專利名稱：一種乳酸菌微膠囊的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微膠囊的制備方法。
背景技術(shù)：
目前主要采用界面聚合法、相分離法、擠壓法、雙重乳狀液法和噴霧干燥 法制備乳酸菌微膠囊。
相分離法又稱凝聚法，是將含有乳酸菌的芯材料乳化或分散在溶有壁材的 連續(xù)相中，然后將壁材溶解度降低并從連續(xù)相中分離出來，形成黏稠的液相(不 是沉淀)，包裹在芯材料上形成乳酸菌微膠囊。根據(jù)包囊材料在水中溶解度的 不同，可將相分離法分為水相相分離法和油相相分離法。但是，現(xiàn)有的相分離 法存在操作復雜，難以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，工藝難以控制，且無法獲得干燥乳 酸菌微膠囊粉末產(chǎn)品的問題。
擠壓法是最傳統(tǒng)、最普通的方法，以海藻酸鈉作為材料的固定化應用最多。
周劍忠等將乳酸菌與濃度為0.6%的海藻酸鈉溶液混合后滴到濃度為1%的 CaCl2溶液中固化；由于乳酸菌菌體分散于凝膠中，打斷了凝膠網(wǎng)絡(luò)的均勻結(jié) 構(gòu)，小分子物質(zhì)容易通過壁材，因此不能很好地阻隔胃液，不具有耐胃酸性。 劉麗英等人以海藻酸鈉(濃度為2%或3%)為壁材、CaCl2 (濃度為2%或3%) 為固化液制備微膠囊；同時部分學者將乳酸菌菌液與海藻酸鈉在固化液中固 化，并在制得的膠粒中加入聚賴氨酸或殼聚糖與海藻酸鈉絡(luò)合成膜，都可以有 效的提高乳酸菌微膠囊的耐胃酸性，但都難以獲得干燥乳酸菌微膠囊粉末產(chǎn)
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噴霧干燥法用單一工序?qū)⑷芤骸⑷橐?、懸浮液或漿狀液加工成粉狀干燥制 品，微膠囊化材料主要有液體石蠟、醋酸纖維素、檸檬油和羥基化糊精，其中 擰檬油和羥基化糊精最常見。雖然采用噴霧干燥法可以獲得干燥的乳酸菌微膠 囊粉末，但是存在乳酸菌分散不均勻及制備過程中乳酸菌死亡率高的問題。
界面聚合法是通過適宜的乳化劑形成油包水(或水包油)乳液，使水溶性 (或油溶性)反應物的水溶液(或油溶液)分散進入油相(或水相)，在油包水(或水包油)乳液中加入非水溶性(或水溶性)反應物以引發(fā)聚合，在液滴表面形成聚合物膜，這樣含水微膠囊(或含油微膠囊)就會從水相(或油相)中分離。藤原正弘等人對此進行了改進，將乳酸菌液與添加了聚甘油脂肪酸酯
的氫化油脂混合形成w/o型乳狀液，再將其分散于含增稠穩(wěn)定劑黃原膠的乳酸鈣溶液中，最終形成w/o/w型雙重乳狀液，然后將此乳狀液逐滴加到低甲
氧基果膠之類的成模液中，制成內(nèi)部流動的乳酸菌微膠囊產(chǎn)品，該方法被稱為雙重乳狀液法。由于目前的界面聚合法和雙重乳狀液法都要使用具有一定毒性
的交聯(lián)劑，會對乳酸菌的活性造成損害，所以很難得到廣泛的認可；而且雙重乳狀液形成過程中外水相與內(nèi)水相極易混溶，因此乳酸菌微膠囊的得率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決目前乳酸菌微膠囊制備方法難以獲得干燥乳酸菌微膠囊粉末，乳酸菌分散不均勻、制備過程中乳酸菌死亡率高，使用的交聯(lián)劑具有一定毒性，以及乳酸菌微膠囊的得率低的缺陷，而提供的一種乳酸菌微膠囊的制備方法。
本發(fā)明乳酸菌微膠囊按以下步驟進行制備 一、將微膠囊芯材和微膠囊壁材按照1 :2的體積比混合均勻，得到混合液，其中微膠囊芯材為加入保護劑和益生元的乳酸菌菌液，微膠囊壁材為添加了乳化劑的海藻酸鈉溶液，微膠囊壁材中海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為1.8% 2.2%，微膠囊壁材中乳化劑為Tween-20、乳化劑的質(zhì)量濃度為0.09% 0.11%; 二、將步驟一得到的混合液滴加到含有硬脂酸和乳化劑Span-80的色拉油中，并在37。C、轉(zhuǎn)速為1080 1140r/min的條件下乳化14 16min，形成初級乳狀液，其中混合液的滴加量與色拉油的體積比為1:2，色拉油中硬脂酸的質(zhì)量濃度為0.9% 1.1%，色拉油中乳化劑Span-80的質(zhì)量濃度為1.9% 2.1%;三、在攪拌轉(zhuǎn)速為180 220r/min條件下將質(zhì)量濃度為4.5% 5.5%的氯化鈣溶液加入初級乳狀液中，初級乳狀液與氯化鈣溶液的體積比為l :2，再繼續(xù)攪拌15min，然后固化lh、過濾、濾液靜置，取上層微膠囊油液；四、微膠囊油液與含有明膠的海藻酸鈉溶液按1 :2的體積比、在轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下混合乳化8.5 