專利名稱：一種利用植物油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)人胰島素樣生長因子-i的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)外源蛋白的方法。具體
地，本發(fā)明涉及一種利用植物油體表達(dá)系統(tǒng)在植物種子中高效表達(dá)人胰島素樣生長因子-I 的方法。
背景技術(shù)：
胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor, IGF)，又稱類胰島素生長因 子，是一種多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子。1978年Humbel等首次純化到兩種形式的IGF， IGF-I 和IGF-II，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)與胰島素原(proinsulin)類似而得名。其中IGF-I對細(xì)胞正常生 長、胚胎發(fā)育、神經(jīng)生長、腫瘤免疫、能量代謝等方面起著十分重要而廣泛的作用，IGF-I生 物學(xué)作用廣泛，其生物學(xué)效應(yīng)主要有促有絲分裂作用(如促進(jìn)細(xì)胞分化，剌激RNA、DNA的合 成和細(xì)胞增殖)和類胰島素原作用(如抑制肝糖釋放，增加葡萄糖攝取和轉(zhuǎn)化，抑制脂肪分 解，減少游離脂肪酸和氨基酸的血液濃度，促進(jìn)脂質(zhì)和糖元以及蛋白質(zhì)的合成)。IGF在臨 床治療上的應(yīng)用價值正在被廣泛的認(rèn)識和研究，目前臨床研究表明IGF在侏儒癥、骨質(zhì)疏 松、抗胰島素糖尿病、出血性潰瘍癥及燒傷和末梢神經(jīng)損傷等許多疾病治療中都具有重要 的應(yīng)用價值。用大腸桿菌生產(chǎn)的重組人IGF-I已經(jīng)被批準(zhǔn)應(yīng)用于兒童IGF-I不足和生長激 素(GH)基因缺失的治療。 隨著對IGF-I、 IGF-I受體和IGF-I結(jié)合蛋白(IGFBP)研究的深入，IGF-I在臨床 疾病治療方面的潛在應(yīng)用價值將被進(jìn)一步開發(fā)，社會對IGF-I的需求也越來越大。但天然 IGF-I的純化存在很多困難，因此利用基因工程的方法獲得IGF-I有著廣闊的研究及生產(chǎn) 前景。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)嘗試在多個表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)IGF-I，這些系統(tǒng)包 括大腸桿菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞等。這些方法都存在一定的局限性，如大腸桿菌中表達(dá)的 IGF-I難以形成正確的二硫鍵，往往以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá)，需要經(jīng)過繁瑣的復(fù)性和純化 過程才能得到有活性的產(chǎn)品。而用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)則因為需要昂貴的設(shè)備和培養(yǎng)基而導(dǎo) 致過高的生產(chǎn)成本。 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)給重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)提供了一個新的選擇，從1983年首 次獲得轉(zhuǎn)基因植物至今，植物基因工程的研究和應(yīng)用取得了飛速發(fā)展。近年來，人們發(fā)現(xiàn)利 用植物作為重組蛋白的表達(dá)宿主具有很多優(yōu)勢，用植物生產(chǎn)藥用蛋白越來越受到了人們的 重視，成為國際上植物基因工程發(fā)展的一個新趨勢。目前已經(jīng)有多個重要藥用蛋白在植物 中表達(dá)成功，如水蛭素、胰島素、干擾素、人血清白蛋白、人表皮生長因子等以及多種抗體和 疫苗，為利用植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白打下了基礎(chǔ)。 在眾多的利用植物表達(dá)外源藥用蛋白的策略中，油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)在外源蛋白的 表達(dá)和純化上有巨大的應(yīng)用潛力，近年來備受關(guān)注。油體蛋白是油菜、玉米、擬南芥等植物 種子中的一類豐富的存在于儲存細(xì)胞器油體表面的結(jié)構(gòu)蛋白，含量達(dá)到種子總蛋白的2 4%。從結(jié)構(gòu)來看，油體蛋白可以分為三個部分，物種間保守性較高的中間疏水域和N-端、
3c-端的兩親性結(jié)構(gòu)域，疏水域?qū)τ腕w蛋白正確定位至油體的功能非常重要，而油體蛋白
