Jones,BWandMarc，RE,2005,~爭(zhēng)to.S7:123-37;Jones，BW"a/.,2005,C//"~(9;tom.敝282-91)。人們認(rèn)為視網(wǎng)膜重塑是傳入神經(jīng)阻滯(即喪失來(lái)自光感器的傳入信號(hào))的結(jié)果，換句話說(shuō)，也就是喪失光誘導(dǎo)活性的結(jié)果。因此，在桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞死亡后，沒(méi)有輸入視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的光誘發(fā)信號(hào)，也沒(méi)有通過(guò)視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞輸入較高視覺(jué)中樞的光激發(fā)信號(hào)。在對(duì)此類輸入信號(hào)喪失的響應(yīng)中，激發(fā)視網(wǎng)膜和高級(jí)視覺(jué)網(wǎng)絡(luò)以尋找其他形式的輸入信號(hào)的方式進(jìn)行重塑。也就是說(shuō)，需要視網(wǎng)膜用于感受光以維持其正常的網(wǎng)絡(luò)，而隨著光感覺(jué)的喪失，所述網(wǎng)絡(luò)將通過(guò)重塑過(guò)程而削弱。此過(guò)程并不是光感器死亡的直接結(jié)果，相反，這是一個(gè)緩慢的過(guò)程，為干涉治療提供了相當(dāng)長(zhǎng)的期限。因此，本發(fā)明恢復(fù)視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元光敏感性的另一個(gè)用途是預(yù)防或延緩視網(wǎng)膜的重塑過(guò)程，并可能預(yù)防或延緩較高中樞的重塑過(guò)程。此類視網(wǎng)膜重塑可能產(chǎn)生不良結(jié)果，例如視網(wǎng)膜內(nèi)層網(wǎng)絡(luò)的破壞，主要是雙極細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞間連接的破壞。通過(guò)向雙極細(xì)胞或神經(jīng)節(jié)細(xì)胞引入光誘發(fā)活性，本方法將預(yù)防或減少由于缺乏輸入信號(hào)造成的重塑；本方法引入此缺失輸入信號(hào)(由雙極細(xì)胞或神經(jīng)節(jié)細(xì)胞起始)，從而穩(wěn)定視網(wǎng)膜和較高視覺(jué)中樞網(wǎng)絡(luò)。因此，除了其對(duì)視覺(jué)的直接效果之外，本發(fā)明還有利于其他治療方法，例如光感器移植或設(shè)備植入?，F(xiàn)已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了大體的描述，參考以下實(shí)施例可更加容易地理解所述的相同內(nèi)容，所提供的實(shí)施例僅用于說(shuō)明，除非另有說(shuō)明，不用來(lái)限制本發(fā)明。實(shí)施例大綱f以T^分鄉(xiāng)游參教微附JT享絲,方法通過(guò)連接編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核酸(下文所示SEQIDNO:l的一部分)和編碼channel叩sin-2(Chop2)的活性片段的核酸(SEQIDNO:2)制備Chop2-GFP嵌合體，從而使表達(dá)的蛋白具有與Chop2區(qū)C-末端相連的GFP。這兩條序列組成上文所述的"轉(zhuǎn)基因"。將受CMV啟動(dòng)子調(diào)控的Chop2-GFPDNA轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中。通過(guò)將Chop2-GFP亞克隆至包含CAG啟動(dòng)子的AAV-2病毒盒來(lái)制備病毒構(gòu)建物(SEQIDNO:l)。圖7顯示了此構(gòu)建物的圖譜。將所述病毒載體注射到新生大鼠的眼中。通過(guò)整裝視網(wǎng)膜或視網(wǎng)膜切片中的GFP熒光來(lái)測(cè)定Chop2-GFP的表達(dá)。通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗記錄評(píng)估Chop2-GFP的功能。結(jié)果轉(zhuǎn)染后18-24小時(shí)內(nèi)可在HEK細(xì)胞中檢測(cè)到GFP的明亮熒光。熒光主要位于質(zhì)膜。通過(guò)膜片鉗記錄確認(rèn)了Chop2-GFP功能的保持。沒(méi)有添加外源全反式視黃醛時(shí)，也在表達(dá)Chop2-GFP的HEK細(xì)胞中觀察到大量光門控電流，說(shuō)明僅使用發(fā)色團(tuán)基團(tuán)的內(nèi)源前體就可在HEK細(xì)胞中形成顯著數(shù)量的功能性Chop2-GFP通道。在注射后3至4周，可在接受注射的眼睛的視網(wǎng)膜神經(jīng)元中觀察到GFP熒光。在注射后至少10周，在很多神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和水平細(xì)胞、一些無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞以及少量的雙極細(xì)胞中觀察到GFP的明亮熒光。表達(dá)Chop2-GFP的視網(wǎng)膜神經(jīng)元在響應(yīng)光刺激時(shí)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的膜去極化，并且不需要外源的全反式視黃醛。因此，本發(fā)明人證明，所選AAV載體構(gòu)建物可有效靶向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，并在對(duì)正常和患病視網(wǎng)膜進(jìn)行視網(wǎng)膜內(nèi)注射后，高水平地遞送Chop2-GFPcDNA并表達(dá)蛋白質(zhì)。內(nèi)源視網(wǎng)膜與Chop2結(jié)合后，也由光控來(lái)開關(guān)，并可誘發(fā)視網(wǎng)膜中和皮層水平上的神經(jīng)活性。這一點(diǎn)可以通過(guò)多種技術(shù)證明——首先，通過(guò)單個(gè)游離RGC的體外膜片鉗記錄，隨后通過(guò)代表大量RGC群體的整裝視網(wǎng)膜標(biāo)本的多電極陣列記錄。最后，來(lái)自活的失明小鼠的體內(nèi)皮層記錄證明較高視覺(jué)中樞的功能性關(guān)鍵連接得到了保留。結(jié)論所述體外和體內(nèi)進(jìn)展結(jié)果表明Chop2的異位表達(dá)是恢復(fù)"失明"視網(wǎng)膜光敏感性的治療性策略。在大鼠體內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)元中證明了直接光門控膜通道Chop2的功能性表達(dá)。因此，在二級(jí)或三級(jí)視網(wǎng)膜神經(jīng)元中表達(dá)光門控膜通道是光感器退化后恢復(fù)光感的有效策略。實(shí)施例l材料和方法DNA和病毒載體構(gòu)建物將編碼Chop2的N-末端片段(Met、Lys315)的DNA片段(NagelW2003)克隆至包含小鼠精蛋白-1基因最后一個(gè)外顯子和GFPcDNA的pBluescript載體(Stratagene)中以產(chǎn)生Chop2-GFP融合蛋白，其中所述外顯子含有多腺苷信號(hào)(mPl)，且GFPcDNA在Chop2編碼片段的3'-末端被插入到框中。在轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中驗(yàn)證了Chop2-GFP嵌合體的功能。通過(guò)將Ch叩2-GFP片段亞克隆至腺相關(guān)(血清型2)病毒表達(dá)盒來(lái)制備病毒表達(dá)構(gòu)建物rAAV2-CAG-Chop2-GFP-WPRE。所述病毒表達(dá)盒包含雜合的CMV增強(qiáng)子/雞P-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(CAG)、土撥鼠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)和牛生長(zhǎng)激素(BGH)多聚腺苷序列。包裝并親和純化病毒載體(GeneDetect)。載體圖譜顯示于圖7中。下文中以注釋形式(具有所述注釋)顯示了此載體的核酸序列(SEQIDNO:l):.ITR序列(兩端)(帶下劃線的大寫字母),CAG啟動(dòng)子序列(力7^&裔^>力^"字母).Kozak序列(帶雙下劃線的小寫字母).Chop2編碼序列(加粗的小寫字母)參綠色熒光蛋白編碼序列(帶下劃線的加粗小寫字母)WPRE(調(diào)控元件)(大寫字母)沒(méi)有標(biāo)記BGHPolyA序列。剩余序列(所有小寫字母)，包括Chop2與GFP之間的序列，是載體序列。<---------ITR----------CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTC60GGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCA120-----ITR------------》《--------dAG后動(dòng)子——ACTCCATCACTAGGGGTTCCTqcqqccqca，週柳，柳傳卿柳潛卯c-卯卯卯c卿師柳柳卿卿廣A廣會(huì)"rfl^F"加wJ>gcccgccccg還Ogctctgactgaccgcgttactcccac3ggtgagcgggcgggacggcccttctccttcgggJ卿ctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagcct</rozaA>6---------C々o/2-----tgaiggggctccgggagggcccgagctcgcg3tccac3accatggattatggaggcgccct1200gsgtgccgttgggcgcgagctgct3tttgtgtagtcgtcaatggctctgt12603cttgtgcctgaggaccagtgttactgcgcgggctggattgagtcgcgtg1320tgcccaaacggcgtcg33cgtgctgcaatggcttgctgctggcttctccatcctactgct1380tfitgttttsicgcctaccaaaceitggeieigtcaacctgcggctgggaggagatctstgtgtg1440cgctatcgagatggtcaaggtgattcttgagttcttcttcgagtttaagaacccgtccat1500gctgt￡Ltct3gccacaggccaccgcgtccagtggttgcgttacgccgagtggcttctc3c1560ctgcccggtc3ttCtC8lttCacctgtcaaacctgacgggcttgtcc33cgactacagcag1620gcgcactatgggtctgcttgtgtctgatattggcacaattgtgtggggcgccacttccgc1680tatggccaccggatacgtcaaggtcatcttcttctgcctgggtctgtgttatggtgctaa1740cscgttctttcacgctgccaaggcctacatcgagggttaccataccgtgccgaisgggccg1800gtgtcgccaggtggtgaictggcstggcttggctcttcttcgtatcatggggtatgttccc1860cstcctgttc3tcctcggccccgagggcttcggcgtcctg3gcgtgt3cggctccaccgt1920cggccacaccatcattgacctgatgtcgaagaactgctggggtctgctcggccactacct1980gcgcgtgctgstccscgeigc3t3tCCtC3tccacggcgacattcgcaagaccaccaaatt2040gaacattggtggcactgagattgaggtcgageicgctggtggaggacgaggccgsggctgg2100cgcggtcaacaagggcaccggcaaggaattcggaggcggaggtggagctaqcaaaqqa。