專利名稱：：毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4-cl及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4-CL序列，同時本發(fā)明還涉及這種木質(zhì)素單體合成基因4-CL在甘藍(lán)型油菜中的用途。
背景技術(shù)：
：木質(zhì)素作為植物體內(nèi)一類復(fù)雜的苯丙垸類聚合物，是植物機(jī)械組織和細(xì)胞壁的主要成分之一，在植物生長發(fā)育和抗逆性方面具有重要的作用。在細(xì)胞壁木質(zhì)化過程中，木質(zhì)素滲入到細(xì)胞壁中，填充于細(xì)胞壁架構(gòu)內(nèi)，增強(qiáng)了細(xì)胞壁的硬度，強(qiáng)化了細(xì)胞的機(jī)械支持力和抗壓強(qiáng)度。在與病原菌相互作用中，寄主細(xì)胞壁木質(zhì)化是抗病反應(yīng)的特征之一，木質(zhì)素作為植物體內(nèi)一種重要的物理抗菌物質(zhì)，能夠沉積于細(xì)胞壁中富含羥脯氨酸的糖蛋白(服GP)上，作為結(jié)構(gòu)屏障，加固細(xì)胞壁,保護(hù)細(xì)胞免受病原菌的侵染。近年來，突變體及通過轉(zhuǎn)基因植物對木質(zhì)素生物合成調(diào)控的研究主要表現(xiàn)在3個層次一是苯丙氨酸途徑上的調(diào)控，涉及3種酶PAL(phenylalanineammonia陽lyase)、C4H(cinnamate4-hydroxylase)禾口4-CL(4陽coumarate:CoAligase)，它們的表達(dá)決定木質(zhì)素總量；二是木質(zhì)素特異合成途徑上的調(diào)控，主要集中于3種酶，艮卩C0MT(caffeicacidO-methyltransferase)、CCoA0MT(caffeoyl-CoAO-methyltransferase)和F5H(ferulate5-hydroxylase)，這些酶類的表達(dá)對木質(zhì)素含量尤其木質(zhì)素單體的特異合成影響較大，決定了各種單體在木質(zhì)素總量中的比例；三是對木質(zhì)素特異合成途徑下游酶類的調(diào)控，包括兩種還原酶CAD(cinnamylalcoholdehydrogenase)和CCR(cinnamoyl-CoAreductase)，它們負(fù)責(zé)將各禾中輕基肉桂酰-輔酶A(CoA)酯最終還原成各種木質(zhì)素單體。苯丙氨酸途徑是植物三大次生代謝途徑之一。植物的許多重要次生代謝產(chǎn)物均由該途徑而來。如木質(zhì)素、類黃酮、花青素、植保素、酚類物質(zhì)、信號分子等。該途徑由PAL、C4H、4-CL三個酶組成，其中4-CL負(fù)責(zé)催化肉桂酸及其衍生物生成相應(yīng)的輔酶A酯，活化后的底物再進(jìn)入各種不同的代謝途徑，參與各種下游次生產(chǎn)物的合成。由于4-CL在苯丙氨酸途徑中處于代謝分支點(diǎn)的位置，是木質(zhì)素單體合成途徑中的關(guān)鍵酶，因此被認(rèn)為是調(diào)控木質(zhì)素合成的理想耙基因。目前有關(guān)4-CL調(diào)控的研究大多是通過反義RNA技術(shù)降低植物內(nèi)源4-CL活性水平，從而達(dá)到降低木質(zhì)素含量，提高林木的造紙品質(zhì)和牧草的飼用價值，而利用4-CL的過量表達(dá)以提高植物木質(zhì)素含量、增強(qiáng)植物抵抗逆境能力方面的研究則未見報(bào)導(dǎo)。雖然目前從各種植物中分離到的編碼4-CL蛋白的基因或cDNA很多，但在本發(fā)明申請之前，國內(nèi)沒有人公開或發(fā)表過毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4-CL基因序列及其在甘藍(lán)型油菜中的用途。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4-CL。該基因是調(diào)控木質(zhì)素總量合成的關(guān)鍵基因，負(fù)責(zé)催化各種肉桂酸及其衍生物生成相應(yīng)的輔酶A酉旨，參與各種下游次生產(chǎn)物的合成，進(jìn)而提高木質(zhì)素總量，增強(qiáng)植物抵抗病原物的侵染。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4-CL在油菜抗菌核病中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4-CL在油菜抗倒伏中的應(yīng)用為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4-CL的獲得1)在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索已發(fā)表的楊樹4-CL基因序列，用01igo6.0軟件(通過商業(yè)途徑市場購買獲得，下同)設(shè)計(jì)基因編碼序列的兩側(cè)引物(正向引物[5'-ATGAATCCACMGAAGMTTCATC-3，];反向弓l物[5，-TTATATGCCTGCCAACTTTTCTTTCAG-3，])。