9.5min，形成多重乳狀液，其中海藻酸鈉溶液中海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為2%，海藻酸鈉溶液中明膠的質(zhì)量濃度為2.4% 2.6%;五、在攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min條件下將質(zhì)量濃度為5%的氯化鈣溶液加入多重乳狀液中，多重乳狀液與氯化鈣溶液的體積比為1 : 2，再繼續(xù)攪拌凝聚14 16min，然后固化lh，再用生理鹽水洗滌3 4次，之后進行真空冷凍干燥，即得到乳酸菌微膠囊；其中步驟一中保護劑由葡萄糖、蛋白胨和抗壞血酸組成，微膠囊芯材中葡萄糖的質(zhì)量濃度為5.8% 6.2%，微膠囊芯材中蛋白胨的質(zhì)量濃度為6.8% 7.2%、微膠囊芯材中抗壞血酸的質(zhì)量濃度為7.8% 8.2%;益生元為低聚果糖或大豆低聚糖。
本發(fā)明方法采用真空冷凍干燥手段可以得到干燥的乳酸菌微膠囊粉末，避免了乳酸菌分散不均勻、死亡率高的缺陷；本發(fā)明方法中不使用交聯(lián)劑，對乳酸菌沒有毒害作用；而且外水相與內(nèi)水相不易混溶；本發(fā)明方法乳酸菌微膠囊的得率高達84.6%。
本發(fā)明方法制備的乳酸菌微膠囊菌體的凍干存活率達60.107%以上。
本發(fā)明方法制備的乳酸菌微膠囊粒徑已經(jīng)達到微米級的水平，粒徑集中分布在42.00 342.00nm之間(用激光粒度分布儀對本發(fā)明制備的乳酸菌微膠囊的粒度進行測定，平均粒徑計算公式Di^2^x山^:ni式中Dn為平均粒徑，iM為微膠囊數(shù)目，c^為單個微膠囊的直徑)，外形為橢圓形，表面雖凸凹不平，但不影響乳酸菌微膠囊的各種特性。
海藻酸鈉是由海帶中提取的天然多糖碳水化合物，其中的鈉離子很容易與二價陽離子如C^ +發(fā)生置換反應，形成不溶于水的海藻酸鈣，從而將微膠囊芯材包裹于其中；而且海藻酸鈉被視為天然纖維素，可減緩脂肪糖和膽鹽的吸收，具有降低血清膽固醇、血中甘油三酯和血糖的作用，可預防高血壓、糖尿病、肥胖癥等現(xiàn)代病，海藻酸鈉在腸道中能抑制有害金屬如鍶、鎘、鉛等在體內(nèi)的積累。明膠是一種從動物結(jié)締或表皮組織中膠原部分水解出來的蛋白質(zhì)，是一種無脂肪、無膽固醇，蘊含人體所需18種氨基酸的食品和藥物原料。因為本發(fā)明所選用的微膠囊壁材都為天然無毒、無害的物質(zhì)，所以本發(fā)明制備乳酸菌微膠囊食用安全性高。


圖1是具體實施方式
七制備的乳酸菌微膠囊表面結(jié)構(gòu)圖，圖2是微膠囊壁材中海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為1%時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖3是微膠囊壁材中海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為2%時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖4是微膠囊壁材中海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為3%時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖5是色拉油中硬脂酸的質(zhì)量濃度為0.5%時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖6是色拉油中硬脂酸的質(zhì)量濃度為1.0%時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖7是色拉油中硬脂酸的質(zhì)量濃度為1.5%時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖8是色拉油中Span-80的質(zhì)量濃度為1.5%時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖9是色拉油中Span-80的質(zhì)量濃度為2%時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖10是色拉油中Span-80的質(zhì)量濃度為2.5%時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖11是微膠囊壁材中乳化劑Tween-20的質(zhì)量濃度為0.05%時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖12是微膠囊壁材中乳化劑Tween-20的質(zhì)量濃度為0.1%時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖13是微膠囊壁材中乳化劑Tween-20的質(zhì)量濃度為0.15%時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖14是微膠囊芯材與微膠囊壁材體積比為1 : 1時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖15是微膠囊芯材與微膠囊壁材體積比為1 : 2時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖16是微膠囊芯材與微膠囊壁材體積比為1 : 3時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖17是步驟二中乳化時間為10min時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖18是步驟二中乳化時間為15min時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖19是步驟二中乳化時間為20min時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖20是步驟二中乳化溫度為36'C時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖21是步驟二中乳化溫度為37"C時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖22是步驟二中乳化溫度為38'C時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖23是步驟二中乳化攪拌轉(zhuǎn)速為900r/min時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖24是步驟二中乳化攪拌轉(zhuǎn)速為1100r/min時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖25是步驟二中乳化攪拌轉(zhuǎn)速為1300r/min時初級乳狀液顯微鏡觀察圖，圖26是步驟三中氯化鈣溶液的質(zhì)量濃度為3%時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖27是步驟三中氯化鈣溶液的質(zhì)量濃度為5%時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖28是步驟三中氯化鈣溶液的質(zhì)量濃度為7%時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖29是步驟三中初級乳狀液與氯化鈣溶液的體積比為1 : 1時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖30是步驟三中初級乳狀液與氯化鈣溶液的體積比為1 :2時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖31是步驟三中初級乳狀液與氯化鈣溶液的體積比為1 : 3時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖32是步驟三中攪拌速度為Or/min時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖33是步驟三中攪拌速度為100r/min時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖34是步驟三中攪拌速度為200r/min時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖35是步驟 三中攪拌速度為300r/min時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖36是步驟三中繼續(xù) 攪拌時間為5min時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖37是步驟三中繼續(xù)攪拌時間 為10min時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖38是步驟三中繼續(xù)攪拌時間為15min 時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖39是步驟三中繼續(xù)攪拌時間為20min時微膠 囊油液顯微鏡觀察圖，圖40是步驟三中海藻酸鈉溶液中明膠的質(zhì)量濃度為 1.5%時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖41是步驟三中海藻酸鈉溶液中明膠的質(zhì) 量濃度為2.5%時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖42是步驟三中海藻酸鈉溶液中 明膠的質(zhì)量濃度為3.5%時微膠囊油液顯微鏡觀察圖，圖43是步驟四中混合乳 化時間為5min時多重乳狀液顯微鏡觀察圖，圖44是步驟四中混合乳化時間為 7min時多重乳狀液顯微鏡觀察圖，圖45是步驟四中混合乳化時間為9min時 多重乳狀液顯微鏡觀察圖，圖46是步驟四中混合乳化時間為llmin時多重乳 狀液顯微鏡觀察圖，圖47是具體實施方式