N-端或C-端氨基酸序列的改變不會影響油體蛋白在油體上的定位。1994年人們在油菜 中表達(dá)油體蛋白和e-葡糖醛酸糖苷酶(13-glucuronidase, GUS)的融合蛋白獲得成功， 融合蛋白正確定位至油體上，且蛋白能在種子中長期儲存或提取后放置3-4周仍然能保持 活性，證實了油體蛋白作為載體表達(dá)外源蛋白的可行性。有關(guān)水蛭素(hirudin)、胰島素 (insulin)等均在該系統(tǒng)中表達(dá)取得成功。 在重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中，重組表達(dá)的蛋白通常需要從表達(dá)的宿主中提取出來并進(jìn) 行純化后才能得到應(yīng)用，特別是對于藥用蛋白，蛋白的純化在整個生產(chǎn)過程中要占到80 % 以上的成本，因此純化策略的選取在植物作為生物反應(yīng)器的過程中是一個非常重要的因 素。在植物油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)中，利用油體親脂疏水并且密度比水小的性質(zhì)，可以通過"懸 浮_離心"(flotation-centrifugation)的方法方便地將油體與其他多數(shù)細(xì)胞組分分離開 來。經(jīng)過多次洗滌后，油體蛋白及與其融合的目標(biāo)蛋白也在油體中得到富集和純化?？傊?， 與其他植物表達(dá)系統(tǒng)相比，油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)具有重組蛋白表達(dá)量高、目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性好、 蛋白提取純化方便等優(yōu)勢，同時，油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)的宿主植物主要是油菜、大豆、玉米等 農(nóng)作物，這些作物種植和種子加工技術(shù)都在傳統(tǒng)的食品工業(yè)中得到發(fā)展，而且分離目標(biāo)蛋 白種子中的油等其他部分仍然可以利用，在這些作物的種子中表達(dá)外源蛋白大大增加了農(nóng) 產(chǎn)品的附加值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用植物油體表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)人胰島素樣生長因 子-I (human insulin-like growth factor I， hIGF-1)的方法，利用這種方法得到的胰島 素樣生長因子-I可以應(yīng)用于兒童IGF-I不足和生長激素(GH)基因缺失的治療以及其他臨 床和實驗室的研究。 本發(fā)明首先按植物密碼子的偏愛性設(shè)計、通過基于PCR的基因合成方法 (PCR-based gene synthesis)人工合成了 hIGF-1基因的全序列，該序列如SEQ IDNO. 1所 示； 進(jìn)一步，本發(fā)明構(gòu)建了含有油體蛋白基因與上述hIGF-I基因的融合蛋白基因的
表達(dá)載體，所述的油體蛋白基因為擬南芥18. 5kDa油體蛋白基因，兩個基因之間設(shè)計的編
碼煙草蝕刻病毒蛋白水解酶(Tobacco etch virus protease, TEVP)的識別序列的核苷酸
序列，表達(dá)載體所選用的啟動子為擬南芥18. 5kDa油體蛋白的啟動子； 然后，將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植株，將帶有油
體蛋白啟動子、油體蛋白-胰島素樣生長因子融合基因及rbsS polyA終止子的表達(dá)盒整合
到植物基因組中，篩選和培養(yǎng)出帶有上述融合基因的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)一步育種得到后代不
發(fā)生分離的純合植株，該植株所產(chǎn)生的種子中含所述hIGF-I蛋白；并且，該植株的性狀能
長期穩(wěn)定遺傳到下一代，所述的hIGF-I具有正確的生物學(xué)活性。 具體地，本發(fā)明包括如下的步驟 (1)按照植物密碼子偏愛性設(shè)計和合成hIGF-I基因； (2)從擬南芥基因組中分離得到擬南芥18. 5kDa油體蛋白基因及其啟動子；
(3)將hlGF-I基因核苷酸序列連接到油體蛋白基因核苷酸序列的3'端，將整個融合蛋白基因置于油體蛋白啟動子下游，以植物表達(dá)載體pHB為骨架構(gòu)建hIGF-I的油體蛋白 表達(dá)載體； (4)將步驟(3)所得到的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101中；
(5)用步驟(4)中所得到的含有hIGF-I的油體蛋白表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)?宿主植物(如擬南芥、油菜)； (6)通過抗性和PCR的方法篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株； (7)篩選hIGF-I表達(dá)量高的植株，培育數(shù)代直至性狀不發(fā)生分離； (8)將步驟(7)所得到的轉(zhuǎn)基因植株種子經(jīng)過粉碎、懸浮-離心法純化得到油體蛋
白_人胰島素樣生長因子-I的融合蛋白； (9)用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y檢驗步驟(8)中所得到的蛋白的活性。