2)以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行測序，獲得4-CL基因序列，一種DNA分子，其堿基序列如SEQIDN0:1所示。通過上述方法獲得了毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4-CL，采用一種提高4-CL基因表達(dá)活性的轉(zhuǎn)基因油菜，其特征在于轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)為木質(zhì)素含量增加，比受體對照(非轉(zhuǎn)基因植株)木質(zhì)素含量增加10%以上，抗菌核病和抗倒伏能力提高，轉(zhuǎn)基因植株比受體對照(非轉(zhuǎn)基因植株)病斑擴(kuò)展面積變小30%左右，莖桿強(qiáng)度則比對照(非轉(zhuǎn)基因植株)增強(qiáng)在20%左右。在本發(fā)明中為了達(dá)到上述目的采用以下技術(shù)方法，提供了一種質(zhì)粒表達(dá)載體pBI121(從商業(yè)途徑獲得，下同)，它含有特異表達(dá)啟動子(木質(zhì)部特異表達(dá)的C4H啟動子)和翻譯控制件。在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種可在植物中表達(dá)的宿主菌，本發(fā)明優(yōu)選的是農(nóng)桿菌，更優(yōu)選的是根癌農(nóng)桿菌LBA4404(從商業(yè)途徑獲得，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所購置，下同)。本發(fā)明也提供了一種將所述載體導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法，如基因槍注射法，細(xì)菌導(dǎo)入法。本發(fā)明優(yōu)選農(nóng)桿菌導(dǎo)入法，如農(nóng)桿菌LBA4404油菜子葉柄導(dǎo)入法。本發(fā)明提供了一種能夠過量表達(dá)毛白楊4一CL基因的轉(zhuǎn)基因油菜的方法，其特征在于油菜木質(zhì)素含量增加，抗菌核病和抗倒伏能力增強(qiáng)。該方法包括下列步驟1)將克隆得到的毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4一CL連接到質(zhì)粒pBI121上，利用木質(zhì)部特異表達(dá)的C4H啟動子形成可轉(zhuǎn)化或表達(dá)的載體(pBI121-C4H:4CL);2)將步驟1)中制備的載體(pBI121-C4H:4CL)轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，再導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜植株中；3)篩選陽性植株。在本發(fā)明中，①以中國特有樹種毛白楊，根據(jù)已發(fā)表的楊樹4一CL基因的保守序列，在基因編碼序列的兩側(cè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到了基因序列如SEQIDN0:1所示。用HindlII/BamHI分別雙酶切C4H啟動子PCR產(chǎn)物和PBI121質(zhì)粒，將PCR酶切片段和PBI121質(zhì)粒酶切大片段連接后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5ct(從商業(yè)途徑獲得)中擴(kuò)增，然后再將4-CL基因引入到載體PBI121中，并取代PBI121中原有的GUS序列，而載體中的35S啟動子序列則被C4H啟動子序列所取代，構(gòu)建植物表達(dá)載體重新命名為pBI-C4H:4,tCL。②袼含有4-CL基因的載體轉(zhuǎn)染根癌農(nóng)桿菌LBA4404，培養(yǎng)農(nóng)桿菌于YEP液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，氯化鈉5g)，并將無菌苗在農(nóng)桿菌菌液中浸泡。③在加卡那(Kan)的選擇培養(yǎng)基篩選陽性克隆。