a2160aqaactcttcactqqa。ttqtcccwttcttgttqssttscmtaatcmattaacaqcca2220caaqttctctgtcagtgq叫aqqqtaaaaatqatqcaacatacgqaaaacttsccctqas228039gttcatctacactactqgcaaactgcctgttccatggccaacact叫tcactactctqtq2340ctatggtcittcaatqcttttcaagatacccggatcatatgaaacggcatqactttttcaa2400qaqtgccatgcccgaaacittatatacaaqaaaqqaccatcttcatcaaaaataacq。caa2460ctacaaqacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagtt2520aaaaqgtattgacttcaaciciaaaat叫caacattctcicmacacaaattaaaatacaacta2590taactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagtqaactt2640caaqacccgccaceiacattaaaaataaaaicicattcetsctaacagetcc3tteitceuicaiseia2700tactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatc2760tgccctttcgaaagatcccaaccmaaaaaaacmccacatggtccttcttgagtttgtetac2820-----------------gfp------------------->agctgctgggattacacataacataqatqaactqtacaacatcgattgactaagcttgcc2880<--------------------WPREtcgagaattcacgcgtggtaCCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAA111GTGAAAGATT2940GACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCC3000TTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCA1111CTCCTCCTTGTATAAATCCTG3060GTTGCTGTCTUMATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCAC3120TGTG111GCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCLMIC3180CGGGACTTTCGU11CCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGC3240CCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAA3300GCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTC3360CTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCC3420GGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCC(_I1IG3480--------WPRE-------->GGCCGCCTCCCCGCCTGATCcggccgcggggatccagacatgataagatacattgatgag3540tttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgat3600gctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgc36603ttC3tttt3tgtttcaiggttcagggggaggtgtgggaggttttttcggatcctctagag3720<-----------------------bGHPolyA--------------------tcgagagatctsca口"a口c3tcrctpf^cccctccccaafacrtctcrf^7cccf口aa3780^ff^7ccactccapfpcccacraacctfatccfaataaaatf朋f7tfacatcaffffatc3840t^ctaaaf口fcctfcfafastattafg^yf^zaaaaaaafaafaf^yapcasaaaoca39003att^yaa^7acaacr亡"faaaacrfacaaaatcfatf^z口aaccasact^7af7fpcaaf3960^7cacastcffoactcacf口castctccacctccf^7attcasacaattcfccfacctca4020^/cctcccpagttyff^yattccaaacafoca加cca^7ctcaocfasfftffpt"tf4080ttaafaaaaacaa^/tttcaccafaffaoccawct^7tctccascrccfsstctcaaaf4140gratcfacccacrttoacrtcccassftgctaaaatfaca^7acyfga3c:cacfactcrrff4200-bGHPolyA—<----ITR——cccf口fccttctgattttgtaggtaaccacgtgcggaccgagcggccgcAGGAACCCCTA426040<formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>agcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccgg6780taagcggcagggtcggaacaggagagcgcaicgagggagcttccagggggaaacgcctggt6840atctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgct6900cgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctgg6960ccttttgctggccttttgctcacatgt6987以下SEQIDNO:2顯示了來(lái)自上述載體的Chop2編碼序列。編號(hào)表示核苷酸數(shù)和密碼子數(shù)。同時(shí)還顯示了編碼的多肽(SEQIDNO:3)。這同樣是Chop2多肽中N-末端的315個(gè)殘基(SEQIDNO:6)。aitggatggcgccctggccgttgggcgcctgttt48mdygga:lsavgref16gta3cgCC3gta>gtcgtc331ggctctgtscttgtgcct96VTNPVVV1siGSV:lVpED32cagtgttgcgcgggctgggsgtcgcgtggc站cggtgcc144qCYCAGw工ESRGTNGA48acggcgtcg站cgtgctgtggcttgetgetggcttctec192qTasnv:lqw:laagfsi64ctgctt3tgttttscgccta_ctggteatgcggc240二MFYAYQTwKSTCG80tgg3tCtstgtgtgcgetgaggtca^ggtg3ttctt288wEE工YVCa工EmVkV1:l96ttcttcttcttt幼g站Cccgtecstgctggcc336efffefkpsmy:lat112ggccgcgtccagtggttgcgttscgccgagtggcttetcseetgc384GHRVqw:lrYAEw:l:lTC128ccggtc3ttetc3ttC3Cctgctgacgggcttgtecga>c432pv工工hstgsnd144tsca^gccgcsetatgggtctgcttgtgtctgstggc3tt480Ysrrtmg!>:lvsd工gt工160gtgtggggcgcc3Cttecgetatggccseegtc幼ggtcate528vwGATSaMATGyVKv1176ttcttctgcctgggtctgtgttatggtgetttctttca_cget576ffcg:lcygantffha192gccgccta_c3tCggttscest3CCgtgccga_a_gggceggtgt624Akay工eGyhtvPKGRc208cgccsggtggtgsetggcgettggetcttcttcteatggggt672RQVVTGAwfVSwG2243tgttcccca_tcctgttcateetcggccccgsgggcttcggcgtcctg720MFP工F工:lGpEGFGV240a_gcgtgggctecseegtcggca_tcctgteg768SVYgstvght工工d:lms256tgctggggtctgetcggcC3Ctacctgcgcgtgctgate816KnCwGGHYRV工H272C3tetcC3Cggccgcaag3CCttg864EH工:l工hgd工rkttkn2883ttggtggcsetgaggtcctggtggsggacgaggec912工GGte工evetvedea304getggcgcggtcggc3CCggc945eAgavnkgtgk315編碼萊茵衣藻(C/^"/za^^/)全長(zhǎng)Chop2蛋白的天然核酸序歹U(GenBank登記號(hào)弁AF461397)具有如下核苷酸序列(SEQIDN0:4)。注意所述編碼序列起始于由第28位堿基開始的ATG起始密碼子。1gcatctgtcgattaaacATGgatt3tggsggcgccctgagtgccgttggg61cgcgagctgctatttgtaacgtcgtcsstggctctgtscttgtgcctg3g121gsccsgtgttactgcgcgggctggattgsgtcgcgtggcscaaacggtgcccas3cggcg181tcgascgtgctgcaatggcttgctgctggcttctccatcctsctgcttstgttttacgcc241ggaagtcascctgcggctgggsggagatctatgtgtgcgctatcgag3tg301gtcaaggtgattctcgsgttcttcttcgagtttaagaacccgtccatgctgtatctagcc361scaggccaccgcgtccagtggttgcgttacgccgsgtggcttctcscctgcccggtcatt421CtC3ttC3CCtgtc33scctgacgggcttgtcc33cga^ctscagesggegcsccstgggt481ctgcttgtgtctgststtggcacaattgtgtggggcgccscttccgccatggccsccggs541tacgtcaaggtcstcttcttctgcctgggtctgtgttatggtgctaacscgttctttcsc601gctgccaaggcctsc3tcg3gggtt3ccscsccgtgccgsagggccggtgtcgccsggtg661gtgactggcatggcttggctcttcttcgtatcstggggtatgttccccstcctgttcatc721ctcggccccgsgggcttcggcgtcctgagcgtgtscggctccsccgtcggCC3C3CC3tC7813ttgscctg3ctgctggggtctgctcggccactacctgcgcgtgctgatc841tCCtC3tCC3cggcgacattccaaattgaacattggtggc901sctgsgattgaggtcgagacgctggtggsggscgsggccgaggctggcgc961ggcsccggcaagtacgcctcccgcgsgtccttcctggtcstgcgcgsca31021aagggcattgscgtgcgcgcctctctggacaggtggagcaggsgcsggcc1081gc。