所述人hIGF-I基因是指，人工合成的經(jīng)過植物偏愛密碼子優(yōu)化的hIGF-I基因序 列； 所述油體蛋白啟動子是指，為了提高基因的表達(dá)效率，本發(fā)明采用了擬南芥 18. 5kDa油體蛋白基因啟動子，該啟動子驅(qū)動的油體蛋白基因是擬南芥種子中表達(dá)量最高 的油體蛋白基因。本發(fā)明所指油體蛋白基因的啟動子還包括其他的植物種子特異性啟動 子，如菜豆球蛋白啟動子，油菜油體蛋白啟動子等。 所述的通過PCR檢測獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株是指，分別設(shè)計合成油體蛋白基因和 hIGF-I基因的檢測引物，進(jìn)行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為轉(zhuǎn)基因 陽性植株。 所述融合蛋白的純化是指，通過"懸浮_離心"的方法將油體蛋白_人胰島素樣生 長因子-I融合蛋白從種子中分離出來。 所述hIGF-I的生物學(xué)活性檢驗是指，利用hIGF-I能促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行分化
的性質(zhì)，將表達(dá)的hIGF-I蛋白添加至SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)基中，觀察發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞發(fā)生了分化。 采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)人胰島素樣生長因子-I具有如下優(yōu)點 1、高等植物表達(dá)蛋白質(zhì)的修飾加工機制和哺乳動物類似，植物中表達(dá)的外源蛋
白，能進(jìn)行正確的折疊和組裝，這對于具有生物學(xué)活性的藥用蛋白的生產(chǎn)十分重要。 2、利用植物生產(chǎn)外源蛋白可以避免動物病原體的感染及大腸桿菌中內(nèi)毒素的污染。 3、采用油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)hlGF-I，可以大大簡化目的蛋白的分離純化過程， 降低生產(chǎn)成本，同時有利于hIGF-I的產(chǎn)業(yè)化。 4、采用擬南芥中含量最高的油體蛋白及其啟動子作為表達(dá)hlGF-I載體的元件， 提高了人胰島素樣生長因子-I的表達(dá)量。 5、在油體蛋白和hIGF-I之間設(shè)計了煙草蝕刻病毒蛋白水解酶(TEVP)的識別序 列，為hIGF-I的純化進(jìn)一步降低了成本。


圖1是基于PCR方法的人胰島素樣生長因子-I基因的合成。 圖2是油體蛋白和hIGF-I融合基因載體pBS-SK-AtOle-hIGF構(gòu)建過程示意圖。 圖3是植物油體表達(dá)載體pHB-myc-AtOP-AtOle-hIGF構(gòu)建過程示意圖。
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圖4是表達(dá)載體pHB-myc-At0P-At01e-hlGF中融合基因結(jié)構(gòu)詳細(xì)示意圖。 圖5是hIGF-I在擬南芥種子中表達(dá)的Western檢測圖。 圖6是表達(dá)hIGF-I的擬南芥種子油體蛋白純化結(jié)果 圖7是擬南芥種子中表達(dá)的hIGF-I活性實驗檢測結(jié)果。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，旨在進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，但不用來限 制本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 分子克隆實驗室手冊(New York :Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的
條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 人胰島素樣生長因子-I基因的制備及序列測定 根據(jù)Genbak中已報道的hIGF-I蛋白序列，在其N_端設(shè)計煙草蝕刻病毒蛋白酶 (TEVP)的識別位點，按照植物密碼子使用偏愛，設(shè)計出經(jīng)植物密碼子優(yōu)化的hIGF-I基因核 苷酸序列。為了構(gòu)建載體的方便，在其兩端分別設(shè)計限制性酶切位點Bgl II和Pst I。根 據(jù)該核苷酸序列，利用軟件Primer Premier設(shè)計合成了 5條引物，每條引物長度40 80bp 不等，相鄰兩條引物之間重疊18 20bp，通過基于PCR合成的方法合成全長hlGF-I基因。
上述引物是hIGF-Ia :5' -AGATCTGAAAACCTTTACTTCCAGGGACCTGAGACCCTCTGTGGAGCA-3'
TTTCTACTTCAACAAGCCAACTG-3'
G-3'
CGATTCCGGTTTGAGGTGCTC-3' -3, hIGF-I全長基因的合成使用高保真酶KOD (TaKaRa公司)按照如下體系和程序進(jìn) 行反應(yīng) 反應(yīng)體系 10XK0D bufffer 5 ii L 25mM MgS04 3 ii L 2mM d證mix(2. 5mM) 2 ii L Primer hIGF-la (10 iimol/L) 2 ii L
Primer hIGF-Ib (lu mol/L) 2uL