八中Z^.paraow" HD1.7內(nèi)部結(jié)構(gòu) 透射電鏡觀察圖，圖48是具體實施方式
八中制備的乳酸菌微膠囊內(nèi)部結(jié)構(gòu)透 射電鏡觀察圖，圖49是具體實施方式
七中制備的乳酸菌微膠囊的紅外光譜圖， 圖50是具體實施方式
七中制備的乳酸菌微膠囊的微膠囊芯材與微膠囊壁材混 合物的紅外光譜圖，圖51是具體實施方式
七中制備的乳酸菌微膠囊的微膠囊 芯材的紅外光譜圖。
具體實施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方 式間的任意組合。 '
具體實施方式
一本實施方式乳酸菌微膠囊按以下步驟進行制備 一、將 微膠囊芯材和微膠囊壁材按照1 : 2的體積比混合均勻，得到混合液，其中微 膠囊芯材為加入保護劑和益生元的乳酸菌菌液，微膠囊壁材為添加了乳化劑的 海藻酸鈉溶液，微膠囊壁材中海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為1.8% 2.2%，微膠囊壁 材中乳化劑為Tween-20、乳化劑的質(zhì)量濃度為0.09% 0.11°/。； 二、將步驟一 得到的混合液滴加到含有硬脂酸和乳化劑Span-80的色拉油中，并在37°C、轉(zhuǎn) 速為1080 1140r/min的條件下乳化14 16min，形成初級乳狀液，其中混合 液的滴加量與色拉油的體積比為1 : 2，色拉油中硬脂酸的質(zhì)量濃度為0.9% 1.1%，色拉油中乳化劑Span-80的質(zhì)量濃度為1.9% 2.1%;三、在攪拌轉(zhuǎn)速 為180 220r/min條件下將質(zhì)量濃度為4.5% 5.5%的氯化鈣溶液加入初級乳 狀液中，初級乳狀液與氯化鈣溶液的體積比為1 : 2，再繼續(xù)攪拌15 min，然 后固化lh、過濾、濾液靜置，取上層微膠囊油液；四、微膠囊油液與含有明 膠的海藻酸鈉溶液按1 : 2的體積比、在轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下混合乳化 8.5 9.5min，形成多重乳狀液，其中海藻酸鈉溶液中海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為 2%，海藻酸鈉溶液中明膠的質(zhì)量濃度為2.4% 2.6%;五、在攪拌轉(zhuǎn)速為 200r/min條件下將質(zhì)量濃度為5%的氯化鈣溶液加入多重乳狀液中，多重乳狀 液與氯化鈣溶液的體積比為1 : 2，再繼續(xù)攪拌凝聚14 16min，然后固化lh， 再用生理鹽水洗滌3 4次，之后進行真空冷凍干燥，即得到乳酸菌微膠囊； 其中步驟一中保護劑由葡萄糖、蛋白胨和抗壞血酸組成，微膠囊芯材中葡萄糖 的質(zhì)量濃度為5.8% 6.2%，微膠囊芯材中蛋白胨的質(zhì)量濃度為6.8% 7.2%、 微膠囊芯材中抗壞血酸的質(zhì)量濃度為7.8% 8.2%;益生元為低聚果糖或大豆 低聚糖。
本實施方式采用真空冷凍干燥技術(shù)可以得到干燥的乳酸菌微膠囊粉末，而 且具有以下優(yōu)點
(1) 真空冷凍干燥可以避免干燥過程中酶類和微生物的污染，保持乳酸 菌微膠囊原有的物理及化學性質(zhì)，保留了較高的生物活性。
(2) 乳酸菌微膠囊真空冷凍干燥前后體積基本無變化，保持了原有的乳 酸菌微膠囊結(jié)構(gòu)。
(3) 真空冷凍干燥后的乳酸菌微膠囊由于微小的冰晶體的升華而呈現(xiàn)多 孔結(jié)構(gòu)，即海綿狀，提高了復水性能。 '
(4) 由于真空冷凍干燥減少了與氧氣的接觸機會，保護了乳酸菌微膠囊 中易被氧化的物質(zhì)，增強了乳酸菌微膠囊的穩(wěn)定性。
(5) 干燥更為徹底，乳酸菌微膠囊中水分含量大幅降低。 在真空冷凍干燥過程中微生物細胞內(nèi)外形成的冰晶會對乳酸菌造成"機械