gggctgccatgatgatgstgsacggcaatggcatgggtatgggsatgggaatgsac1141ggcstgaacggaatgggcggtatgaacggg3tggctggcggcgccasgcccggcctggag1201ctC3Ctccgc3gct3csgcccggccgcgtc3tcctggcggtgccggacatcagcatggtt1261gscttcttccgcgagcagtttgctcagctatcggtgacgtacgagctggtgccggccctg1321ggcgctgacaacacactggcgctggttacgcaggcgcagsacctgggcggcgtggscttt1381gtgttgattcaccccgagttcctgcgcgaccgctctsgcsccagcatcctgsgccgcctg1441cgcggcgcgggccagcgtgtggctgcgttcggctgggcgcsgctggggcccatgcgtgac1501ctgatcgagtccgc33scctggacggctggctggagggcccctcgttcggacagggcstc1561ctgccggcccacstcgttgccctggtggccaagatgcagca_ga±gcgcsagstgcagcsg1621atgcagcagattggcstgstgsccggcggcatgaacggcatgggcggcggtatgggcggc1681ggcatgaacggcstgggcggcggc33cggctgggcaacggcstgggcggc1741ggcstgggcaacggcatgggcggcs3tggctgggtggcggC33cggcatg1801gcggcaacgg33tggccggcaacggaatgggcggcggcstgggcggcasc1861ggtstgggtggctcc3tga_3cggcatgagctccggcgtggtggccaacgtgacgccctcc1921gccgccggcggcatgggcggggcggcatggctgcgcccc3gtcgcccggc1981atgsacggcggccgcctgggctcttcaacgccgcgccctcaccgctcagc2041tcgcsgctcggtgccgaggcaggcatgggcsgcatgggsggcstgggcgg2101stgggsggcatgggtggaatggggggcstgggcggcgccggcgccgccacgscgcsggct2161gcgggcggcaacgcggaggcggsgstgctgC3gwtctc3csatcgcctg2221aagcgcgagcttggcgagts3以下SEQIDNO:5顯示了SEQIDNO:4的編碼部分，由編碼737個(gè)氨基酸的多肽的737個(gè)三聯(lián)密碼子(以及一個(gè)終止密碼子)組成。突出顯示起始密碼子ATG和終止密碼子TAA。ATGgstt3tggaiggcgccctgagtgccgttgggcgcctgetatttgtascgCC3gtcgtcggctctcttgtgcctgsgC3gtgtt3Ctgcgcgggctggstttcgcgtggcggtgccscggcgtcggtgctgtggcttgetgetggcttctec3tCctgcttatgtttgcct3CtggsagtC33CCtgcggctgggsggaig3tCtstgtgtgcget3tCgsg3tggtc33ggtgsttetcgagttcttcttcgsgtttaagccgtecatgctgt3tCt3gccggcC3CcgcgtccsgtggttgcgttacgccgsgtggCttetc3CCtgcccggtcsttetc3ttC3CctgtC3ctgscgggcttgtecgacagcsggcgc3CC3tgggtctgcttgtgtctg3tsttggcgtgtggggcgccsettecgcc3tggcc3CCtscgtc33ggtc3tCttcttctgcctgggtctgtgttatggtgetscgttctttC3Cgetgcc33ggcct3C3tCggttscC3C3CCgtgccg33gggceggtgtcgccsggtggtg3Ctggcgettggetcttcttcgtatggggt3tgttcccc3tCctgttc3tCetcggccccgagggcttcggcgtcctgagcgtgtscggctecsecgtcggcC3C3CC3tC3ttgscctgatgtcg3sgtgctggggtctgetcggcC3Cctgcgcgtgctg3tCC3CgsgC3t3tCetc3tCC3Cggcgscaittcgcsag3CCseettg3ttggtggc3Ctgaggtcctggtggsggaggcc44getggcgcggtcggc3CCggc33gt3Cgccteccgcgsgtecttcctggtcstgcgcgac3己gggc3ttgacgtgcgcgcctctctggscsgcsaggsggtgcsggccgccsgggetgccatgstgatgstgggcggcatgggtstgggsstgggsstgggc3tgggs3tgggcggtatggggatggetggcggcgccsagcccggcctggagetcsetccgcsgCt3cagcccggccgcgtc3tCctggcggtgccggac3tCagestggttttcttccgcgsgcsgtttgetC3gctsteggtgtacgsgctggtgccggccctgggcgetgscctggcgctggttscgC3ggcgctgggcggcgtggsctttgtgttgsttC3Ccccgagttcctgcgccgctctage3CC3tCctgsgccgcctgcgcggcgcgggccsgcgtgtggetgcgttcggctgggcgcsgctggggccc3tgcgtgscctg3tCg叫tecgessaicctggaicggctggctggagggcccctegttcggscagggc3tCctgccggccategttgccctggtggccssgcsgatgcgc33gstgcag3tgcagcagsttggcstg3tgggcggcatgggc3tgggcggcggt3tgggcggcggcatgggcatgggcggcggcggcstgggcggc3tgggcggcggcatgggcggcatgggcggcatgggaggtggcggcggcstgatgggcggcggs3tggccggcggs3tgggcggcggcggcggcggtstgggtggctecggcstgtecggcgtggtggccgtgscgccctecgccgccggcggc3tgggcggc3tg3tgggcggcatggetgcgccccsgtegcccggcstgggcggccgcctgggtccgetcttcgccgcgcccccgetc3gctegetcggtgccgsggesggc3tgggcsgc3tgggsggcstgggcggn3gcggs3tgggcatgggtgg33tggggggcatgggcggcgccggcgccgccscggetgcgggcggcgcggcggsgatgctgcng33tetcatggagcgcctgsagcgcgsgcttggcgag2214個(gè)堿基由SEQIDNO:3和SEQIDNO:4編碼的萊茵衣藻(C.ra'"/^W"f)全長(zhǎng)Chop2蛋白具有以下氨基酸序列(SEQIDNO:6):可用于本發(fā)明的另一條有用的Chop2序列是編碼含310個(gè)氨基酸的多肽(全長(zhǎng)天然Chop2的生物活性片段)的、含933個(gè)堿基的核酸，這是來(lái)自于萊茵衣藻(C/2tomjWowo朋sra'w/z"^to')的合成構(gòu)建物(參見(jiàn)EF474017和ZhangWa/.,2007,Nature,待發(fā)表)。此序列經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以適合人體表達(dá)。下文所示堿基序列是SEQIDNO:7，并且所示編碼的氨基酸序列為SEQIDNO:8。具有SEQIDNO:8所示氨基酸序列的多肽是切去SEQIDNO:6中C-末端并將第310位Asn替換成Pro后的片段。atgt3tggcggcgetttgtctgecgtcggscgccttttgttc48MDYGGASAVGREF16gtt3Ct33tcctgtggtggtggggtecgtcctggtccctgsggst96VTNPVVVGSVI>VpED32tgtt3Ctgtgecggstgg3tttctcgcggcscgggcget144QCYCAGwIESRGTNGA48cag3CCgcgtC3gtcctgcsgtggcttgesgesggsttc3gc3tt192QTAsNVI<QwIiAAGFSI64ttgctgctgatgttct3tgectsc3CCtggtcttgcggc240MFYAYQTWKSTCG80tgggsggsg3tCt3tgtgtgcgec3ttgasatggttgtg3ttetc288WEEIYVCAIEMVKVII>96gsgttcttttttgsgtttssgccctctstgetctsccttgec336EFFFEFKNpSMIiYI<AT112gg3C3Cegggtgcsgtggctgcgct3tgesgsgtggctgetc3Cttgt384GHRVQw!<RYAEW!!<TC128cctgtc3tCctt3tCCSCctgetc3CCggcctgsgcgac432pVIIiIHSNI<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■attCSCggs3tCcgc3CC3CCctg33C864IGGTEIEVETIiVEDEA2883tCggcggascggsg3tCgaggtcgsgsetetcgtcgasgscgcc912IGGTEIEVETVEDEA304gsggccggsgccgtgCC3933EAGAVP終乂密碣310AAV載體注射所有動(dòng)物試驗(yàn)均參照NIH制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南在規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)上進(jìn)行。通過(guò)冰上冷卻來(lái)麻醉新生(PI)大鼠崽(Sprague-Dawley和Long-Evans)和小鼠崽(C57BL/6J和C3H/HeJ或W7々^0。通過(guò)IP注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)來(lái)麻醉成年小鼠(W//W/)。在解剖顯微鏡下，使用剪刀產(chǎn)生通過(guò)眼瞼的切口以暴露鞏膜。利用針在晶狀體后端的鞏膜區(qū)域產(chǎn)生小穿孔，并使用帶有32號(hào)平頭針的Hamilton注射器通過(guò)所述孔向玻璃體內(nèi)腔注射0.8-1.5Ml濃度約10"基因組顆粒/ml的病毒載體懸液。對(duì)于每只動(dòng)物，通常僅向一只眼注射攜帶Ch叩2-GFP的病毒載體，而另一只眼不進(jìn)行注射或注射僅攜帶GFP的對(duì)照病毒載體。注射后，將動(dòng)物飼養(yǎng)在12/12hr光/暗周期中。在500nm波長(zhǎng)下測(cè)量所述動(dòng)物飼養(yǎng)室中的光照為6.0x10"光子cm—2s—、組織學(xué)在注射載體后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物。在平鋪整裝視網(wǎng)膜、垂直視網(wǎng)膜和腦冠狀切片中檢査Chop2-GFP熒光的表達(dá)。使用含4%多聚甲醛的PBS溶液將解剖得到的視網(wǎng)膜和腦在室溫下固定0.5-2小時(shí)，并在4。C下固定24小吋。使用震動(dòng)切片機(jī)對(duì)固定的視網(wǎng)膜(包埋在3%的瓊脂糖中)和腦進(jìn)行切片。將視網(wǎng)膜和腦切片或整裝視網(wǎng)膜封固在載玻片上，并使用Vectashidd封固液(VectorLaboratories)覆蓋。在安裝有波長(zhǎng)分別為465-495nm、505nm和515-555nm的激發(fā)器、二色性濾波片、發(fā)射濾波片的熒光顯微鏡下觀察GFP熒光，并使用數(shù)碼相機(jī)(Axiocam,Zeiss)獲取大部分圖片。一些圖片由共聚焦顯微鏡(TCSSP2,Leica)獲取。