專利名稱：一種油茶無(wú)性系組培苗高效生根方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種油茶無(wú)性系組培苗生根方法，具體是提供一種通過(guò)組織培養(yǎng)快 速繁殖獲得大量生根的油茶無(wú)性系苗木的方法。
背景技術(shù)：
油茶(Camellia spp)是我國(guó)特有的優(yōu)質(zhì)木本油料樹(shù)種，與油棕、椰子和油橄欖并
稱為世界四大木本油料樹(shù)種[1]。油茶種子榨取的茶油營(yíng)養(yǎng)豐富，不飽和脂肪酸含量高達(dá) 90%以上，是理想的食用油[2]，被譽(yù)為“東方橄欖油” [3]。此外，茶油在工業(yè)上可被用 于制取油酸及其酯類、生產(chǎn)肥皂和凡士林等，也可制成硬脂酸和甘油；在醫(yī)藥上，可用 于制作針劑和調(diào)制各種藥膏、藥丸等；在化妝業(yè)上，通過(guò)精煉可制作成天然高級(jí)美容護(hù) 膚系列化妝品。茶籽榨油后的枯餅，可提取殘油、茶皂素，發(fā)酵后可作高蛋白飼料，還 能通過(guò)粉碎用來(lái)作生物殺蟲(chóng)劑和機(jī)床的拋光粉等M。油茶全身都是寶，具有重要的經(jīng)濟(jì) 利用價(jià)值和社會(huì)資源價(jià)值。發(fā)展油茶生產(chǎn)有利于緩解我國(guó)食用油長(zhǎng)期依賴進(jìn)口，供需緊 張的矛盾，對(duì)提高我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)和人民生活水平具有重大意義。目前生產(chǎn)上常用的無(wú)性繁殖方式-芽苗砧嫁接法，該方法繁殖系數(shù)低，育苗周 期長(zhǎng)，操作繁雜，嫁接成活率和合格苗出圃率均較低，造林成活率不穩(wěn)定，造林成本 高，林相整齊度差，苗木繁殖系數(shù)低，難以滿足全國(guó)油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展對(duì)油茶優(yōu)良無(wú)性系的 需求，迫切需要研究油茶優(yōu)良無(wú)性系高效組培快繁新技術(shù)。組培快繁技術(shù)具有繁殖速度快、方法簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，材料消耗少，不受季節(jié) 和地域限制的特點(diǎn)，同時(shí)子代能夠保持母株的優(yōu)良遺傳特性。因此，研究油茶優(yōu)良無(wú)性 系組培快繁技術(shù)，對(duì)緩解油茶苗木緊張、加快油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展、推動(dòng)山區(qū)經(jīng)濟(jì)和提高人民 生活水平具有重大戰(zhàn)略意義。獲得大量生根且根系發(fā)達(dá)的組培苗，是實(shí)現(xiàn)規(guī)?；M培育 苗的關(guān)鍵，不僅能顯著提高試管苗移栽成活率，而且能大幅降低生產(chǎn)成本，大大提高了 組培苗的經(jīng)濟(jì)效益。20世紀(jì)80年代初期，國(guó)內(nèi)有學(xué)者對(duì)油茶組織培養(yǎng)開(kāi)展了研究。目前，油茶組織 培養(yǎng)方面的研究主要集中在外植體、培養(yǎng)基的選擇、激素和其他培養(yǎng)物的添加、植株再 生及其他條件等方面的研究。(1)外植體的選擇。油茶培養(yǎng)成功的外植體有普通油茶的子葉、下胚軸、幼胚、 花藥、腋芽，以及油茶與越南油茶雜交品種的子葉胚，油茶與小果油茶雜交品種的成年 樹(shù)莖尖。2002年，中南林學(xué)院畢方鋮等對(duì)油茶的莖段、幼胚、子葉在離體條件下進(jìn)行誘 導(dǎo)，獲得再生植株[q。李建安等(2003)對(duì)小果油茶和廣寧紅花油茶的花藥進(jìn)行離體培 養(yǎng)，并誘導(dǎo)形成愈傷組織[6]。2005年，中南林學(xué)院張智俊以油茶優(yōu)良無(wú)性系湘林4號(hào)腋 芽和子葉為外植體，分別采用附加不同種類激素的MS培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，誘 導(dǎo)出了完整植株。由腋芽培養(yǎng)產(chǎn)生的再生植株可用于優(yōu)良無(wú)性系的快速擴(kuò)繁，而以子葉 誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體獲得油茶優(yōu)良無(wú)性系的再生植株，不僅能滿足常規(guī)育種的需要，也將為 今后開(kāi)展油茶轉(zhuǎn)基因育種工作打下良好的基礎(chǔ)[7]。