Primer hIGF-Ic (lu mol/L) 2uL
Primer hIGF—Id (1 ii mol/U 2 ii L
Primer hIGF-Ie (10 iimol/L) 2 ii L ddH20 29 ii L KOD liiL _ Total volume 50u L 反應(yīng)程序94 °C for 2min， (94 °C for 15sec，61 °C ramp to 56 °C for 15sec，72 °C for 25sec) X lOcycles， (89 °C for 15sec，58 °C for 15sec，72 °C for 25sec) X25cycles，72。C for 8min。 待上述PCR過程反應(yīng)完成后，加入1 y L Taq plus酶于72"繼續(xù)反應(yīng)20min以在 PCR產(chǎn)物的3'端添加A堿基用于T vector連接。 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過1.5X瓊脂糖凝膠電泳分離，回收約250bp的片段(見附圖l)，連 接到pMD18-T vector中，經(jīng)過測序序列正確后得到含有經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化的hIGF-I 基因序列的載體，該載體命名為pMD18-T-hIGF。經(jīng)DNA序列測定表明，本發(fā)明設(shè)計合成的 hIGF-I核苷酸序列與設(shè)計一致。
實施例2 人胰島素樣生長因子-I油體表達(dá)載體的構(gòu)建
1.擬南芥18. 5kDa油體蛋白基因的克隆 按照已發(fā)表的擬南芥18. 5kDa油體蛋白基因序列(Genbak登錄號X62353)設(shè)計 引物At01eFl (5' -GGATCCATGGCGGATACAGCTAGAG-3 '，加下劃線為Nco I酶切位點)和A t01eRl (5' -AGATCTTTAAGTAGTGTGCTGGCCA-3'，加下劃線為Bgl II酶切位點)，以擬南芥 (Arabidopsis thaliana) cDNA為模板通過PCR的方法獲得擬南芥油體蛋白基因編碼區(qū)。反 應(yīng)條件94。C for 5min， (94°C for 40sec， 59°C for 40sec，72。C for lmin) X 33cycles， 72°C for 8min。反應(yīng)產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分離得到約530bp的片段，回收后連接到 pMD18-T vector中，得到載體pMD18-T-At01e，測序結(jié)果表明所得到的片段與報道序列一 致。 2.擬南芥18. 5kDa油體蛋白基因啟動子的克隆 設(shè)計引物At0PFl(5' -GAATTCCCTCGGTCTTGGTCAC-3'，加下劃線為EcoR I酶切位 點)和At0PRl (5' -GGATCCTTTTTTGTTCTTGTTTACTA-3'，加下劃線為BamH I酶切位點)以 同上的方法獲得擬南芥油體蛋白基因啟動子。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離得到約 860bp的片段，回收后連接到pMD18-Tvector中，得到載體pMD18-T-At0P，經(jīng)測序表明所得 序列正確。 3.人胰島素樣生長因子-I植物油體表達(dá)載體的構(gòu)建 用Nco I和Bgl II雙酶切上述含有擬南芥18. 5kDa油體蛋白的質(zhì)粒 pMD18-T-At01e，將得到的約530bp片段連接到同樣酶切的中間載體pBS-SK中，得到載體 pBS-SK-At01e ;用Bgl II和Pst I雙酶切含有hIGF-I基因的質(zhì)粒pMD18-T-hlGF，將得到的 約250bp片段連接到同樣酶切的載體pBS-SK-At01e中，得到載體pBS-SK-At01e-hlGF (見 附圖2)。用EcoR I和BamH I分別雙酶切帶有擬南芥油體蛋白啟動子的載體pMD18-T-At0P 和植物表達(dá)載體pHB，連接構(gòu)建成載體pHB-AtOP ;用BamH I和Pst I雙酶切質(zhì)粒 pBS-SK-At01e-hlGF，將得到的片段連接到同樣酶切的載體pHB-At0P中，得到hIGF-I基因的植物表達(dá)載體pHB-myc-At0P-At01e-hlGF(見附圖3)。該載體在At01e的上游插入了一 段編碼myc標(biāo)簽的序列，用于檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)。
實施例3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化與篩選
