生物分子分析試劑盒及生物分子分析方法
【專利摘要】本發(fā)明的生物分子分析試劑盒如下構(gòu)成，其具有用于進(jìn)行酶反應(yīng)的反應(yīng)容器，所述反應(yīng)容器包含具有容器形狀部的基體部和設(shè)置在所述容器形狀部的至少內(nèi)表面的低吸附結(jié)構(gòu)部，所述低吸附結(jié)構(gòu)部與所述酶反應(yīng)中的作為分析對象的試樣和用于所述酶反應(yīng)的試劑中的至少一個的吸附率比所述基體部的吸附率低；在所述反應(yīng)容器內(nèi)進(jìn)行酶反應(yīng)時，對由所述酶反應(yīng)產(chǎn)生的信號進(jìn)行檢測。
【專利說明】
生物分子分析試劑盒及生物分子分析方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物分子分析試劑盒及生物分子分析方法。
[0002]本申請基于2014年I月31日于日本申請的日本特愿2014-017942號主張優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容援引于此。
【背景技術(shù)】
[0003]已知通過對生物分子進(jìn)行分析來進(jìn)行疾病或健康狀態(tài)診斷(體質(zhì)診斷)。例如，有利用單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism:SNP)分析進(jìn)行的健康狀態(tài)診斷、利用體細(xì)胞突變分析進(jìn)行的抗癌藥給藥判斷、利用病毒的蛋白或DNA的分析進(jìn)行的感染病對策等。
[0004]近來，通過世界性人類基因組分析已經(jīng)弄清楚了約31億個堿基對的序列，弄清楚了人的基因數(shù)約為3?4萬個。人類在個體間存在堿基序列的差異，將特定群體人口的以1%以上的頻率存在的堿基序列的差異稱作基因多型。其中啟示，SNP與多種疾病具有關(guān)聯(lián)性。
[0005]例如，關(guān)于人的遺傳疾病認(rèn)為，一個基因中的SNP是導(dǎo)致生病的原因。另外認(rèn)為，多個基因中的SNP對生活習(xí)慣病或者癌癥等也有影響。因此認(rèn)為，SNP的分析在藥物靶點的探索或副作用的預(yù)見等藥品開發(fā)中是極為有效的。因而，SNP的分析作為世界性的巨大項目正在推進(jìn)。
[0006]作為藥物效果或副作用程度方面存在個體差異的原因之一，可舉出與每個人的藥物代謝有關(guān)的酶群的差異。最近逐漸弄清楚了，該差異是由SNP等基因上的微小差異所導(dǎo)致的。
[0007]近年來考慮通過預(yù)先對患者的基因進(jìn)行分析以選擇最適合的藥劑來向患者給藥的方法。此外，不僅限于單基因遺傳病、對于多因子疾病而言，基因診斷的意義也急速增加。另外，以病原菌或病毒為靶的藥物的效果有時是同種，有時每個個體不同，這多是由每個個體的基因的微細(xì)差異所導(dǎo)致的?？梢灶A(yù)料，今后這樣的作為外來因子的病原菌或病毒的基因診斷作為檢查對象也會確實地增加。
[0008]如此，在后基因組時代的醫(yī)療中，重要的是能夠?qū)θ嘶虿≡⑸锏幕虻奈⑿〔町悺⑻貏e是SNP進(jìn)行分析，可以預(yù)料今后其重要性也會增加。
[0009]一直以來研究了各種對堿基序列的微小差異、特別是SNP進(jìn)行分析的方法(參照非專利文獻(xiàn)I?2)。為了進(jìn)行實用水平上的分析，要求在低成本、方法的簡便性、信號檢測時間的長短、檢測結(jié)果的正確性等方面均優(yōu)異。但是，到目前為止還未知有滿足上述所有要求的方法。
[0010]對SNP進(jìn)行分析時，一般情況是目標(biāo)基因片段在試樣中僅微量地含有。此時，需要通過任何方法預(yù)先對目標(biāo)基因進(jìn)行擴增。PCR(Polymerase Chain React1n，聚合酶鏈反應(yīng))法作為迅速且重現(xiàn)性高的基因擴增法一直以來被大家所熟知。
[0011]—般來說，為了檢測目標(biāo)基因一個堿基的差異，需要以下兩階段的工序:使用了PCR法等的基因擴增階段;和研究所擴增的基因的一個堿基的差異的階段(參照非專利文獻(xiàn)3)。但是，需要兩階段工序的方法由于工序多，因此處理變得繁雜。此外，PCR法由于需要進(jìn)行溫度升降，因此需要在裝置大型化、耐熱性的反應(yīng)容器和反應(yīng)液不蒸發(fā)方面下功夫。