(2)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的選擇。組織培養(yǎng)時(shí)，油茶生長(zhǎng)在一個(gè)相對(duì)可控的環(huán)境 中，培養(yǎng)基的種類營(yíng)養(yǎng)狀況及生存條件對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育方向起著不可忽視的作用。初代培 養(yǎng)能否啟動(dòng)與分化，培養(yǎng)基的選擇是一個(gè)關(guān)鍵。長(zhǎng)期以來(lái)，根據(jù)培養(yǎng)的組織不同，目的 不同，已設(shè)計(jì)了多種培養(yǎng)基。畢方鋮等(2004)以普通油茶Camellia oleifera優(yōu)良無(wú)性系 湘林4號(hào)為實(shí)驗(yàn)材料，研究了離體條件下帶芽的莖段、幼胚、子葉的愈傷組織的形成和 植株再生技術(shù)，發(fā)現(xiàn)莖段離體培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA3.0mg · LJ+NAA l.Omg · I/1對(duì)芽進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率達(dá)到83.33%;繼續(xù)在此培養(yǎng)基上繼代得到叢生芽，增 殖比例為1 20;對(duì)于幼胚和子葉，附加2，4-D 2.Omg · L^+KT l.Omg · L—1誘導(dǎo)愈傷 組織得到很好的效果，將愈傷組織轉(zhuǎn)到附加6-BA3.0mg · L J+NAA 0.05mg .I/1和6_BA 2.5mg · L VlAA 1.5mg · L—1的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出不定芽，誘導(dǎo)率達(dá)到90%以上；芽苗增 殖以MS+6-BA 2.5mg · L^+IAA 1.5mg · L—1的培養(yǎng)基為好[5]。張智俊等(2005)以油茶優(yōu) 良無(wú)性系“湘林4號(hào)”子葉為外植體，采用附加不同種類激素的MS培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行組織 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明子葉形成胚性愈傷組織的最適合培養(yǎng)基為MS+2.0mg · L'2, 4-D+1.0mg · IZ1KT;油茶優(yōu)良無(wú)性系的生根培養(yǎng)基以MS+7.0mg · IZ1NAA最適，但獲 得的再生苗大多只有一條主根，須根很少，試管苗移栽難以成活，故未能獲得移栽成活 的植株[7]。(3)此外，針對(duì)油茶組織培養(yǎng)中的褐變、污染、生根難等問(wèn)題的研究也取得一定 的進(jìn)展。聞麗等(2008)以普通油茶花藥培養(yǎng)中褐化的愈傷組織為材料進(jìn)行了組織化學(xué)分 析。發(fā)現(xiàn)，無(wú)褐化愈傷組織的細(xì)胞含淀粉、脂滴相對(duì)較多，而褐化愈傷組織細(xì)胞的含量 相對(duì)較少；褐化愈傷組織的細(xì)胞含單寧類物質(zhì)、過(guò)氧化物酶含量相對(duì)較多，而無(wú)褐化愈 傷組織的細(xì)胞含量相對(duì)較少。便于了解褐化的本質(zhì)原因，從而確定更加有效的培養(yǎng)技術(shù) 措施[8]。油茶生根有相當(dāng)大的難度，畢方鋮等發(fā)現(xiàn)在油茶幼苗的生根培養(yǎng)中，用NAA 和IBA產(chǎn)生的生根效果均較好，且出根快，但獲得的再生苗大多只有一條主根，須根很 少；在空氣中未接觸培養(yǎng)基所形成的不定根，卻有很多白色絨毛狀的須根出現(xiàn)，但很細(xì) 弱，在繼代培養(yǎng)中易折斷。以上檢索到的文獻(xiàn)表明，山茶科山茶屬植物油茶的組培苗生根十分困難，且移 栽難以成活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生根率高、根系質(zhì)量好、生產(chǎn)成本低的 油茶組培苗高效生根新技術(shù)。本發(fā)明提供的油茶無(wú)性系組培苗高效生根方法，包括初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、壯 苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)過(guò)程，其中(1)繼代培養(yǎng)基的篩選及激素配比將獲得的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行 增殖，培養(yǎng)基為 WPM+BA3--7mg/L+IBA0.1--2mg/L+ZT0.05--2mg/L ；(2)壯苗培養(yǎng)基的篩選及激素配比對(duì)增殖過(guò)程中獲得的無(wú)菌苗進(jìn)行壯苗，采 用WPM+IBA0.1—2mg/L+生物素0.5—3mg/L進(jìn)行壯苗，待組培苗長(zhǎng)到2—4厘米后進(jìn)行 生根誘導(dǎo)；(3)生根材料的激素預(yù)處理將組培苗的基部在1000 4000ppm的IBA溶液中浸泡5—10秒；(4)生根培養(yǎng)基的篩選將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的組培苗接種在(1/4-1) MS+AC200—600的培養(yǎng)基上，25—30天后，組培苗生根形成完整植株。采用本發(fā)明提供的繼代培養(yǎng)基，使增殖周期縮短至30天，增殖系數(shù)達(dá)4.2 9.1。經(jīng)過(guò)壯苗培養(yǎng)基、激素預(yù)處理及生根培養(yǎng)基后，生根率達(dá)85%以上。