1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 利用凍融法將上述載體pHB-myc-AtOP-AtOle-hIGF轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101 中。將5 ii L質(zhì)粒加入200 ii L農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中混合均勻，冰浴30分鐘；置液氮 中速凍5分鐘后，迅速取出轉(zhuǎn)至37t:水浴鍋中溫育5分鐘。加入800ii L無抗生素LB，在低 于200rpm的28t:搖床上復(fù)蘇培養(yǎng)3小時；復(fù)蘇后取200 y L菌液均勻涂布于含利福平25mg/ L、慶大霉素25mg/L和卡那霉素50mg/L的LB平板上，2『C倒置培養(yǎng)2天。挑取分離良好的 單克隆菌落接種于含利福平25mg/L、慶大霉素25mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液體培養(yǎng)基 中于28t:搖床培養(yǎng)過夜；取2iiL菌液用于PCR檢測，反應(yīng)條件94。C for 3min， (94°C for 40sec，58。C
for 40sec，72。C for lmin) X 33cycles， 72°C for 8min。反應(yīng)結(jié)束后取10 ii L產(chǎn)物用1 %
瓊脂糖凝膠電泳檢測。 2.擬南芥轉(zhuǎn)化與篩選 采用浸花(floral-dip)法轉(zhuǎn)化擬南芥。 將上述含有目標(biāo)基因載體的農(nóng)桿菌于28t:培養(yǎng)過夜，至0De。。" 2.0，4500rpm離 心10分鐘收集菌體；菌體沉淀懸浮于新鮮配制的轉(zhuǎn)化緩沖液中(MS 4.41g/L，蔗糖50g/L， 6-BA 10 ii g/L， SILWET-77400 y L/L， pH 5. 8)，至終濃度為0D6。。 "0.8。取生長一個月左右、
生長狀況良好的植株，將擬南芥地上部分全部花苞被浸沒于上述懸浮好的菌液中約5秒；
用吸水紙吸去多余的液體，將植物平放于一個密封的小盒內(nèi)以保持濕度，避光過夜；第二天 將植物取出，豎直，轉(zhuǎn)移到正常條件下生長，直至種子成熟。 T。代種子完全成熟后將其收獲，種子消毒后均勻播種于含潮霉素50mg/L的MS固
體培養(yǎng)基上，于fC春化2天后移到培養(yǎng)室中，在22°C， 16h光/8h暗的條件下生長一周；然
后選取抗性幼苗將其移栽至土中繼續(xù)培養(yǎng)。待植株長大后提取葉片DNA進(jìn)行PCR檢測確認(rèn)
陽性植株，待種子成熟后收獲種子進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。 實施例4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測 以上述不同獨立轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA為模板，分別用擬南芥油體蛋白基因兩 端引物和人胰島素樣生長因子-I基因兩端引物進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)條件94°C for 3min， (94°C for 40sec，59。C for 40sec，72。C for lmin) X 33cycles， 72°C for 8min。反應(yīng)產(chǎn) 物用1. 2X瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離檢測，分別得到與預(yù)期大小一致的530bp和250bp的條帶。 實施例5 擬南芥種子中油體蛋白的提取 40mg擬南芥種子用250 ii L油體提取buffer 1 (0. 4M蔗糖，O. 5M NaCl， 50mMTris-HCl， pH 8. 0)研磨，于lOOOOg離心lOmin ;取出頂層油相，用100 ii L buffer 2(50mM Tris-HCl， pH 8.0，0.5M NaCl)重懸，lOOOOg離心10min，重復(fù)三次；頂層油相
8用buffer 3(50mM Tris-HCl， pH 8.0)重懸，10000g離心lOmin后重懸在磷酸buffer 3 中，稀釋后用于Bradford法測定蛋白濃度。用于蛋白電泳的樣品加入1/10體積的50mM Tris-HCl， pH 8.0， 2% SDS溶液中，煮沸后離心，取水相加入蛋白樣品緩沖液后進(jìn)行電泳。 結(jié)果見附圖6，第一道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，第二道為非轉(zhuǎn)基因擬南芥種子油體蛋白，第三
道為轉(zhuǎn)基因種子油體蛋白，箭頭所示為融合蛋白。
實施例6 擬南芥種子中融合蛋白的Western Blot檢測
1.蛋白SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜種子油體蛋白按照Schagger的方法用10%不連續(xù)Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠 在Bio-red公司的垂直電泳裝置中進(jìn)行電泳分離，條件為30V電泳1小時后改為80V電泳 至溴酚藍(lán)條帶跑出凝膠。電泳結(jié)束后用Bio-red公司的蛋白電泳轉(zhuǎn)移裝置，將蛋白轉(zhuǎn)移至 0. 45 ii m PVDF膜上，條件為30mA恒流過夜。