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，植株無菌苗選自油菜，通過選擇培養(yǎng)基最后篩選到油菜木質(zhì)素單體合成基因4-CL表達(dá)的植株，植株表現(xiàn)出木質(zhì)素含量增加10%以上，抗倒伏能力和抗菌核病分別提高20%和30%左右。本發(fā)明中所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)基因植物"是指含有導(dǎo)入的基因并能夠穩(wěn)定地增強(qiáng)或抑制所導(dǎo)入的基因表達(dá)并產(chǎn)生具有特定的生物學(xué)性狀的植物。本發(fā)明中的"植物細(xì)胞"是指植物的各種未成熟胚，愈傷組織或懸浮細(xì)胞(成熟種子胚、未成熟胚、幼穗、花藥、胚芽鞘或幼葉)，或原生質(zhì)體(葉肉細(xì)胞)。這些植物細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下均能再生成植物?？寺”景l(fā)明中所述的毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4-CL的方法是本領(lǐng)域中所常采用的方法。提取raRNA的方法也有多種成熟的技術(shù)(如采用TRIzolReagent,Invetrogen),提取mRNA試劑盒如可從商業(yè)途徑獲得，而構(gòu)建cDNA文庫也是常用的分子生物學(xué)技術(shù)。構(gòu)建本發(fā)明中所述的載體和將載體轉(zhuǎn)染入植株也是本領(lǐng)域中所常采用的方法。其中所涉及的質(zhì)粒(如質(zhì)粒表達(dá)載體pBI121)，轉(zhuǎn)染用媒體(如根癌農(nóng)桿菌LBA44040和所用試劑)可從商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明是國內(nèi)首次公開毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4一CL序列，木質(zhì)素單體合成基因4一CL在苯丙氨酸途徑中處于代謝分支點(diǎn)的位置，是木質(zhì)素單體合成途徑中的關(guān)鍵酶，是調(diào)控木質(zhì)素合成的理想靶基因。本發(fā)明首次利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控油菜木質(zhì)素總量的合成，增加木質(zhì)素的含量。4-CL負(fù)責(zé)催化各種肉桂酸及其衍生物生成相應(yīng)的輔酶A酯，參與各種下游次生產(chǎn)物的合成，提高木質(zhì)素總量。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因油菜木質(zhì)素含量與受體對照(非轉(zhuǎn)基因植株)相比，木質(zhì)素含量均有所增高，增幅最大株系為13.41%(見表l)，轉(zhuǎn)基因植株比受體對照(非轉(zhuǎn)基因植株)病斑擴(kuò)展面積均有所變小，變小幅度最高為30%左右(見圖5)，莖桿強(qiáng)度則比對照(非轉(zhuǎn)基因植株)普遍增強(qiáng)20%左右(見圖6)，大大地提高了油菜的抗菌核病和抗倒伏的能力。此方法也為作物抗病、抗倒伏研究及育種開辟了一條新的思路。圖1RT-PCR擴(kuò)增的4一CLcDNA目標(biāo)片段示意圖圖2植物表達(dá)載體示意圖Kan為卡那抗性，C4H為啟動子，4-CL基因?yàn)榭寺』虿逶贑4H啟動子之后。圖3A為轉(zhuǎn)基因植株生根苗；B為轉(zhuǎn)基因植株移入土缽中。圖4C4H啟動子的轉(zhuǎn)4-CL基因油菜的PCR結(jié)果5-27樣為轉(zhuǎn)基因植株，-為對照野生植株，+為陽性對照。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株成功導(dǎo)入了4-CL基因。圖5轉(zhuǎn)基因植株與對照植株接種菌核后的比較。圖6轉(zhuǎn)基因植株與對照植株莖桿強(qiáng)度的比較。具體實(shí)施例方式通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)，或Dr即er，J"等人(Blackwell科學(xué)出版社，1988)所述的條件，或按照所用試劑制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1(基因的克隆及測序)在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索已發(fā)表的楊樹4-CL基因序列，用01igo6.0軟件(通過商業(yè)途徑市場購買獲得，下同)設(shè)計(jì)基因編碼序列的兩側(cè)引物(正向引物[5，-ATGMTCCACAAGMGMTTCATC-3'];反向引物[5，-TTATATGCCTGCCMCTTTTCTTTCAG-3，])，用來從毛白楊中擴(kuò)增4一CL的對應(yīng)序列。