損傷"，而這種"機械損傷"會增加細胞膜透性、使蛋白質(zhì)變性失活，甚至導 致細胞代謝紊亂。本實施方式在微膠囊芯材中加入保護劑可以抑制真空冷凍干 燥時胞內(nèi)胞外冰晶的生成、減緩冰晶生長，減少真空冷凍干燥時冰晶對細胞的損傷和減少活菌的損失，還可以使真空冷凍干燥過程中乳酸菌細胞的水份不至于急劇下降，而使細胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)免遭破壞，保證了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。
因保護劑的加入，不但會縮短真空冷凍干燥的時間，而且還能使乳酸菌微膠囊中的活性物質(zhì)在真空冷凍干燥過程和保存期間維持較高的活性。由于同一種保護劑對不同的微生物所起到的保護效果是不向的，不同保護劑對同一種微
生物所起到的保護效果也是不同的；所以，針對所要保護的微生物不同而重新設(shè)計保護劑。單獨使用葡萄糖作為保護劑，乳酸菌的最高凍干存活率僅為20.02%;單獨使用蛋白胨作為保護劑，乳酸菌的最高凍干存活率僅為5.76%;單獨使用抗壞血酸作為保護劑，乳酸菌的最高凍干存活率僅為23.87%;說明單一保護劑的保護效果不理想，乳酸菌的凍干存活率太低，即使將其保護效果疊加之和也僅為49.65%，而本實施方式乳酸菌微膠囊菌體的凍干存活率經(jīng)檢測達60.107%以上，說明本實施方式保護劑中的三種組分間相互協(xié)同和促進，提高了對乳酸菌的凍干保護作用。
益生元不易消化但對機體有益，可選擇性刺磁結(jié)腸內(nèi)有益菌的生長或增強其活性，而不被有害菌所利用，能夠促進乳酸菌在腸道內(nèi)的生長。本實施方式中選用能夠被乳酸菌水解、利用的益生元，能促進乳酸菌增殖和調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系，調(diào)節(jié)礦物質(zhì)吸收，調(diào)節(jié)脂代謝并減少疾病發(fā)生率。
本實施方式方法不損傷乳酸菌，并可以有效提高乳酸菌在人體腸道中的活性。
初級乳狀液離心保留率取一定體積的初級乳狀液將其裝入離心管中，在轉(zhuǎn)速為3000r/min的條件下離心15min，離心后中間乳層的體積與初級乳狀液總體積的比值，即為初級乳狀液的離心保留率。本實施方式方法所制備的初級乳狀液離心保留率為54% 55%。 '
具體實施方式
二本實施方式乳酸菌微膠囊按以下步驟進行制備 一、將微膠囊芯材和微膠囊壁材按照1:2的體積比混合均勻，得到混合液，其中微
膠囊芯材為加入保護劑和益生元的乳酸菌菌液，微膠囊壁材為添加了乳化劑的海藻酸鈉溶液，微膠囊壁材中海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為2%，微膠囊壁材中乳化劑為Tween-20、乳化劑的質(zhì)量濃度為0.1%; 二、將步驟一得到的混合液滴加到含有硬脂酸和乳化劑Span-80的色拉油中，并在37。C、轉(zhuǎn)速為1100r/min的條件下乳化15min，形成初級乳狀液，其中混合液的滴加量與色拉油的體積比為1:2，色拉油中硬脂酸的質(zhì)量濃度為1%，色拉油中乳化劑Span-80的質(zhì)量濃度為2%;三、在攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min條件下將質(zhì)量濃度為5%的氯化鈣溶液加入初級乳狀液中，初級乳狀液與氯化鈣溶液的體積比為1:2，再繼續(xù)攪拌15 min，然后固化lh、過濾、濾液靜置，取上層微膠囊油液；四、微膠囊油液與含有明膠的海藻酸鈉溶液按1 : 2的體積比'、在轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下混合乳化9min，形成多重乳狀液，其中海藻酸鈉溶液中海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為2%，海藻酸鈉溶液中明膠的質(zhì)量濃度為2.5%;五、在攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min條件下將質(zhì)量濃度為5%的氯化鈣溶液加入多重乳狀液中，多重乳狀液與氯化鈣溶液的體積比為1 : 2，再繼續(xù)攪拌凝聚15 rnin,然后固化lh，再用生理鹽水洗滌3 4次，之后進行真空冷凍干燥，即得到乳酸菌微膠囊；其中步驟一中保護劑由葡萄糖、蛋白胨和抗壞血酸組成，微膠囊芯材中葡萄糖的質(zhì)量濃度為6%,微膠囊芯材中蛋白胨的質(zhì)量濃度為7%、微膠囊芯材中抗壞血酸的質(zhì)量濃度為8%;益生元為低聚果糖或大豆低聚糖。
初級乳狀液離心保留率取一定體積的初級學L狀液將其裝入離心管中，在轉(zhuǎn)速為3000r/min的條件下離心15min，離心后中間乳層的體積與初級乳狀液總體積的比值，即為初級乳狀液的離心保留率。本實施方式方法所制備的初級乳狀液離心保留率為54.2%。
對比試驗(除實驗參數(shù)外其它步驟及參數(shù)與本實施方式相同)
對比試驗l、微膠囊壁材中海藻酸鈉的質(zhì)量濃度
步驟一中若微膠囊壁材中海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為1%(如圖2所示)，乳狀液粒徑分布不均，個別乳滴較大，顯微鏡下可以看到已形成w/o乳狀液，但
部分乳酸菌散落在油相之外，只有部分菌進入水相(原因當?shù)蜐舛鹊暮Ｔ逅?br> 鈉溶液經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，粘度會下降，在乳化過程中，收縮應力不夠，在形成乳滴之前攪拌的剪切力很快將其拉長，不容易形成球型度較好的乳滴)。步
驟一中若微膠囊壁材中海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為2% (如圖3所示)，形成了較穩(wěn)定的w/o乳狀液，乳滴大小分布均勻，顯微鏡下可以看到大部分乳酸菌已進入水相。步驟一中若微膠囊壁材中海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為3% (如圖4所示)，形成乳滴的大小較2%的海藻酸鈉溶液所形成的乳滴尺寸有所增大，且乳滴彼此之間存在粘連現(xiàn)象(原因當海藻酸鈉溶液的濃度升高時，分子之間彼此相 互接觸，因而鏈段纏結(jié)，溶液的粘度也隨之增大，這樣在攪拌過程中產(chǎn)生了阻 力，雖然在相同的攪拌速度下進行，但由于濃度增大，使形成的乳滴直徑變大， 會出現(xiàn)上述的粘連現(xiàn)象)。
對比試驗2、步驟二色拉油中硬脂酸的質(zhì)量濃度
步驟二中若色拉油中硬脂酸的質(zhì)量濃度為0.5% (如圖5所示)，所形成的 乳狀液粒徑分布不均，而且個別乳滴相對較大，并且這些較大的乳滴在顯微鏡 下觀察時相鄰兩乳滴會融合成大乳滴，所形成的初乳不穩(wěn)定。步驟二中若色拉
油中硬脂酸的質(zhì)量濃度為1.0% (如圖6所示)，形成的乳狀液粒徑分布均勻，
顯微鏡下可看到已形成穩(wěn)定的W/0乳狀液，可見乳酸菌進入水相(原因硬 脂酸的熔點較高，水浴加熱后硬脂酸溶解于色拉油中，待降溫后，由于添加硬 脂酸的色拉油粘度提高，減少了分子之間彼此碰撞的機會，增強了乳狀液的穩(wěn)
定性)。步驟二中若色拉油中硬脂酸的質(zhì)量濃度為1.5% (如圖7所示)，隨著
濃度的增大油液的熔點增高，在常溫下硬脂酸析出，顯微鏡下可以看到硬脂酸 結(jié)塊，同時由于添加硬脂酸的色拉油在降溫后粘度提高，在攪拌過程中可能會 存在一定的阻力，乳滴的尺寸又有變大的趨勢。'
對比試驗3、步驟二色拉油中Span-80的質(zhì)量濃度
步驟二中若色拉油中Span-80的質(zhì)量濃度為1.5% (如圖8所示)，形成的 乳狀液粒徑分布不均，顯微鏡下可見形成了 OAV乳狀液，所制備的乳狀液在 室溫下較短時間內(nèi)會分層，制備的乳狀液并不穩(wěn)定(原因在乳化過程中，海 藻酸鈉溶液中添加的Tween-20與色拉油中添加的Span-80形成了復合乳化劑 體系，粒子界面上的吸附量較少，雖然形成了界面膜，但強度較低，因此乳狀 液的穩(wěn)定性較差)。步驟二中若色拉油中Span-80的質(zhì)量濃度為2% (如圖9所 示)，乳狀液的粒徑分布均勻，顯微鏡下可以看到大部分菌進入水相，形成了 穩(wěn)定的W/0乳狀液(原因由于表面活性劑的濃度增大，粒子界面上的吸附 量較多，使界面膜中的分子排列更緊密，使界面膜的強度加大)，因此形成的 初級乳狀液更穩(wěn)定。步驟二中若色拉油中Span-80的質(zhì)量濃度為2.5% (如圖 IO所示)，形成的初級乳狀液在常溫下短時間內(nèi)會分層不穩(wěn)定，不適合進行后 期的二次乳化。對比試驗4、步驟一微膠囊壁材中乳化劑Tween-20的質(zhì)量濃度
步驟一中若微膠囊壁材中乳化劑Tween-20的質(zhì)量濃度為0.05% (如圖11 所示)，若微膠囊壁材中乳化劑Tween-20的質(zhì)量濃度為0.1% (如圖12所示)， 若微膠囊壁材中乳化劑Tween-20的質(zhì)量濃度為0.15% (如圖13所示)；雖然 圖11和圖12中初級乳狀液在粒徑分布上都較均勻，且乳滴大小相差不大，但 在顯微鏡下觀察可知圖11中初級乳狀液在水相中分布的乳酸菌較少，而圖12 中初級乳狀液在水相中分布的乳酸菌較多。若微膠囊壁材中乳化劑Tween-20 的質(zhì)量濃度為0.15%，所制備的初級乳狀液不穩(wěn)定，常溫下靜置，短時間內(nèi)會 分層，在顯微鏡下觀察可知乳狀液發(fā)生了相轉(zhuǎn)變(原因Tween-20是可以溶 于水的表面活性劑，與水發(fā)生強烈的相互作用，當其被添加到乳酸菌液中后， 被乳酸菌所吸附，從而提高了乳酸菌的親水性，降低了乳酸菌的親油性。隨著 Tween-20濃度由0.05%增大到0.1%這個過程，進入水相的乳酸菌也會增多， 但當Tween-20濃度為0.15%時，部分表面活性劑分布在油水界面上，會破壞 保護膜，使形成的乳狀液不穩(wěn)定)。