2.膜的雜交 膜的雜交操作按照QIAGEN公司的操作手冊The QIAexpressionist進(jìn)行， 一抗使 用兔抗人胰島素樣生長因子-I多克隆抗體，二抗使用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，使用 Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase (Promega公司)進(jìn)行顯 色。Western blot結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因擬南芥種子油體蛋白中有hIGF-I的表達(dá)，產(chǎn)物大小 約為34kDa，與融合蛋白預(yù)期大小一致。 Western blot分析結(jié)果見圖5，第1道為陽性對照，第2道為預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo) 準(zhǔn)，第3道為非轉(zhuǎn)基因擬南芥種子蛋白，第4 10道為獨立轉(zhuǎn)化植株種子蛋白。
實施例7 擬南芥中表達(dá)的人胰島素樣生長因子-I的生物學(xué)活性檢測 將液氮中凍存的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y迅速放入37。C水浴中，輕輕搖勻 使細(xì)胞快速溶解，轉(zhuǎn)到15mL離心管中，加入預(yù)先37t:溫?zé)岬?mL添加10%胎牛血清的 RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中。800g，室溫離心3分鐘后吸去上清，加入5mL培養(yǎng)液重懸，轉(zhuǎn)移到 25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37t:，5X 0)2條件下培養(yǎng)。24小時后換液，去除死細(xì)胞。待細(xì)胞生 長至互相接觸，將細(xì)胞傳代，先吸去原有培養(yǎng)液，用PBS洗去殘留血清。加入0. 5mL胰酶于 37t:消化2分鐘，輕輕拍打瓶壁使細(xì)胞脫落。加入2. 5mL培養(yǎng)液中和胰酶，用移液管吹打成 單細(xì)胞。 800g，室溫離心3分鐘，棄上清，加入lmL培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞。取10 y L細(xì)胞懸液和 30 ii L臺酚藍(lán)溶液混勻，轉(zhuǎn)移到血小板計數(shù)器上計數(shù)。以每培養(yǎng)瓶約5X 104個細(xì)胞接種平 行的4瓶。培養(yǎng)12小時待細(xì)胞貼壁后加入蛋白樣品，繼續(xù)培養(yǎng)36小時觀察結(jié)果。
人胰島素樣生長因子-I對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的促分化結(jié)果見附圖7， A為不加蛋白樣品的培養(yǎng)基作為空白對照；B為50ng/mL hIGF-I作為陽性對照；C為非轉(zhuǎn)基 因擬南芥種子油體蛋白樣品作為陰性對照；D為含hIGF-I 50ng/mL的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子油 體蛋白。結(jié)果表明擬南芥種子中表達(dá)的hIGF-I能夠促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行分化，具有生物 學(xué)活性。
序列表 〈110>復(fù)旦大學(xué)
〈120〉 一種利用植物油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)人胰島素樣生長因子-I的方法
〈160>4〈170>PatentIn version 3. 4〈210>1〈211>249〈212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificialSequence〈220〉〈223>Designed DNA coding for humaninsulin-likegrowth factor Ibasedoncodon usagein plants〈400>1agatctgaa aac ctt tac ttc cag gga3ct gag acc etc tgt gga gca48Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala1510gaa cttgttgatgetetcttcgtgtgtgg￡l g￡lC3gaggtttc tac96Glu LeuValAspAlaLeu GinPheValCysGly AspArgGlyPhe Tyr15202530ttc aac朋gCC3actgga tecgg￡itctteatct agg3gagCElcct144Phe AsnLysProThrGly TyrGlySerSerSer ArgArgAlaPro Gin3540453CC ggaategttgatgag tgctgtttc3gatea tgcgatctt3gg卿192Thr GlylieValAspGlu CysCysPheArgSer CysAspLeuArg Arg505560ctt gagEltgtactgcget cctctt朋gCC3get朋gtctgettaactgc241Leu GluMetTyrCysAla ProLeuLysProAla LysSerAla657075aggttacc249〈210>2〈211>7〈212>PRT〈213〉A(chǔ)rtificialSequence〈220〉〈223>Designed peptide of Tobacco etch virus protease cleavage site