為了在光學(xué)顯微鏡觀察半薄垂直視網(wǎng)膜切片，將眼球摘除，在PBS中清洗，并使用1%四氧化鋨、2.5%戊二醛和0.2MSorenson磷酸鹽緩沖液(pH7.4)在4。C下固定3小時(shí)。隨后，在梯度乙醇中對(duì)眼球進(jìn)行脫水，包埋在塑料中，切成lpm切片，并使用亞甲基藍(lán)/亞甲基天藍(lán)混合物進(jìn)行染色。膜片鉗記錄根據(jù)先前的描述(Pan,2000andCui"a/.,2003)制備游離視網(wǎng)膜細(xì)胞和視網(wǎng)膜切片。使用EPC-9放大器和PULSE軟件(HekaElectronik,Lambrecht,Germany)進(jìn)行全細(xì)胞模式的膜片電極記錄。記錄在Hanks溶液中進(jìn)行，該Hanks溶液包含(以mM計(jì))NaCl138、NaHC031、Na2HPO40.3、KC15、KH2P040.3、CaCl21.25、MgS040.5、MgCl20.5、HEPES-NaOH5、葡萄糖22.2和酚紅0.001%v/v;使用0.3匪aOH將pH調(diào)至7.2。電極溶液包含(以mM計(jì))K-葡糖酸鹽133、KC17、MgCl24、EGTA0.1、HEPES10、Na-GTP0.5和Na-ATP2;使用KOH將pH調(diào)至7.4。電極的電阻為1315MQ。記錄在室溫(~22°C)下進(jìn)行。多電極陣列記錄多電極陣列記錄基于Tian和Copenhagen(2003)提出的方法。簡(jiǎn)要而言，解剖視網(wǎng)膜并使光感器一側(cè)向下放置到硝化纖維濾紙條上(MilliporeCorp.,Bedford,MA)。將封固的視網(wǎng)膜放置在由間隔為200,的30直徑的電極組成的MEA-60多電極陣列記錄室(MultiChannelSystemMCSGmbH，Reutlingen,Germany)中，并使神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層朝向記錄電極。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，于34。C下向視網(wǎng)膜連續(xù)灌注氧化的細(xì)胞外溶液。所述細(xì)胞外溶液包含(以mM計(jì))NaCl124、KC12.5、CaCl22、MgCl22、NaH2P041.25、NaHC0326和葡萄糖22(pH7.35，并具有95%02和5%C02)。通常在將視網(wǎng)膜放置在記錄室后60分鐘開始記錄。每次光刺激發(fā)生的間隔時(shí)間為10-15秒。過(guò)濾200Hz(下限)和20kHz(上限)之間的信號(hào)。使用OfflineSorter軟件(Plexon,Inc.,Dallas,TX)分析單個(gè)神經(jīng)元的響應(yīng)。視覺(jué)誘發(fā)的電位記錄在4-6月齡C57BL/6和129/Sv系野生型小鼠和6-11月齡^/kl/小鼠中進(jìn)行視覺(jué)誘發(fā)的電位記錄。記錄在注射病毒載體2-6個(gè)月后進(jìn)行。在普通麻醉(腹腔注射氯胺酮(100mg/kg)和乙酰丙嗪(0.8mg/kg))后，在立體定位儀中固定動(dòng)物。不控制體溫，或使用加熱墊和直腸探針將體溫維持在34。C。使用1%阿托品和2.5。/。accu-苯腎上腺素(accu-phenylephrine)放大瞳孔。在距中線約2.5mm和距人字縫線前l(fā)mm的中央鉆取小部分頭骨(1.5x1.5mm)。使用深入到受刺激眼睛對(duì)側(cè)皮層表面下0.4mm的玻璃微吸管(吸入4MNaCl后電阻為0.5M)在視皮層(VI區(qū))進(jìn)行記錄。所述刺激為0.5Hz的20ms脈沖。將響應(yīng)放大(l，OOO至10,000倍)，帶通過(guò)濾(0.3-100Hz)、數(shù)字化(lkHz)，并對(duì)30-250個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行平均。光刺激在對(duì)游離細(xì)胞和視網(wǎng)膜切片的記錄中，使用帶寬10nm的基于150W氙燈的掃描單色儀(TILLPhotonics,Germany)產(chǎn)生光刺激，其中所述掃描單色儀通過(guò)光纖與顯微鏡相連。在多電極陣列記錄中，使用單色儀或帶有400-580nm帶通濾波器的基于175W氤燈的照明器(LambdaLS，SutterInstrument)誘發(fā)光響應(yīng)，并通過(guò)液態(tài)光導(dǎo)管將其投射到記錄室底部。對(duì)于視覺(jué)誘發(fā)的電位，使用單色儀產(chǎn)生光刺激，并通過(guò)光纖投射到眼部。通過(guò)中性密度濾光片削減光強(qiáng)度。通過(guò)薄型傳感器(TQ82017)和光學(xué)功率計(jì)(Model:TQ8210)(Advantest，Tokyo,Japan)測(cè)定光能。實(shí)施例2Chop2在體內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)元中的表達(dá)為了直接觀察Chop2蛋白的表達(dá)和定位，將Chop2通道的C-末端部分替換為GFP以制備Chop2-GFP嵌合體。選擇腺相關(guān)病毒(AAV)載體以在視網(wǎng)膜神經(jīng)元中靶向表達(dá)Chop2-GFP融合蛋白，這是考慮到AAV載體具有將轉(zhuǎn)基因遞送到包括視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元在內(nèi)的非分裂細(xì)胞(Harvey^a/.,2002andMartina/.,2003)中，并使轉(zhuǎn)基因整合到宿主基因組中的能力(Flotte,2004)。通過(guò)將Chop2-GFP嵌合體亞克隆到包含雜合的CMV增強(qiáng)子/雞(3-肌動(dòng)蛋白(CAG)啟動(dòng)子的AAV血清型2的表達(dá)盒(圖1A)中，以制備病毒表達(dá)盒rAAV2-CAG-Chop2-GFP-WPRE。通常為了確定Chop2通道在視網(wǎng)膜神經(jīng)元中的表達(dá)和功能，首先檢測(cè)Chop2在非營(yíng)養(yǎng)不良視網(wǎng)膜中的表達(dá)。將所述病毒載體注射到出生1天的大鼠和小鼠的眼睛玻璃體內(nèi)腔中。注射后3至4周，在所有接受注射的眼睛的視網(wǎng)膜神經(jīng)元中觀察到GFP的明亮熒光(圖1B-圖1H)，從而確認(rèn)了Chop2-GFP的表達(dá)。所述表達(dá)通常遍及整個(gè)視網(wǎng)膜(圖1B)。主要在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中觀察到Chop2-GFP熒光(圖1C和圖1D;另參見(jiàn)圖1H)。在整個(gè)內(nèi)網(wǎng)層(IPL)中觀察到熒光信號(hào)(圖1H)，這表明病毒載體在ON和OFF神經(jīng)元細(xì)胞中耙向表達(dá)Chop2-GFP。也常在水平細(xì)胞(圖1E)、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(圖IF)和少量的雙極細(xì)胞(圖1G)中觀察到Chop2-GFP的表達(dá)。GFP信號(hào)主要位于質(zhì)膜(圖1D)，這與GFP標(biāo)簽通過(guò)Chop2通道的七次跨膜部分錨定在細(xì)胞膜上相一致。一旦在細(xì)胞中表達(dá)，GFP信號(hào)可延伸至包括遠(yuǎn)端突起和軸突末端的整個(gè)細(xì)胞(參見(jiàn)圖1C和圖1E)。發(fā)現(xiàn)GFP的明亮熒光在注射后12個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定(圖1H)，同時(shí)沒(méi)有觀察到視網(wǎng)膜形態(tài)的總體變化(圖11)。這些結(jié)果說(shuō)明實(shí)現(xiàn)了在體內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)元中長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)Chop2-GFP。實(shí)施例3在表達(dá)ChR2的視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元中光誘發(fā)電流的性質(zhì)使用全細(xì)胞膜片鉗記錄測(cè)定視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元中Chop2通道的功能性質(zhì)。在明顯游離的細(xì)胞中進(jìn)行記錄以確保完全排除光感器介導(dǎo)的光響應(yīng)。通過(guò)GFP熒光確認(rèn)Chop2-GFP陽(yáng)性細(xì)胞(圖2A)。未加入Ch叩2發(fā)色團(tuán)基團(tuán)的前體全反式視黃醛，原因是全反式視黃醛可能廣泛存在于細(xì)胞中(Kim"a/.,1992andThompsonandGal,2003)。在所有記錄的GFP熒光細(xì)胞(n=34)50中觀察到了光誘發(fā)響應(yīng)，說(shuō)明在視網(wǎng)膜神經(jīng)元中能夠利用細(xì)胞中已存在的發(fā)色團(tuán)基團(tuán)形成功能性ChR2(結(jié)合發(fā)色團(tuán)的Chop2)。與此一致，最近報(bào)道了在未補(bǔ)充外源視網(wǎng)膜發(fā)色團(tuán)基團(tuán)的條件下，在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中表達(dá)了功能性ChR2通道(Boyden"a/.，2005;butseeLi&"/.,2005)。首先在電壓鉗中測(cè)定ChR2介導(dǎo)的光響應(yīng)的性質(zhì)。使用波長(zhǎng)高至580nm的光刺激，觀察表達(dá)Chop2-GFP的視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元中的光誘發(fā)電流，其中敏感度最高的波長(zhǎng)在460nm附近(圖2B)，這與報(bào)道的ChR2光譜敏感峰一致(NagelWfl/.，2003)。電流的振幅和動(dòng)力學(xué)取決于光強(qiáng)度(圖2C)。圖2D和圖2E分別為在放大的時(shí)間尺度中顯示光刺激剛發(fā)生和剛結(jié)束后的電流跡線。于2.2x10"光子cm—2s—i的光強(qiáng)度下，可在大部分記錄細(xì)胞中觀察到可檢測(cè)的電流。在一些細(xì)胞中，于2x1014光子cm一2s—1的光強(qiáng)度下觀察到電流(數(shù)據(jù)未顯示)。在較高的光強(qiáng)度下，所示電流具有瞬時(shí)和持續(xù)分量，這與非融合ChR2的性質(zhì)類似(Nagel"fl/.，2003)。圖2F中顯示了光強(qiáng)度與峰電流間的關(guān)系(n=7)。電流的激活和失活動(dòng)力學(xué)也取決于光強(qiáng)度(圖2D)。如圖2D所示(紅色跡線)，通過(guò)指數(shù)函數(shù)電流的初相位可以很好地與單激活常數(shù)和失活常數(shù)擬合。圖2G和圖2H分別繪制了激活時(shí)間常數(shù)和失活時(shí)間常數(shù)與光強(qiáng)度的曲線關(guān)系。另一方面，熄燈后電流的去激活動(dòng)力學(xué)與光強(qiáng)度無(wú)關(guān)。如圖2E所示(紅色跡線)，通過(guò)單指數(shù)函數(shù)可以很好地?cái)M合電流衰減跡線。時(shí)間常數(shù)是17.1士6.5ms(平均值±SD,n=7)。接下來(lái)的試驗(yàn)檢測(cè)ChR2介導(dǎo)的電流是否足以驅(qū)動(dòng)膜去極化。圖3A顯示非尖峰神經(jīng)元在響應(yīng)波長(zhǎng)為460nm的四個(gè)遞增光強(qiáng)度時(shí)的代表性響應(yīng)。于2.2x10"光子cm—2s—i的光強(qiáng)度下，在大部分記錄細(xì)胞中可觀察到可檢測(cè)的響應(yīng)。在較高光強(qiáng)度下，膜去極化達(dá)到飽和水平。