1、提取毛白楊mRNA。RNA的提取(TRIZOLTMKit提取RNA)液氮研磨lOOmg材料。A.加lmlTRIZOL，室溫(20-25。C，下同)放置5min。B.加入200ul氯仿，劇烈振蕩30s，室溫放置2min。C.12000g，15min，4攝氏度。取上清至新管中，加入500ul異丙醇，混勻后室溫放置15min。D.12000g，15min,4攝氏度。去上清，加入lml7(m乙醇。E.7500g，7min,4攝氏度。去上清，空氣干燥。F.DEPC—H20溶解。2、cDNA第一鏈的反轉(zhuǎn)錄采用RevertAidHMinusFirstStrandcDNASynthesisKit(Fermentas)，操作參照所用試劑盒說明進(jìn)行。.-3、以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了基因序列如SEQIDN0:1所示。實(shí)施例2(載體構(gòu)建)利用PCR反應(yīng)在C4H啟動子5'端和3'端分別引入HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)序列，然后用HindlII/BamHI分別雙酶切C4H啟動子PCR產(chǎn)物和PBI121質(zhì)粒，將PCR酶切片段和質(zhì)粒酶切大片段連接后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5a(從商業(yè)途徑獲得)中擴(kuò)增，然后再將4-CL片段引入到該載體(PBI121)中并取代載體(PBI121)中原有的GUS序列，而載體中的35S啟動子序列則被C4H啟動子序列所取代(如圖2示)，其插入片段經(jīng)DNA測序鑒定。實(shí)施例3(植株的轉(zhuǎn)化與篩選)油菜的農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化A.無菌苗的準(zhǔn)備種子經(jīng)70%乙醇1min,氯化汞(HgCl2)浸泡13-15min，ddH20洗5次后，平鋪于MS培養(yǎng)基(PH5.8)中，瓊脂濃度0.8%。油菜無菌苗備用。B.油菜子葉柄轉(zhuǎn)化接種根癌農(nóng)桿菌LBA4404(含4-CL基因)于固體培養(yǎng)基LB上，兩天后挑取單菌落于50mlYEP液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g+酵母提取物10g+NaC15g+MgS040.5g)中培養(yǎng)。取4-5天無菌苗子葉柄，于菌液中浸泡5-8min，其間輕搖，而后倒去菌液，以無菌濾紙吸去外植體上殘留菌液。置于共培養(yǎng)基(MS+0.2mg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)+lmg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2、4-D)+200um乙酰丁香酮(AS)，PH5.8),上培養(yǎng)2-3天。C.將共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)入只含青霉素(Car)不含Kan的分化培養(yǎng)基中，黑暗條件的溫室中進(jìn)行脫菌與分化培養(yǎng)5-7天。再繼代在添加Kan篩選壓的選擇培養(yǎng)基(MS+3mg/L6-BA+0.1mg/La-萘乙酸(NAA)+5mg/L硝酸銀(AgN03)+400mg/LCar+15mg/LKan;pH5.8)中，進(jìn)行篩選，待分化出再生綠芽。D.待再生芽長至lcm時切取小芽移至生根培養(yǎng)基(MS+0.2mg/LNAA+10mg/LKan+400mg/LCar;pH5.8)上，用加Car與Kan的固體MS培養(yǎng)基篩選(見圖3A)。E.苗生根后，移栽入室外。IO天后移栽下土缽(見圖3B)。實(shí)施例4(轉(zhuǎn)化植株的核酸分析-PCR鑒定)(1)用于PCR的轉(zhuǎn)化植株總DNA的提取A.70%乙醇擦洗葉片，稱取大約lOOmgB.加入600ul抽提緩沖液(0.2MTris—Cl，0.25NaCl，25mMEDTA，0.5%SDS，pH7.5)，室溫快速研磨。C.1.5mlEpendorff管中渦旋混勻5-10s。D.12000rpm,25min，室溫。取上清，加等體積異丙醇，一20攝氏度沉淀過夜。E.12000rpm，15min，室溫。加入70%乙醇200ul泡洗DNA沉淀。F.12000rpm，15min，室溫。去乙醇。倒置于紙巾上，待乙醇揮發(fā)干凈。G.加無菌水100ul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度計(jì)測定或電泳估測其濃度。