〈400>2Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly15〈210>3〈211>70〈212>PRT
10:0143] 〈213>Homo sapiens
:0144] 〈400>3
:0145] Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gin Phe
:0146] 15 10 15
:0147] Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
:0148] 20 25 30
:0149] Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly lie Val Asp Glu Cys Cys
:0150] 35 40 45
:0151] Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
:0152] 50 55 60
:0153] Lys Pro Ala Lys Ser Ala
:0154] 65 70
:0155] 〈210>4
:0156] 〈400>4
:0157] 000
權(quán)利要求
一種在植物種子中高效表達(dá)融合基因的載體，其特征在于，該載體上的表達(dá)盒自5′至3′依次包含以下元件油體蛋白啟動子或種子特異表達(dá)啟動子、外源目標(biāo)蛋白基因和油體蛋白基因的融合基因、終止子序列rbsS polyA。
2. 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，所述外源目標(biāo)蛋白為人胰島素樣生長因子-I。
3. 如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述人胰島素樣生長因子-I基因具有 SEQ ID NO. l所示的核苷酸序列，該基因所用的密碼子為植物偏愛性密碼子，其5'端具有 編碼煙草蝕刻病毒蛋白水解酶識別位點序列的核苷酸序列，該基因所編碼的蛋白質(zhì)經(jīng)TEVP 酶切后具有與人體內(nèi)成熟的人胰島素樣生長因子-I蛋白完全一致的氨基酸序列。
4. 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體的啟動子為擬南芥油體 蛋白啟動子。
5. 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述的融合基因的油體蛋白基因為擬 南芥18.5kDa油體蛋白基因，該基因5'端添加了一段編碼Myc tag序列的核苷酸序列。
6. 如權(quán)利要求1 5所述的表達(dá)載體，其為pHB-myc-At0P-At01e-hlGF。
7. 權(quán)利要求1 6所述的表達(dá)載體在制備人胰島素樣生長因子-I中的應(yīng)用。
8. —種利用植物種子油體生產(chǎn)人胰島素樣生長因子-I的方法，其包括如下步驟(1) 用權(quán)利要求1 5所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體植物，篩選得到含有目的基因的轉(zhuǎn)化植株；(2) 篩選獲得種子中目的基因表達(dá)量高的植株；(3) 通過遺傳育種的方法獲得純系；(4) 從上述植株種子中分離純化得到人胰島素樣生長因子-I ;
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中受體植物為油菜、擬南芥、紅花、向日葵、或棉花。
10. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述(1)中轉(zhuǎn)化受體植物的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。
11. 權(quán)利要求8所述的方法得到的轉(zhuǎn)基因植物組織、植株和種子。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種利用植物油體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化人胰島素樣生長因子-I(human insulin-like growth factor I，hIGF-I)的方法。本發(fā)明方法按照植物密碼子的偏愛性設(shè)計合成了人胰島素樣生長因子-I基因，將所述人胰島素樣生長因子-I基因與油體蛋白基因融合，構(gòu)建成用種子特異性表達(dá)啟動子驅(qū)動的植物表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)化受體植物，在轉(zhuǎn)化植株種子中高效表達(dá)具有生物學(xué)活性的人胰島素樣生長因子-I。本方法得到的胰島素樣生長因子-I可應(yīng)用于兒童IGF-I不足和生長激素(GH)基因缺失的治療以及其他臨床和實驗室的研究。
文檔編號A01H5/10GK101736029SQ20081020321
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日
發(fā)明者唐克軒, 孫小芬, 李維, 游曉慧 申請人:復(fù)旦大學(xué)