進(jìn)一步檢測(cè)了ChR2介導(dǎo)的對(duì)重復(fù)光刺激的光響應(yīng)。重復(fù)刺激消除了電流的瞬時(shí)分量，而電流的持續(xù)分量保持穩(wěn)定(圖3B中的上部跡線)。這可以通過(guò)比較放大時(shí)間尺度的圖3B右側(cè)中重疊的第一(紅色跡線)和第二(黑色跡線)光誘發(fā)電流清楚地發(fā)現(xiàn)。在電流鉗中，所述剌激可在同一細(xì)胞中誘發(fā)強(qiáng)烈的膜去極化(圖3B中的下部跡線)。除響應(yīng)起始部分外，膜去極化達(dá)到幾乎相同的水平。這也以放大的時(shí)間尺度(右圖)來(lái)顯示，其中將第一(紅色跡線)和第二(黑色跡線)光誘發(fā)響應(yīng)重疊。圖3C顯示尖峰神經(jīng)元對(duì)重復(fù)光刺激的代表性響應(yīng)。所述刺激同樣激發(fā)了幾乎相同的膜去極化并伴隨有多個(gè)尖峰。從整體來(lái)看，這些結(jié)果證明二級(jí)和三級(jí)視網(wǎng)膜神經(jīng)元中ChR2介導(dǎo)的電流足以驅(qū)動(dòng)膜去極化和/或激發(fā)尖峰。實(shí)施例4Chop2在光感器缺陷型rW/h^小鼠中的表達(dá)建立ChR2在野生型視網(wǎng)膜中的表達(dá)和功能后，我們進(jìn)一步研究了光感器退化后表達(dá)ChR2是否能夠恢復(fù)視網(wǎng)膜中的光響應(yīng)。為此目的，試驗(yàn)在純合W(W淑y)小鼠(BowesWa/"1990)中進(jìn)行，純合ni7小鼠是環(huán)GMP磷酸二酯酶中發(fā)生無(wú)義突變的光感器退化模型，類似于一些形式的人色素性視網(wǎng)膜炎退化(McLaughlin"a/.，1993)。將Chop2-GFP病毒載體通過(guò)玻璃體內(nèi)注射到新生(PO小鼠或2-12月齡成年小鼠的眼部。與在野生型動(dòng)物中的觀察結(jié)果類似，在接受Chop2-GFP注射的視網(wǎng)膜中觀察到明亮的GFP信號(hào)，特別是在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中(圖4A和圖4B)。在進(jìn)行記錄試驗(yàn)時(shí)(除非另有說(shuō)明，否則^4月齡)，不存在感光細(xì)胞(圖4C)。如圖4A所示的來(lái)自15月齡W7/W7小鼠的情況，可在高達(dá)16月齡(病毒注射后3-6個(gè)月)的W7/k//小鼠中觀察到Ch叩2-GFP的表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明，此光感器缺失模型中的視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元不僅在光感器死亡后可存活很長(zhǎng)時(shí)間，而且還保持了穩(wěn)定表達(dá)Chop2-GFP的能力。實(shí)施例5rdl/rdl小鼠中表達(dá)ChR2的殘余視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元的光誘發(fā)響應(yīng)通過(guò)視網(wǎng)膜切片的全細(xì)胞膜片鉗記錄來(lái)測(cè)定小鼠中表達(dá)ChR2的視網(wǎng)膜神經(jīng)元的光響應(yīng)性質(zhì)。所述記錄在位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的GFP陽(yáng)性細(xì)胞中進(jìn)行。在GFP陽(yáng)性細(xì)胞中觀察光誘發(fā)電流。所述電流的量值同樣取決于光強(qiáng)度(圖4D和圖4E的上部跡線；另參見(jiàn)圖4F所示的光強(qiáng)度與電流的關(guān)系)。基于其響應(yīng)性質(zhì)觀察兩組表達(dá)ChR2的視網(wǎng)膜神經(jīng)元瞬時(shí)尖峰神經(jīng)元(圖4D)組和持續(xù)尖峰神經(jīng)元(圖4E)組。膜去極化和/或尖峰率也取決于光強(qiáng)度(圖4D和圖4E的下部跡線)。此外，如圖4D和圖4E右側(cè)，通過(guò)在放大的時(shí)間尺度中重疊第二跡線(黑色)和第四跡線(紅色)表明，較高強(qiáng)度的光顯著提高了電壓響應(yīng)的動(dòng)力學(xué)。圖4G、圖4H和圖41分別顯示了光強(qiáng)度與膜去極化、尖峰激發(fā)率以及激發(fā)第一尖峰所需時(shí)間的關(guān)系。這些結(jié)果證明表達(dá)ChR2的殘余三級(jí)視網(wǎng)膜神經(jīng)元能夠通過(guò)膜去極化和/或激發(fā)動(dòng)作電位和響應(yīng)動(dòng)力過(guò)程編譯光強(qiáng)度。實(shí)施例6ChR2介導(dǎo)的視網(wǎng)膜活動(dòng)的多電極陣列記錄在表達(dá)ChR2后，通過(guò)使用整裝視網(wǎng)膜的多電極陣列記錄測(cè)定^/7/W7小鼠光感器缺失的視網(wǎng)膜的尖峰編碼能力。如圖5A中樣品記錄所示，表達(dá)Chop2-GFP的視網(wǎng)膜(n=11個(gè)視網(wǎng)膜)在響應(yīng)燈光出現(xiàn)和熄滅時(shí)可觀察到具有快速動(dòng)力學(xué)的尖峰激發(fā)。光誘發(fā)的尖峰激發(fā)不受應(yīng)用CNQX(25-50^M)和APV(25-50^M)的影響(n=3)，說(shuō)明所述響應(yīng)起源于記錄細(xì)胞的ChR2。在注射了僅攜帶GFP的病毒載體(n=2個(gè)視網(wǎng)膜)的視網(wǎng)膜中或未經(jīng)注射(n=3)的視網(wǎng)膜中沒(méi)有觀察到此類光激發(fā)的尖峰激發(fā)。后者證實(shí)缺失了由光感器引發(fā)的光響應(yīng)。所述光激發(fā)的尖峰激發(fā)不受蘇拉明(100pM)的影響(n二2)，有報(bào)道稱蘇拉明能夠阻斷黑視蛋白受體介導(dǎo)的光電流(Mdyan"a/.,2005andQiu自/"2005)。此外，對(duì)燈光出現(xiàn)和熄滅的響應(yīng)動(dòng)力學(xué)(參見(jiàn)圖5B)均比由內(nèi)源光敏視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生的響應(yīng)動(dòng)力學(xué)快得多(Tu""/.,2005)。這些結(jié)果說(shuō)明在我們進(jìn)行記錄的條件下，內(nèi)源光敏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不大可能對(duì)所觀察到的光響應(yīng)有顯著貢獻(xiàn)。通常可在大部分電極中發(fā)現(xiàn)光誘發(fā)響應(yīng)(參見(jiàn)圖5A)，這與觀察到的Chop2-GFP在視網(wǎng)膜中廣泛表達(dá)相一致。光刺激期間保持了絕大多數(shù)響應(yīng)。圖5B顯示在響應(yīng)三個(gè)遞增光刺激的過(guò)程中由單個(gè)電極記錄的的原始跡線。圖5C顯示由單個(gè)神經(jīng)元記錄中分選的尖峰活性的光柵圖。在記錄期間激發(fā)頻率非常穩(wěn)定。圖5D顯示了平均尖峰率的柱狀圖。激發(fā)頻率也在較高光強(qiáng)度下增大?？稍陂L(zhǎng)至5小時(shí)的時(shí)間內(nèi)記錄到光響應(yīng)。這些結(jié)果進(jìn)一歩證明表達(dá)ChR2的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞確實(shí)能夠利用尖峰激發(fā)率編譯光強(qiáng)度。實(shí)施例7視覺(jué)誘發(fā)電位進(jìn)行試驗(yàn)以測(cè)定W7/W7小鼠視網(wǎng)膜中ChR2介導(dǎo)的光響應(yīng)是否被傳遞到53視皮層中。據(jù)報(bào)道通過(guò)AAV感染實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因(例如GFP)在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的表達(dá)能夠?qū)⑺鲆暰W(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的末端延展至腦部的較高視覺(jué)中樞中(HarveyWa/.,2002)。因此，首先檢測(cè)了表達(dá)Chop2-GFP的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突末端的解剖投影。同樣在多個(gè)腦區(qū)域中觀察到由Chop2-GFP標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突末端，這些區(qū)域包括腹側(cè)外側(cè)膝狀體和背側(cè)外側(cè)膝狀體(圖6A)，以及上丘腦(圖6B)。這些結(jié)果說(shuō)明在退化視網(wǎng)膜中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的中樞投影得到保持。隨后測(cè)定了來(lái)自視皮層的視覺(jué)誘發(fā)電位(VEP)。首先，如圖6C所示，在所有測(cè)試的野生型小鼠(4-6月齡)中觀察響應(yīng)460nm和580nm波長(zhǎng)光刺激的VEP(i^6個(gè)眼睛)。在測(cè)試W〃^7小鼠(6-11月齡)接受Chop^GFP注射的眼睛時(shí)，在大多數(shù)眼睛U3個(gè)眼睛中的9個(gè))中觀察到響應(yīng)460nm波長(zhǎng)光剌激的VEP，而沒(méi)有觀察到響應(yīng)580nm波長(zhǎng)光刺激的VEP(圖6D)，這與ChR2通道的光敏感性一致(參見(jiàn)圖2B)。在接受Chop2-GFP注射的眼睛中，響應(yīng)460nm波長(zhǎng)光刺激的VEP的平均振幅為110士34pV(平均值±SE;n=10)，這小于在野生型小鼠中觀察到的振幅(274士113^V;n=6)，盡管這兩個(gè)數(shù)值并不具有顯著性差異(單向ANOVA檢驗(yàn)；p<0.1)。轉(zhuǎn)染Chop2的小鼠中VEP的振幅低于野生型小鼠并不奇怪，這是因?yàn)榭赡軆H在一小部分視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了ChR2的表達(dá)。在接受Chop2-GFP注射的眼中，VEP峰值的平均響應(yīng)時(shí)間為45士1.7ms(n=10)，這比在野生型小鼠(62±2.8ms;n=6)中觀察到的響應(yīng)時(shí)間短。這兩個(gè)數(shù)值具有顯著性差異(pO.Ol)。后者是可預(yù)知的，因?yàn)樵谝暰W(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中ChR2介導(dǎo)的光響應(yīng)引發(fā)光感器的兩個(gè)下游突觸。作為對(duì)照，在注射了僅攜帶GFP病毒載體的年齡匹配的rW/k/7小鼠(n=5)眼睛中，沒(méi)有觀察到響應(yīng)460nm光刺激的可測(cè)VEP(圖6E)。此外，在未經(jīng)注射的W〃W/小鼠(n=3;5月齡)中，沒(méi)有觀察到響應(yīng)420620nm波長(zhǎng)范圍的可測(cè)VEP(數(shù)據(jù)未顯示)，這證明基于VEP，25月齡的^/k/7小鼠為完全失明。為了進(jìn)一步確認(rèn)失明小鼠中的VEP是由其視網(wǎng)膜中表達(dá)的ChR2產(chǎn)生的，通過(guò)繪制響應(yīng)不同光波長(zhǎng)和光強(qiáng)度的VEP的歸一化強(qiáng)度圖以獲得所述響應(yīng)的相對(duì)強(qiáng)度(圖6F)測(cè)定VEP的作用光譜(n=3)。所得數(shù)據(jù)點(diǎn)與基于vitamin-A,的視覺(jué)色素模板很好地?cái)M合(PartridgeandDeGrip,1991)，其波長(zhǎng)峰為461nm(圖6G)，這與報(bào)道的ChR2在~460nm的峰作用光譜非常匹配(Nagel"a/.,2003)。