圖1油茶組培苗增殖，增殖系數(shù)7.1 ；圖2油茶組培苗壯苗過(guò)程；圖3油茶組培苗生根狀；圖4油茶組培苗生根成活狀；圖5油茶組培苗生根成活狀。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1從油茶健壯植株上剪取當(dāng)年生新稍，取頂端4一6厘米進(jìn)行消毒處理；將初代 獲得的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)移到WPM+BA3mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.05mg/L繼代培養(yǎng)，增殖周期 為40天，增殖系數(shù)達(dá)4.2;將增殖過(guò)程中獲得的無(wú)菌苗采用WPM+IBAl.Omg/L+生物素 0.5mg/L進(jìn)行壯苗，25天組培苗長(zhǎng)至2-4厘米時(shí)從培養(yǎng)瓶中取出，將組培苗的基部在 IOOOppm的IBA溶液中浸泡10秒，然后接種在1/4MS+AC200的培養(yǎng)基上，30天后生根 率達(dá)89%。生根后，將組培苗移至營(yíng)養(yǎng)杯中，基質(zhì)為泥炭土 珍珠巖=3 1，移栽成 活率達(dá)93%。具體操作如下(1)將獲得的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖，培養(yǎng)基用300ml的廣口瓶分 裝，每瓶30ml，封口膜包扎，在121°C和Ukg · cm 2條件下，用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌 20min。培養(yǎng)條件的篩選在培養(yǎng)溫度為25士2°C，光照1500 2000LX，每日光照時(shí)間 為12h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。結(jié)果參見(jiàn)圖1。(2)將增殖獲得的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗，培養(yǎng)基用300ml的廣口 瓶分裝，每瓶30ml，封口膜包扎，在121°C和1.1kg ·αη2條件下，用高壓蒸汽滅菌鍋滅 菌20min。培養(yǎng)條件同(1)。結(jié)果參見(jiàn)圖2。(3)將組培苗的基部在IOOOppm的IBA溶液中浸泡10秒，然后接種在 1/4MS+AC200的培養(yǎng)基上，30天后生根率達(dá)89%。結(jié)果參見(jiàn)圖3_4。 (4)將已生根 的組培苗移至營(yíng)養(yǎng)杯中，杯中基質(zhì)由泥炭土 珍珠巖按一定比例配制，杯子置于具間歇 噴霧設(shè)施的溫室大棚中生根管理，溫度保持20 30°C，噴霧間歇時(shí)間10分鐘，噴霧時(shí)間 10秒，移栽成活率達(dá)93%。結(jié)果參見(jiàn)圖5。實(shí)施例2從油茶健壯植株上剪取當(dāng)年生新稍，取頂端4--6cm進(jìn)行消毒處理；將初代獲得 的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)移到WPM+BA5mg/L+IBA2mg/L+ZT2mg/L繼代培養(yǎng)，增殖周期為30天，增 殖系數(shù)達(dá)9.1 ；將增殖過(guò)程中獲得的無(wú)菌苗采用WPM+IBAO.lmg/L+生物素2mg/L進(jìn)行壯苗，25天組培苗長(zhǎng)至2-4厘米時(shí)從培養(yǎng)瓶中取出，將組培苗的基部在3000ppm的IBA 溶液中浸泡5秒，然后接種在MS+AC600的培養(yǎng)基上，25天后生根率達(dá)91%。生根后， 將組培苗移至營(yíng)養(yǎng)杯中，基質(zhì)為泥炭土 珍珠巖=2 1，移栽成活率達(dá)91%。具體操作參見(jiàn)實(shí)施例1。實(shí)施例3從油茶健壯植株上剪取當(dāng)年生新稍，取頂端4--6cm進(jìn)行消毒處理；將初代獲得 的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)移到WPM+BA5mg/L+IBA0.1mg/L+ZTlmg/L繼代培養(yǎng)，增殖周期為35天， 增殖系數(shù)達(dá)7.1 ；將增殖過(guò)程中獲得的無(wú)菌苗采用WPM+IBA2mg/L+生物素3mg/L進(jìn)行 壯苗，25天組培苗長(zhǎng)至2-3厘米時(shí)從培養(yǎng)瓶中取出，將組培苗的基部在4000ppm的IBA 溶液中浸泡5秒，然后接種在1/2MS+AC400的培養(yǎng)基上，30天后生根率達(dá)85%。