對比試驗5、步驟一微膠囊芯材與微膠囊壁材體積比
步驟一中若微膠囊芯材與微膠囊壁材體積比為1 : 1 (如圖14所示)，形 成初級乳狀液的粒徑分布不均，而且乳滴偏大，顯微鏡下觀察有菌進入水相， 且形成了 W/0乳狀液。步驟一中若微膠囊芯材與微膠囊壁材體積比為1 : 2(如 圖15所示)，乳狀液的粒徑分布均勻，且所形成乳滴的大小要比1 : 1 (微膠 囊芯材與微膠囊壁材體積比)所形成的乳滴小，顯微鏡下可以看到有菌進入到 水相中，且形成了穩(wěn)定的W/O乳狀液。步驟一中若微膠囊芯材與微膠囊壁材 體積比為1 : 3 (如圖16所示)，乳狀液的粒徑分布較均勻，乳滴偏小，顯微 鏡下可見菌進入水相，且形成了 W/0乳狀液(原因當微膠囊芯材與微膠囊 壁材體積比減小時，單位體積壁材海藻酸鈉溶液中所包埋的微膠囊芯材少，當 滴加到色拉油中進行乳化時，在相同條件下攪拌，所形成的乳滴變小)。
對比試驗6、步驟二中乳化時間 '
步驟二中若乳化時間為10min (如圖17所示)，形成的乳滴較大，顯微鏡 下可以看到大部分乳酸菌沒有進入水相，乳化效果不好，初級乳狀液的離心保 留率為45.7%。步驟二中若乳化時間為15min (如圖18所示)，形成的初級乳狀液粒徑分布均勻，顯微鏡下可以看到乳酸菌進入水相，已經(jīng)形成了穩(wěn)定的
W/0乳狀液，初級乳狀液的離心保留率為54.2%。步驟二中若乳化時間為20min (如圖19所示)，形成的初級乳狀液乳滴大小與乳化時間為15min時所形成的 乳滴大小相差不大，且粒徑分布比較均勻，顯微鏡下可以看到乳酸菌進入水相， 初級乳狀液的離心保留率為47.5%。 對比試驗7、步驟二中乳化溫度
步驟二中若乳化溫度為36°C (如圖20所示)，制備的初級乳狀液離心保 留率為48.3%。步驟二中若乳化溫度為37'C (如圖21所示)，制備的初級乳狀 液離心保留率為54.2%。步驟二中若乳化溫度為38°C (如圖22所示)，制備的 初級乳狀液離心保留率為48.2%。
對比試驗8、步驟二中乳化攪拌轉(zhuǎn)速
步驟二中若乳化攪拌轉(zhuǎn)速為900r/min (如圖23所示)，乳狀液粒徑分布不 均，所形成的乳滴過大，且乳滴分散性不好，顯微鏡下可見形成了 W/O乳狀 液，初級乳狀液的離心保留率為55%。步驟二中若乳化攪拌轉(zhuǎn)速為1100r/min (如圖24所示)，乳狀液的粒徑分布均勻，乳滴變小，且乳滴分散性好；顯微 鏡下可以看到形成了較穩(wěn)定的w/o乳狀液，部分乳酸菌已經(jīng)進入水相，初級 乳狀液的離心保留率為54.2%。步驟二中若乳化攪拌轉(zhuǎn)速為1300r/min (如圖 25所示)，乳狀液粒徑分布較均勻，部分乳滴較小，顯微鏡下可以看到乳酸菌 進入水相，初級乳狀液的離心保留率為44%。當攪拌速度低時由于剪切力小， 使乳滴不能很好的分散開，形成的乳滴過大；當攪拌速度高時因為有足夠的剪 切力，使乳滴能夠較好的分散開，乳狀液的粒徑分布均勻；但當攪拌速度超過 最佳攪拌速度時，剪切力會對乳酸菌菌體細胞造成損傷，降低了乳酸菌的活性， 同時過高的攪拌速度帶來的剪切力又會導致破乳，影響到初級乳狀液的穩(wěn)定 性。當攪拌速度為900r/min時乳狀液離心保留率雖然最大，但由于所形成的 乳滴過大，且分散性不好，會直接影響到后期二次乳化及微膠囊的制備；而當 攪拌速度為1300r/min時過高的剪切力又會對乳酸菌菌體細胞造成損傷。因此， 本實施方式參數(shù)設(shè)計最為合理。 ' 對比試驗9、步驟三中氯化鈣溶液的質(zhì)量濃度
海藻酸鈉與(^2+能發(fā)生置換反應，生成不可逆凝膠。步驟三中若氯化鈣溶液的質(zhì)量濃度為3% (如圖26所示)，凝聚反應不夠完全，形成的凝膠顆粒較 小(原因由于溶液中可與海藻酸鈉發(fā)生置換反應的C^+少，所以形成的凝膠 顆粒結(jié)構(gòu)疏松、強度差，不利于后期的二次乳化與再次包埋)。步驟三中若氯 化鈣溶液的質(zhì)量濃度為5% (如圖27所示)、若氯化鈣溶液的質(zhì)量濃度為7% (如圖28所示)，凝膠顆粒粒徑分布均勻，且在這兩個濃度下所形成的凝膠顆 粒大小相差不大，幾乎大小保持恒定(原因當氯化鈣的濃度增加時，由于溶 液中可與海藻酸鈉發(fā)生置換反應的Ca"多，所形成的凝膠顆粒結(jié)構(gòu)致密，但當 氯化鈣的濃度達到一定值后，由于氯化鈣達到飽和，使凝膠顆粒粒徑恒定)。 但氯化鈣的濃度過高會影響乳酸菌的滲透壓，降低乳酸菌的生物活性。 對比試驗10、步驟三中初級乳狀液與氯化鈣溶液的體積比 步驟三中若初級乳狀液與氯化鈣溶液的體積比為1 : 1 (如圖29所示)， 發(fā)生了單凝聚反應，顯微鏡下可以看到，所形成的凝膠顆粒較少，且有個別乳 滴沒有被凝聚。步驟三中若初級乳狀液與氯化鈣溶液的體積比為1 : 2 (如圖 30所示)，凝聚完全，而且所形成的凝膠顆粒粒徑分布均勻，顯微鏡下可以看 到，所形成的凝膠顆粒較多，乳狀液幾乎被完全凝聚。步驟三中若初級乳狀液 與氯化鈣溶液的體積比為1 : 3 (如圖31所示)，由于氯化鈣的體積過大，顯 微鏡下可以看到，有氯化鈣硬塊。
對比試驗ll、步驟三中攪拌速度
步驟三中若攪拌速度為Or/min (如圖32所示')，凝聚效果不好，所滴加的 氯化鈣與初級乳狀液不能混合均勻，海藻酸鈉與氯化鈣接觸的面積小，在沒有 攪拌的情況下，海藻酸鈉遇到Ca"很快發(fā)生置換反應，海藻酸鈉溶液有部分變 成海藻酸鈣沉淀下來，從而被浪費掉，降低了微膠囊的產(chǎn)率，顯微鏡下觀察到 的依然是未被凝聚的乳狀液。步驟三中若攪拌速度為100r/min(如圖33所示)， 部分已經(jīng)被凝聚形成初級微膠囊，部分沒有被凝聚。步驟三中若攪拌速度為 200r/min (如圖34所示)，加速了凝聚成囊的過程，乳狀液己被完全凝聚，凝 膠顆粒粒徑分布均勻。步驟三中若攪拌速度為300r/min (如圖35所示)，雖然 凝膠顆粒粒徑分布較均勻，但顆粒直徑有變小的趨勢，主要是因為轉(zhuǎn)速過快導 致了顆粒變??；同時，攪拌速度過快所產(chǎn)生的剪切力過大，會對乳酸菌菌體造 成一定的損傷，影響乳酸菌的活性。由于在測包囊效率采用的是活菌計數(shù)，因此過大的攪拌速度會降低微膠囊的包囊效率。
對比試驗12、步驟三中繼續(xù)攪拌時間 '
步驟三中繼續(xù)攪拌時間為5min (如圖36所示)，步驟三中繼續(xù)攪拌時間為10min (如圖37所示)，步驟三中繼續(xù)攪拌時間為15min (如圖38所示)，步驟三中繼續(xù)攪拌時間為20min (如圖39所示)。顯微鏡下觀察凝聚從5 min開始到15min這一過程，所形成的凝膠顆粒量有所增加。說明隨著時間的延長，海藻酸鈉不斷被氯化鈣凝聚，時間越長，凝聚越完全，所形成的凝膠顆粒越多。在同一攪拌速度下，時間越長，攪拌越均勻，海藻酸鈉與氯化鈣的接觸面積越大，所形成的凝膠顆粒粒徑越均勻，提高了微膠囊的質(zhì)量與產(chǎn)量。繼續(xù)攪拌時間也不宜過長，否則會影響凝膠顆粒的質(zhì)量。
對比試驗13、步驟三中海藻酸鈉溶液中明膠的質(zhì)量濃度
明膠不僅可以與海藻酸鈉混合用做制備微膠囊的壁材，同時明膠也是一種很好的乳化劑。步驟三中若海藻酸鈉溶液中明膠的質(zhì)量濃度為1.5% (如圖40所示)，二次乳化效果不好，所形成的多重乳狀液粒徑分布不均，多重乳狀液滴較大，最終制得的微膠囊的包囊效率為30.7%。步驟三中若海藻酸鈉溶液中明膠的質(zhì)量濃度為2.5% (如圖41所示)，二次乳化效果好，所形成的多重乳狀液粒徑分布較均勻，顯微鏡下可以看到已經(jīng)形成了較穩(wěn)定的W/O/W多重乳狀液，最終制得的微膠囊的包囊效率為84.6%。步驟三中若海藻酸鈉溶液中明膠的質(zhì)量濃度為3.5% (如圖42所示)，乳化效果不好，形成的多重乳狀液滴彼此之間粘連在一起，影響到后期再次凝聚的效果和微膠囊的粒徑大小，最終制得的微膠囊的包囊效率為42.2%。隨著明膠濃度的增大，含有明膠的海藻酸鈉溶液粘度增大，過濾所得的微膠囊油液不能很好的分散其中，影響到最終的乳化效果。
對比試驗14、步驟四中混合乳化時間
步驟四中若混合乳化時間為5min (如圖43所示)，多重乳狀液滴彼此之間分散效果不好，而且多重乳狀液滴大小分布不均，最終制得的乳酸菌微膠囊的包囊效率為65.1%。步驟四中若混合乳化時間為7min (如圖44所示)，多重乳狀液滴大小分布不均，乳化效果不好，最終制得的乳酸菌微膠囊的包囊效率為38.4%。步驟四中若混合乳化時間為9min (如圖45所示)，乳化效果較好，多重乳狀液滴大小分布較均勻，最終制得的乳酸菌微膠囊的包囊效率為
84.6%。步驟四中若混合乳化時間為llmin (如圖46所示)，雖然乳狀液的乳滴分散性較好，但大小不均勻。乳化時間太短，微膠囊油液與含有明膠的海藻酸鈉溶液混合攪拌不夠充分，達不到較好的乳化效果；但隨著時間的延長，微膠囊油液與含有明膠的海藻酸鈉溶液能夠充分接觸，接觸面積變大，加速了乳化作用的過程，能夠獲得較好的乳化效果，但乳化時間也不宜過長。說明本實施方式參數(shù)設(shè)計最為合理。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二的不同點是步驟一中的乳酸菌菌液是濃度為0.46xl09cfU/mL的"./ aracase/HD1.7菌液。其它步驟及參數(shù)與實施方式一或二相同。
本實施方式副干酪乳桿菌HD1.7 a^./^racas" HD1.7)已經(jīng)在中國典型培養(yǎng)物保藏中心進行保藏，保藏編號為CCTCCM205015，并且在中國發(fā)明專利"肽類天然微生物防腐劑產(chǎn)生菌及應用和防腐劑的制備方法"(
發(fā)明者欣 何, 單毓鈺, 孫慶申, 平文祥, 張廣臣, 董曉霞, 虹 雷 申請人:黑龍江大學