從整體來(lái)看，這些結(jié)果證明在光感器缺失的視網(wǎng)膜中表達(dá)ChR2能夠恢復(fù)腦中的視覺(jué)誘發(fā)響應(yīng)。實(shí)施例8關(guān)于實(shí)施例1-7的討論本文所示結(jié)果證明，利用ChR2的表達(dá)在光感器缺失的嚙齒動(dòng)物視網(wǎng)膜中恢復(fù)光響應(yīng)的策略在機(jī)械上和技術(shù)上都是可行的。最重要的是，所述結(jié)果顯示ChR2滿足用作視網(wǎng)膜神經(jīng)元中光感受器所需的多個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)。首先，通過(guò)遞送攜帶融合Chop2-GFP的AAV載體，本發(fā)明人證明了視網(wǎng)膜神經(jīng)元容許長(zhǎng)期表達(dá)ChR2的能力。迄今為止，在病毒注射后，Chop2-GFP蛋白在非營(yíng)養(yǎng)不良大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元中的表達(dá)已經(jīng)達(dá)到12個(gè)月，在光感器缺失的r^/W7小鼠體內(nèi)的表達(dá)達(dá)到6個(gè)月。因此，本發(fā)明的結(jié)果說(shuō)明ChR2在視網(wǎng)膜神經(jīng)元中的表達(dá)與正常的光周期條件具有生物相容性。第二，這些結(jié)果顯示，僅利用日常飲食補(bǔ)充的內(nèi)源發(fā)色團(tuán)基團(tuán)也能夠在視網(wǎng)膜神經(jīng)元中形成足夠數(shù)量的ChR2，從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的膜去極化和/或在視網(wǎng)膜中激發(fā)動(dòng)作電位并在視皮層中激發(fā)VEPs。這里需要強(qiáng)調(diào)的是，動(dòng)物視色素在發(fā)色團(tuán)發(fā)生由11-順式到全反式視黃醛的光致異構(gòu)化后迅速失去其發(fā)色團(tuán)(Wald,1968)，而微生物型視紫紅質(zhì)與此不同，其全反式到11-順式視黃醛的光致異構(gòu)化是可逆的，并且這兩種異構(gòu)體均可保持與蛋白質(zhì)的結(jié)合(Oesterhelt,1998)。一旦形成ChR2復(fù)合物，光敏通道可使用相同的發(fā)色團(tuán)部分維持多個(gè)光致異構(gòu)化循環(huán)。盡管認(rèn)為重新形成ChR2的效力可能依賴于發(fā)色團(tuán)基團(tuán)的可利用性，但是需要持續(xù)重復(fù)補(bǔ)充發(fā)色團(tuán)以形成新ChR2似乎并不限制整體的ChR2功能。如在多電極陣列記錄中觀察到的，ChR2可在體外若干個(gè)小時(shí)重復(fù)對(duì)光刺激做出響應(yīng)而沒(méi)有喪失活性。因此，這些結(jié)果說(shuō)明ChR2的周轉(zhuǎn)率非常低，這是利用ChR2作為人工產(chǎn)生的光感受器的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。此外，如最初在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的報(bào)道(Nagel"a/.,2003)，隨后在海馬神經(jīng)元中的報(bào)道(Boyden"a/"2005,Ishizuka&a/"2006andLiea/.,2005)，以及目前在視網(wǎng)膜神經(jīng)元中的顯示，ChR2通道的多個(gè)性質(zhì)非常有利于其作為光感受器的應(yīng)用。首先，ChR2通道對(duì)陽(yáng)離子的通透性是神經(jīng)元膜應(yīng)激性的基礎(chǔ)。因此，ChR2通道的光激活能夠直接產(chǎn)生膜去極化以模仿視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元的ON響應(yīng)。事實(shí)上，如本文所述，非尖峰和尖峰視網(wǎng)膜神經(jīng)元中ChR2介導(dǎo)的光誘發(fā)響應(yīng)非常類似于ON雙極細(xì)胞和持續(xù)ON神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的光響應(yīng)(WerblinandDowling,1969andKaneko,1970)。其次，響應(yīng)光的電流激活動(dòng)力學(xué)非常之快，盡管電流的持續(xù)分量沒(méi)有顯示出對(duì)連續(xù)或重復(fù)光照的明顯失活。因此，表達(dá)ChR2的神經(jīng)元可以快速動(dòng)力學(xué)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而不發(fā)生色素失活。現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)ChR2的表達(dá)同樣能夠以高時(shí)間分辨力進(jìn)行神經(jīng)元應(yīng)激性的光學(xué)控制(Boyden"2005，Ishizuka"a/.，2006andLida/.,2005)。此外，本文顯示光誘發(fā)電流的量值和激活動(dòng)力學(xué)依賴于3個(gè)對(duì)數(shù)單位的光照范圍。如在全細(xì)胞和多電極陣列記錄中的論證，這將允許使用分級(jí)膜去極化和/或尖峰率編譯多種光強(qiáng)度。本試驗(yàn)的結(jié)果顯示老年W7/W7小鼠(達(dá)16月齡)中存活有很多視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元，并且能夠在所有光感器死亡后長(zhǎng)期表達(dá)ChR2，這對(duì)于光感器退化后恢復(fù)視網(wǎng)膜光敏感性策略的可行性也非常重要。這也與此類小鼠模型的組織學(xué)試驗(yàn)一致，所述組織學(xué)試驗(yàn)中顯示，有很多視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元盡管有一些重塑但仍然存活了下來(lái)(Jimenez&1996，StrettoiandPignatelli,2000andChangaa/.,2002)。此外，使用ChR2的本發(fā)明研究顯示，所述殘余視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元保留了其利用膜去極化和/或激發(fā)動(dòng)作電位以編譯光信號(hào)并將視覺(jué)信號(hào)傳遞至視皮層的生理能力。因此，基于ChR2表達(dá)的策略至少適合于特定階段的特定視網(wǎng)膜退化疾病。光感器退化引發(fā)的視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元重塑引起了人們對(duì)光感器死亡后基于視網(wǎng)膜的補(bǔ)救策略的關(guān)注(StrettoiandPignatelli,2000,Jones^a/.，2003andJonesandMarc,2005)。然而，就退化的時(shí)間過(guò)程、不同類型細(xì)胞的存活和功能狀態(tài)而言，視網(wǎng)膜退化疾病各不相同(Chang"a/.，2002)。使用ChR2是進(jìn)行此類研究的有利工具。人們認(rèn)為視網(wǎng)膜重塑是由傳入神經(jīng)阻滯造成的(JonesandMarc,2005)。因此，恢復(fù)視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元的光敏感性可能能夠預(yù)防或延遲重塑過(guò)程。最后，根據(jù)本發(fā)明，基于病毒的基因遞送系統(tǒng)，例如如本文所述的AAV載體(Flannerya/"1997,Bennett^a/"1999,Alida/"2000禾口AclandWa/.,2001)是將Chop2引入視網(wǎng)膜神經(jīng)元的工具。本發(fā)明的結(jié)果顯示，具有AAV2型血清型和CAG啟動(dòng)子的病毒構(gòu)建物在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了Chop2的長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)。然而，因?yàn)槭褂么藰?gòu)建物表達(dá)Chop2似乎同時(shí)靶向于ON型和OFF型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，所以仍需要測(cè)定ON型和OFF型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均轉(zhuǎn)化成ON型細(xì)胞對(duì)視知覺(jué)的影響。在靈長(zhǎng)類中進(jìn)行的行為研究中發(fā)現(xiàn)根據(jù)光衰減和形狀感覺(jué)測(cè)定，對(duì)視網(wǎng)膜中的ON通道進(jìn)行藥理阻斷沒(méi)有嚴(yán)重破環(huán)此類視覺(jué)功能(SchillerWa/.,1986)。因此，預(yù)期將ChR2靶向于ON通道，例如ON型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可獲得可用的視覺(jué)。本文還關(guān)注于在較遠(yuǎn)端視網(wǎng)膜神經(jīng)元(例如雙極細(xì)胞)中表達(dá)ChR2，此方法可利用退化視網(wǎng)膜殘余的信號(hào)加工功能。將ChR2靶向桿狀雙極細(xì)胞特別弓I人注意，因?yàn)闂U狀雙極細(xì)胞去極化能夠引起錐狀雙極細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞水平上的ON和OFF響應(yīng)(Wassle，2004)，從而維持視網(wǎng)膜中固有的ON和OFF通道。在表達(dá)ChR2的視網(wǎng)膜中產(chǎn)生響應(yīng)所需的光強(qiáng)度閾值似乎為約IO"-IO15光子cm—2s—、比較而言，正常桿狀和錐狀光感器的閾值分別為約1(f光子cm一2s—1(T光子cm—2s—1(Dacey"a/.,2005)。因此，可在相對(duì)較高的光子范圍內(nèi)使表達(dá)ChR2的視網(wǎng)膜起作用。表達(dá)ChR2的視網(wǎng)膜的光敏感性低于正常視網(wǎng)膜可能是多個(gè)因素的結(jié)果。首先，與桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞中的視覺(jué)色素相比，轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜神經(jīng)元中ChR2分子的橫截面密度較低。其次，表達(dá)ChR2的視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元缺乏桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞外段通常具有的獨(dú)特的多層光感器膜組織，而形成所述組織可獲得較高的色素密度，并以此增加捕獲光子的可能性(Steinberg,""/.,1980)。第三，與通過(guò)放大級(jí)聯(lián)傳播其信號(hào)的視覺(jué)色素(Stryer，1991)不同，直接光門控ChR2通道缺少此類放大能力。最后，在正常視網(wǎng)膜中，在信號(hào)由多個(gè)光感器匯聚到神經(jīng)節(jié)細(xì)胞時(shí)發(fā)生視覺(jué)信號(hào)的放大(Barlow"a/.,1971)。這一過(guò)程尚不能在轉(zhuǎn)化ChR2的視網(wǎng)膜中實(shí)現(xiàn)。尚沒(méi)有證據(jù)表明在以上因素中，主要由哪一個(gè)造成表達(dá)ChR2的視網(wǎng)膜中殘留光敏感性的下降。有趣的是，ChR2介導(dǎo)了綠藻對(duì)低強(qiáng)度光的趨光性(Sineshchekovefa/.,2002;butseeKateriya"a/.