生根 后，將組培苗移至營(yíng)養(yǎng)杯中，基質(zhì)為泥炭土 珍珠巖=1 1，移栽成活率達(dá)89%。具體操作參見(jiàn)實(shí)施例1。參考文獻(xiàn)[1]莊瑞林.中國(guó)油茶[M].北京中國(guó)林業(yè)出版社，1988[2]陳永忠，楊小胡，彭邵鋒.我國(guó)油茶良種選育研究現(xiàn)狀及發(fā)展策略[J].林業(yè)科 技開(kāi)發(fā).2005.19 (4) 1—4[3]黎先勝.我國(guó)油茶資源的開(kāi)發(fā)利用研究[J].湖南科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2005， 26(11) 127-129[4]柳榮祥，朱全芬.茶皂素表面活性劑及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].日用化學(xué)工業(yè)， 1996， (5) 32-35.[5]畢方鋮，譚曉風(fēng)，張智俊，等.油茶離體培養(yǎng)誘導(dǎo)再生植株的研究[J].經(jīng)濟(jì)林 研究，2004，22(2) 5-9.[6]李建安，張日清，石明旺，等.油茶兩物種花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)[J].經(jīng) 濟(jì)林研究，2003，21(3) 36-38.[7]張智俊，羅淑萍，李亞玲，等.油茶優(yōu)良無(wú)性系子葉體細(xì)胞胚植株再生[J].植 物學(xué)通，2005，22 (增刊)43 49.[8]聞麗，張日清，劉友全，等.不同培養(yǎng)條件對(duì)油茶花藥愈傷組織形成的影響 [J].經(jīng)濟(jì)林研究，2007，25(2) 9-14.
權(quán)利要求
1.油茶無(wú)性系組培苗高效生根方法，包括初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培 養(yǎng)過(guò)程，其中(1)繼代培養(yǎng)基的篩選及激素配比將獲得的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行增 殖，培養(yǎng)基為 WPM+BA3--7mg/L+IBA0.1--2mg/L+ZT0.05-2mg/L ；(2)壯苗培養(yǎng)基的篩選及激素配比對(duì)增殖過(guò)程中獲得的無(wú)菌苗進(jìn)行壯苗，采用 WPM+IBA0.1-2mg/L+生物素0.5_3mg/L進(jìn)行壯苗，待組培苗長(zhǎng)到2-4厘米后進(jìn)行生根 誘導(dǎo)；(3)生根材料的激素預(yù)處理將組培苗的基部在1000 4000ppm的IBA溶液中浸泡 5—10 秒；(4)生根培養(yǎng)基的篩選將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的組培苗接種在(l/4-l)MS+AC200-600的 培養(yǎng)基上，25-30天后，組培苗生根形成完整植株。
2.一種繼代培養(yǎng)基，其組成是 WPM+BA 3-7mg/L+IBA 0.1—2mg/L+ZT 0.05_2mg/L。
全文摘要
提供了一種通過(guò)組織培養(yǎng)快速繁殖獲得大量生根的油茶無(wú)性系完整植株的技術(shù)，包括繼代培養(yǎng)基的篩選及激素配比、壯苗培養(yǎng)基的篩選及激素配比、生根預(yù)處理、生根培養(yǎng)基的篩選及激素配比的過(guò)程。其中繼代培養(yǎng)基采用WPM+BA3-7mg/L+IBA0.1-2mg/L+ZT0.05-2mg/L進(jìn)行增殖，增殖周期縮短至30-40天，增殖系數(shù)達(dá)4.2-9.1；采用WPM+IBA0.1-2mg/L+生物素0.5-3mg/L進(jìn)行壯苗，20-25d苗木即可用于生根；將2-4厘米高的組培苗在用IBA處理后，直接接種在(1/4-1)MS+AC200-600的培養(yǎng)基上，25-30天后，組培苗生根形成完整植株，生根率達(dá)85％以上。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102007867SQ20091004428
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月7日
發(fā)明者彭邵鋒, 曾慧杰, 李永欣, 楊小胡, 王曉明, 王湘南, 王玉娟, 王瑞, 蔡能, 陳永忠, 陳隆升, 馬力 申請(qǐng)人:湖南省林業(yè)科學(xué)院