H.以總DNA為模板，進(jìn)行PCR。(2)PCR程序PCR反應(yīng)混合液的配比同質(zhì)粒(含4-CL基因)PCR鑒定，依據(jù)植物表達(dá)載體中目的基因及其上游C4H啟動子序列，設(shè)計(jì)并合成PCR引物。(正向引物[5，-CAGCTTCTTCTGCTTTCMTTACTCTC-3，]和反向弓l物[5，-CMCAGGMCTTCTCCCGCATT-3']，反應(yīng)的時間和溫度作如下.-94。C3min94。C45s，59°C45s72'C2min30s，30cycles72。C5min檢測結(jié)果顯示，陽性對照和大多數(shù)轉(zhuǎn)化植株均能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的電泳條帶(pBI-CW:d:1527bp)，而陰性對照則沒有，表明轉(zhuǎn)基因油菜基因組中己經(jīng)含有外源基因DNA片段，結(jié)果如圖4示。實(shí)施例5(對TO代轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行木質(zhì)素含量，菌核病抗性和莖桿強(qiáng)度的測定。(1)木質(zhì)素含量的測定將切取的莖段部分在烘箱中烘干至恒重，用粉碎機(jī)充分粉碎后，稱取0.3g樣品，加入7.5ml72%的硫酸，3(TC消化lh，然后用蒸餾水將消化液稀釋至硫酸濃度為4%，12rC下處理lh，冷卻至室溫后，單層濾紙過濾，最后將殘?jiān)娓珊蠓Q重，計(jì)算木質(zhì)素的含量。本實(shí)驗(yàn)在所獲得的31個(PCR陽性)37301TO代轉(zhuǎn)基因株系中，選取部分轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行木質(zhì)素含量的測定(見表1)。從'表中可以看出，轉(zhuǎn)基因株系6、13、18的木質(zhì)素含量與對照相比均有所增高，其中6號和13號株系增幅最大，分別為13.41%和11.48%。_表l轉(zhuǎn)基因油菜木質(zhì)素含量分析_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)菌核病抗性鑒定油菜苗期采用離體葉接種菌核鑒定。在油菜抽苔前，從同一部位剪取葉片，將葉片放入白磁盤，每盤兩組，每組8片葉，葉柄用濕紗布保濕。菌絲片倒置于葉片的主脈上部葉肉。接種后用透明塑料薄膜覆蓋保濕100%，23'C溫育2d后,調(diào)查病斑直徑(cm)。三次重復(fù)，每次重復(fù)5-7片葉，計(jì)算其平均病斑面積，結(jié)果顯示，與對照非轉(zhuǎn)基因植株相比，轉(zhuǎn)基因株系6，13，18的病斑擴(kuò)展面積變小(P〈a=0.05),分別為對照的66.42%、77.87%、72.08%(見圖5)。(3)莖桿強(qiáng)度測定在油菜成熟期間，用倒伏試驗(yàn)器DIK-7401(購置日本)對油菜的莖稈強(qiáng)度進(jìn)行測定。選取生長正常的油菜，每個小區(qū)測定15株，于莖桿中部處截去上層冠層部分，用稈強(qiáng)儀將植株彎成一定的角度(45°)，測定莖桿強(qiáng)度(N/莖)，計(jì)算其平均值。結(jié)果表明，而莖桿強(qiáng)度則比對照有所增強(qiáng)(P〈a=0.05)，增加幅度分別為27.58%、17.16%、22.84%(見圖6)。SEQUENCELISTING<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所〈120〉毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4-CL及應(yīng)用<130>毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4-CL及應(yīng)用〈歸1<170〉Patentlnversion3.1<210〉1<211>1631〈212〉腿<213>毛白楊<參1cgccggatccatgaatccacaagaagaattcatctttcgccagacatcta60catcccg犯aaaccttcccctgcattcatacgttcttg犯aacttgtctaaccattcatc120aaaBccttgcctgata犯tggggcg肌tggagatgtctacacctatgctgacgttgagct180CELCELgC犯ga兆agttgcttctggtcttaac犯gattggtattc犯caaggtgacgtgat240catgctcttcctaccaeLgttcacctg犯ttcgtgcttgctttcctaggcgcttcacacag300aggtgCC8Lttatcactgctgccaatcctttctccacccctgc卿gctagcaaaacatgc360caaggcctcgELgagc犯agcttctgataacELC鄉(xiāng)Cttgttactacgagaaggtta犯ga420ttttgcccgag犯3gtgstgttaaggtcatgtgcgtggactctgccccggatgggtgctt480gcacttttcagagct犯cacaggc卿cgacctcaggtcgacattegtcc540cgatgatgtcgtagcattgccttattcatcagggactacagggttgccaa600gtt犯cgcaca犯gggct犯taaccagtgttgctcaacaiggt卿tggagacaatcctaa660cctgtattttMcagtgaagatgtgattctgtgtgtgctgcctatgttccatatctatgc720tctg犯ttC8gtt犯tgctctgcgggctgagagtcggtgcctcgattttgataatgcc幼a780gtttgagattggttctttactgggattgattg卿agtac犯ggtatctstagcaccggt840tgttccacctgtgEltg8tgtcaattgctaagtcacctgatcttgacaagcatgacttgtc900ttctttgaggatgat犯aatctgg鄉(xiāng)ggctccattgggcaagg犯cttg犯gatactgt960cagagct肌gtttcctcaggctagacttggtcagggatatgg犯tgaccgaggcaggacc1020tgttctagca3tgtgCttggcatttgccaaggaaccattcgarataaaacc鄉(xiāng)tgcatg麵tgggactgtagtc鄉(xiāng)aBtgcagageitgaagattgttgaccc3gaaac3ggggcctctct1140accgaggaacCELgCCtggtgagatctgcatccggggtgatcagatcatgaaaggatatct1200taatgaccctgaggc犯cctagacaaagaaggatggctgcac3caggcgs1260tatcggctacatgatgagcttttcatcgttgElCELgELttgaagg犯ttgat1320c犯gtata犯gggUtc兆gttgctcctgctgaactcgaagctctgttaatagcccatcc13808gagatatccgatgctgctgtagtaggattgaa卿tgag犯tgcgggagaagttcctgt1440tgcatttgtagtg犯atcaga^aagtctcaggccaccg犯agcagtatat1500ttcaa犯caggtg3tettctttcttcattgaagctattcc1560caaggcaccatctggcaagatcctgagg犯gaatctga犯gaaaagttggcgggcatata1620agagctcctcg163權(quán)利要求1.一種DNA分子，其堿基序列如SEQIDNO1所示。2、權(quán)利要求1所述的一種毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4一CL在油菜抗菌核病的中的應(yīng)用。3、權(quán)利要求1所述的一種毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4一CL在油菜抗倒伏中的應(yīng)用全文摘要本發(fā)明公開了一種毛白楊木質(zhì)素單體合成基因4-CL及應(yīng)用。該基因負(fù)責(zé)催化各種肉桂酸及其衍生物生成相應(yīng)的輔酶A酯，參與各種下游次生產(chǎn)物的合成，是調(diào)控木質(zhì)素合成的關(guān)鍵基因。研究結(jié)果表明，木質(zhì)素含量的增加增強(qiáng)了植物抵抗病原物的侵染，提高了油菜莖稈強(qiáng)度，使其抗倒伏性明顯增強(qiáng)。具體結(jié)果表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因油菜木質(zhì)素含量比受體對照木質(zhì)素含量增加10％以上；轉(zhuǎn)基因植株葉片比受體對照病斑擴(kuò)展面積變小30％左右；轉(zhuǎn)基因植株莖稈強(qiáng)度比對照增強(qiáng)達(dá)20％左右。文檔編號A01H1/00GK101280315SQ200810047778公開日2008年10月8日申請日期2008年5月20日優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日發(fā)明者靜劉,劉貴華,瑋華,慶楊,楊向東,王新發(fā),王漢中,鄭元本申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所