[2004])。因lt匕，5見(jiàn)已通過(guò)弓l入異源表達(dá)Chop2分子的修飾方法改變視網(wǎng)膜神經(jīng)元中ChR2的光敏感性。這一區(qū)別也可反映出藻類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能組織上的不同。此外，在臨床應(yīng)用時(shí)，可使用光增強(qiáng)設(shè)備方法光操作范圍。目前，尚沒(méi)有能夠在喪失感光細(xì)胞后恢復(fù)視力的治療方法。如上文所述，現(xiàn)已提出移植正常感光細(xì)胞或祖細(xì)胞(Bok，1993andLund"a/.,2001)或通過(guò)視網(wǎng)膜植入物對(duì)殘余二級(jí)和三級(jí)視網(wǎng)膜神經(jīng)元進(jìn)行直接電剌激(Zrenner,2002)可作為桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞退化后恢復(fù)視網(wǎng)膜中光響應(yīng)的可能策略。本發(fā)明的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)在于不包括向視網(wǎng)膜中引入組織或設(shè)備，并因此在很大程度上避免了免疫反應(yīng)并發(fā)癥和生物不相容性。此外，因?yàn)榇朔椒ò邢蛴诩?xì)胞水平，所以預(yù)期本方法可使恢復(fù)的"視覺(jué)"具有高空間分辨力。因此，在殘余視網(wǎng)膜神經(jīng)元中表達(dá)例如ChR2的微生物型通道視紫紅素是治療由桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞退化導(dǎo)致的完全失明的一種策略。實(shí)嚴(yán),微游參考擅Acland"2001—G.M.Acland,G.D.Aguirre,J.Ray,Q.Zhang,T.S.Aleman,A.V.Cidedyan,S.E.Pearce隱Kelling,V.Anand,Y.ZengandA.M.Maguirea/"Genetherapyrestoresvisioninacaninemodelofchildhoodblindness,艦Ge威(2001),pp.92-95Alida/.,2000—R.R.Ali，G.M.Sarra，C.Stephens,M.D.Alwis,J.W.Bainbridge,P.M.Munro,S.Fauser，M.B.Reichel,C.KinnonandD.M.Hunta/.，Restorationofphotoreceptorultrastructureandfunctioninretinaldegenerationslowmicebygenetherapy,Gewe/.25(2000)，pp.306-310AuricchioW2001—A.Auricchio,G.Kobinger,V.Anand,M.Hildinger，E.O'Connor,A.M.Maguire,J.M.WilsonandJ.Bennett,Exchangeofsurfaceproteinsimpactsonviralvectorcellularspecificityandtransductioncharacteristics:theretinaasamodel,//ww.Mo/.Gewef.(2001),pp,3075-3081Bangharta/.，2004--M.Banghart,K.Borges,E.Isacoff,D.TraunerandR.H.Kramer,Light-activatedionchannelsforremotecontrolofneuronalfiring,艦?zāi)榳賜"'.7(2004)，pp.1381-1386Barlowda/.，1971—H.B.Barlow,W.R.LevickandM.Yoon,Responsestosinglequantaoflightinretinalganglioncellsofthecat,F^/owAes.3(1971),pp.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula>expressioninthebrain,Mef/wA(2002),pp.227-236Flanneryda/.,1997—J.G.Flannery,S.Zolotukhin,M.I.Vaquero,M.M.LaVail，N.MuzyczkaandW.W.Hauswirth,Efficientphotoreceptor-targetedgeneexpressioninvivobyrecombinantadeno-associatedvirus,/Voc.iVaf/.Jcacf.Sc/.WS^何(1997),pp.6916-6921FIotte，2004—T.R.Flotte，Genetherapyprogressandprospects:recombinantadeno-associatedvirus(rAAV)vectors,Gewe77(2004),pp.805-810Harveyda/"2002-畫A.R.Harvey,W.Kamphuis,R.Eggers,N.A.Symons,B.Blits,S.Niclou,G.J.BoerandJ.Verhaagen,Intravitrealinjectionofadeno-associatedviralvectorsresultsinthetransductionofdifferenttypesofretinalneuronsinneonatalandadultrats:acomparisonwithlentiviralvectors,Mo/.Ce〃.臉w麗c/."(2002)，pp.141-157Humphriesda/.,1992—P.Humphries,P.KennaandG.J.Farrar,Onthemoleculargeneticsofretinitispigmentosa,5Wewce256(1992)，pp.804-808Ishizukaa/"2006—T.Ishizuka,M.Kakuda，R.ArakiandH.Yawo，Kineticevaluationofphotosensitivityingeneticallyengineeredneuronsexpressinggreenalgaelight-gatedchannels,TVewrosc/.54(2006),pp.85-94Jimenezda/.,1996--A.J.Jimenez,J.M.Garcia-Fernandez,B.GonzalezandR.G.Foster,Thespatio-temporalpatternofphotoreceptordegenerationintheagedrd/rdmouseretina,Ce〃7!sraei饑(1996),pp.193-202JonesandMarc,2005—B.W.JonesandR.E.Marc,Retinalremodelingduringretinaldegeneration,五yeW(2005),pp.123—137JonesWa/.,2003隱隱B.W.Jones,C.B.Watt,J.M.Frederick,W.Baehr,C.K.Chen,E.M.Levine,A.H.Milam,M.M.LavailandR.E.Marc,Retinalremodelingtriggeredbyphotoreceptordegenerations,/Comp.A^wro/.464(2003),pp.1-16Kaneko,1970—A.Kaneko,Physiologicalandmorphologicalidentificationofhorizontal,bipolar,andamacrinecellsinthegoldfishretina,J尸—Zo/.207(1970),pp.623-633Kateriyaa/.，2004誦-S.Kateriya,G.Nagel,E.BambergandP.Hegemann，"Vision"insingle-celledalgae,iVevra/V^s/o/.79(2004),pp.133—137Kima/.，1992—C.I.Kim,M.A.LeoandC.S.Lieber,Retinolformsretinoicacidviaretinal,Jrc/.i/0c/2ew.(1992)，pp.388-393Li&a/.，2005—X.Li,D.V.Gutierrez,M.G.Hanson,J.Han,M.D.Mark,H.Chiel，P.Hegemann,L.T.LandmesserandS.Herlitze,Fastnoninvasiveactivationandinhibitionofneuralandnetworkactivitybyvertebraterhodopsinandgreenalgaechannelrhodopsin,戶rac.淑/.Jcad5W.腦濯(2005),pp.17816-17821Lundda/.,2001—R.D.Lund,A.S.Kwan，D.J.Keegan,Y.Sauve,P.J.CoffeyandJ.M.Lawrence,Celltransplantationasatreatmentforretinaldisease,/Vog.五yei饑20(2001),pp.415-449MartinW"/.,2003—K.R.Martin,H.A.Quigley，D丄Zack,H.Levkovitch畫Verbin,J.Kielczewski,D.Valenta,L.Baumrind,M.E.Pease,R丄.KleinandW.W.Hauswirth,Genetherapywithbrain-derivedneurotrophicfactorasaprotection:retinalganglioncellsinaratglaucomamodel，/wvesf.0//2f/7a/m0/.巧i"(2003),pp.4357-4365McLaughlina/.,1993—M.E.McLaughlin,M.A.Sandberg,E.L.BersonandT.RDryja，Recessivemutationsinthegeneencodingthebeta-subunitofrodphosphodiesteraseinpatientswithretinitispigmentosa,7V<af.Gewe/.4(1993),pp.130-134Melyan0/.，2005畫-Z.Melyan,E.E.Tarttelin,J.Bellingham,R.J.LucasandM.W.Hankins,Additionofhumanmelanopsinrendersmammaliancellsphotoresponsive，iVafwre(2005),pp.741-745Milam&1998畫陽(yáng)A.H.Milam,Z.Y.LiandR.N.Fariss,Histopathologyofthehumanretinainretinitispigmentosa,/Vog.77(1998)，pp.175-205Nagelda/"2002畫-G.Nagel,D.Ollig,M.Fuhrmann,S.Kateriya,A.M.Musti,E.BambergandP.Hegemann,Channelrhodopsin-1:alight-gatedprotonchannelingreenalgae,5We"ce296(2002)，pp.2395-2398Nagel"a/.,2003—G.Nagel，T,Szellas,W.Huhn,S.Kateriya,N.Adeishvili，P.Berthold，D.Ollig，P.HegemannandE.Bamberg,Channelrhodopsin-2，adirectlylight-gatedcation-selectivemembranechannel,尸rac.Ato/.Jcad5W.MO(2003),pp.13940-13945Oesterhelt,1998—D.Oesterhelt,Thestructureandmechanismofthefamilyofretin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權(quán)利要求2所述的方法，其中所述啟動(dòng)子是雜合的CAG。7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述組成型啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。8.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和/或細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子選自于由mGluR6啟動(dòng)子、Pcp2(L7)啟動(dòng)子或神經(jīng)激肽3(NK-3)啟動(dòng)子組成的組。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述啟動(dòng)子是mGlu6啟動(dòng)子，并且是啟動(dòng)子序列SEQIDNO:7的一部分。11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述載體包含雜合的CMV增強(qiáng)子/雞P-肌動(dòng)蛋白(CAG)啟動(dòng)子、土撥鼠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)和人或牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷序列。12.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述載體包含CAG啟動(dòng)子、土撥鼠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)和人或牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷化序列。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述視網(wǎng)膜神經(jīng)元選自于ON型和OFF型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、視網(wǎng)膜桿狀雙極細(xì)胞、All無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞以及ON和OFF視網(wǎng)膜錐狀雙極細(xì)胞。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述載體靶向于ON型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和/或ON型雙極細(xì)胞并在ON型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和/或ON型雙極細(xì)胞中表達(dá)。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述載體包含mGluR6啟動(dòng)子。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述mGluR6啟動(dòng)子是啟動(dòng)子序列SEQIDNO:7的一部分。17.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述啟動(dòng)子是NK-3啟動(dòng)子，并且所述載體靶向OFF錐狀雙極細(xì)胞。18.恢復(fù)視覺(jué)喪失或失明受試者視網(wǎng)膜神經(jīng)元的光敏感性的方法，其中所述受試者的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞正在發(fā)生退化或已經(jīng)發(fā)生退化和死亡，所述方法包括(a)向所述受試者的視網(wǎng)膜遞送核酸載體，所述載體編碼在所述神經(jīng)元中表達(dá)的光門控通道視紫紅質(zhì)或光驅(qū)動(dòng)離子泵視紫紅質(zhì)，其中所述載體包含編碼視紫紅質(zhì)的開放閱讀框、與所述開放閱讀框可操作連接的啟動(dòng)子序列和任選的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；和(b)在所述神經(jīng)元中表達(dá)所述載體，其中所述視紫紅質(zhì)的表達(dá)賦予所述神經(jīng)元光敏感性，從而恢復(fù)所述視網(wǎng)膜的光敏感性。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述視紫紅質(zhì)是Ch叩2或其生物活性片段或其保守性氨基酸替代變體。20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述載體是rAAV病毒載體。21.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述組成型啟動(dòng)子是雜合的CAG啟動(dòng)子。23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述啟動(dòng)子雜合的CAG啟動(dòng)子。24.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述組成型啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。25.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型和/或細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子選自于由mGluR6啟動(dòng)子、Pcp2(L7)啟動(dòng)子或神經(jīng)激肽3(NK-3)啟動(dòng)子組成的組。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述啟動(dòng)子是mGlu6啟動(dòng)子，并且是啟動(dòng)子序列SEQIDNO:7的一部分。28.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述視網(wǎng)膜神經(jīng)元是ON型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、OFF型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、視網(wǎng)膜桿狀雙極細(xì)胞、AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、ON型視網(wǎng)膜錐狀雙極細(xì)胞和OFF型視網(wǎng)膜錐狀雙極細(xì)胞。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述載體靶向于ON型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和/或ON型雙極細(xì)胞并在ON型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和/或ON型雙極細(xì)胞中表達(dá)。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述載體包含mGluR6啟動(dòng)子。31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述mGluR6啟動(dòng)子是啟動(dòng)子序列SEQIDNO:7的一部分。32.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述啟動(dòng)子是NK-3啟動(dòng)子，并且所述載體靶向OFF錐狀雙極細(xì)胞。33.如權(quán)利要求18-32中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述光敏感性的恢復(fù)導(dǎo)致所述受試者視覺(jué)的恢復(fù)。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中通過(guò)以下方法中的一個(gè)或多個(gè)測(cè)定所述視覺(jué)(i)暴露于光剌激后受試者的光察覺(jué)響應(yīng)；(ii)暴露于光刺激后受試者的光投影響應(yīng)；(iii)受明暗相間圖案的視覺(jué)刺激的受試者的光分辨力；(iv)視皮層對(duì)閃光刺激或圖案視覺(jué)剌激響應(yīng)的電記錄。35.如權(quán)利要求18-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述視覺(jué)喪失或失明是退化性疾病的結(jié)果。36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述疾病是色素性視網(wǎng)膜炎或老年性黃斑退化。37.如權(quán)利要求18-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中在遞送所述載體之前、同時(shí)或之后還向所述受試者提供視覺(jué)假體。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述視覺(jué)假體是視網(wǎng)膜植入物、皮層植入物、外側(cè)膝狀體植入物或視神經(jīng)植入物。39.如權(quán)利要求18-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用一種或多種視覺(jué)刺激訓(xùn)練受試者的視覺(jué)響應(yīng)。40.如權(quán)利要求38所述的方法，其中使用一種或多種視覺(jué)刺激訓(xùn)練受試者的視覺(jué)響應(yīng)。41.如權(quán)利要求39或40所述的方法，其中通過(guò)以下方法中的一種或多種完成所述訓(xùn)練(a)適應(yīng)性訓(xùn)練，其特征是訓(xùn)練受試者識(shí)別(0不同水平的光和/圖案刺激，和/或(ii)來(lái)自普通光源或物體的環(huán)境刺激；和(b)方向性和運(yùn)動(dòng)性訓(xùn)練，其特征是訓(xùn)練受試者通過(guò)視覺(jué)發(fā)現(xiàn)局部物體，并且與未接受訓(xùn)練相比可更有效地在所述物體間移動(dòng)。全文摘要編碼光門控陽(yáng)離子選擇性膜通道，特別是編碼通道視紫紅質(zhì)-2(Chop2)的核酸載體在動(dòng)物模型中將光感器退化的視網(wǎng)膜中的視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元轉(zhuǎn)化成光敏細(xì)胞。此類治療可恢復(fù)視知覺(jué)和各方面的視覺(jué)。本發(fā)明提供了恢復(fù)受試者視網(wǎng)膜光敏感性的方法，其中該受試者由于光感器退化(如色素性視網(wǎng)膜炎或黃斑退化中的光感器退化)而喪失視覺(jué)。所述方法包括通過(guò)玻璃體內(nèi)或視網(wǎng)膜下注射向所述受試者遞送上述核酸表達(dá)載體，其中所述載體包含編碼視紫紅質(zhì)的開放閱讀框，并且所述開放閱讀框可操作地與啟動(dòng)子序列和轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列連接，從而在視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元中表達(dá)所述核酸。由此，這些通常為光失敏性的細(xì)胞被轉(zhuǎn)化成光敏狀態(tài)，并將視覺(jué)信息傳遞到腦部，以補(bǔ)償視覺(jué)喪失并引起多種視覺(jué)能力的恢復(fù)。文檔編號(hào)A01N43/04GK101484005SQ200780025218公開日2009年7月15日申請(qǐng)日期2007年5月4日優(yōu)先權(quán)日2006年5月4日發(fā)明者亞歷山大·M·季澤爾,潘卓華申請(qǐng)人:韋恩州立大學(xué);賓夕法尼亞驗(yàn)光配鏡學(xué)院