[0012]作為不需要二階段反應(yīng)的SNP檢測方法，有侵入物法。侵入物法不需要PCR的擴增，由于可以等溫地促進(jìn)反應(yīng)，因此裝置可以小型化。但是，在侵入物法中，由于不包括基因的擴增工序，因此信號擴增慢、為了進(jìn)行檢測判定需要數(shù)小時的反應(yīng)時間。侵入物法是使用了酶反應(yīng)的檢測方法。其中，在使用了酶的信號擴增中，作為縮短信號濃度達(dá)到飽和的時間的方法，考慮在微小空間內(nèi)使其反應(yīng)的方法。
[0013]在微小空間內(nèi)進(jìn)行侵入反應(yīng)時，由于I個孔內(nèi)含有的分析對象分子可以達(dá)到I個以下、分析對象分子處于表觀上被濃縮的狀態(tài)，因此可以縮短信號達(dá)到飽和的時間。另外，由于使進(jìn)入I個孔內(nèi)的檢測分子為I個以下，因此通過計數(shù)獲得信號的孔，可以準(zhǔn)確地研究檢測分子的濃度。
[0014]例如，專利文獻(xiàn)I顯示了通過在具有Ipl以下容積的微小空間內(nèi)進(jìn)行酶反應(yīng)，能夠進(jìn)tx基因檢測。
[0015]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0016]專利文獻(xiàn)
[0017]專利文獻(xiàn)1:日本特開2004-309405號公報
[0018]非專利文南犬1:Landegren、Laboratory protocols for mutat1n detect1n、Oxford university press、1996年
[0019]非專利文獻(xiàn)2:Ahmadian等、B1techniques、第32卷、第1122?1137頁、2002年
[0020]非專利文獻(xiàn)3:JB1chem B1phys Method、第70卷、第50、2007年、789?795頁

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021]發(fā)明所要解決的課題
[0022]S卩，在SNP分析中當(dāng)利用PCR時能夠在短時間內(nèi)進(jìn)行檢測，但機器構(gòu)成變得復(fù)雜、步驟變得繁雜。另外，在未利用PCR的等溫反應(yīng)中，至SNP分析結(jié)束所需要的時間長、反應(yīng)性低。因此，這些現(xiàn)有的方法并不實用。
[0023]本發(fā)明是鑒于上述問題而完成的，其目的在于提供能夠進(jìn)行迅速且定量的生物分子的分析且能夠提高反應(yīng)性的生物分子分析試劑盒及生物分子分析方法。
[0024]用于解決課題的手段
[0025]本發(fā)明第一方式的生物分子分析試劑盒為如下構(gòu)成:其具有用于進(jìn)行酶反應(yīng)的反應(yīng)容器，所述反應(yīng)容器包含具有容器形狀部的基體部和設(shè)置在所述容器形狀部的至少內(nèi)表面的低吸附結(jié)構(gòu)部，所述低吸附結(jié)構(gòu)部與所述酶反應(yīng)中的作為分析對象的試樣和用于所述酶反應(yīng)的試劑中的至少一個的吸附率比所述基體部的吸附率低;在所述反應(yīng)容器內(nèi)進(jìn)行酶反應(yīng)時，對由所述酶反應(yīng)產(chǎn)生的信號進(jìn)行檢測。
[0026]所述低吸附結(jié)構(gòu)部與所述試樣的吸附率比所述基體部低，與所述基體部露出至所述反應(yīng)容器內(nèi)的情況相比，所述信號檢測時的背景可以更低。
[0027]所述低吸附結(jié)構(gòu)部與所述試樣的吸附率比所述基體部低，與所述基體部露出至所述反應(yīng)容器內(nèi)的情況相比，所述信號檢測時的信號強度可以更高。
[0028]為了使所述吸附率比所述基體部低，所述反應(yīng)容器可以在所述容器形狀部的內(nèi)表面進(jìn)一步具有所述基體部的表面經(jīng)改性的改性部，所述容器形狀部可以是具有直徑為5微米以下的大致圓形的開口部的有底圓柱形狀。
[0029]為了使所述吸附率比所述基體部低，所述反應(yīng)容器可以在所述容器形狀部的內(nèi)表面進(jìn)一步具有層疊于所述基體部上的低吸附物質(zhì)層，所述容器形狀部可以是具有直徑為5微米以下的大致圓形的開口部的有底圓柱形狀。
[0030]本發(fā)明第二方式的生物分子分析試劑盒為如下構(gòu)成:其具有用于進(jìn)行酶反應(yīng)的反應(yīng)容器和能夠供給至所述反應(yīng)容器且在所述酶反應(yīng)中使用的試劑，所述反應(yīng)容器具有能夠供給作為分析對象的試樣的容器形狀部及形成有所述容器形狀部的基體部;所述試劑含有用于降低所述試樣和所述試劑中的至少一個對所述基體部的吸附率的防吸附劑，在所述反應(yīng)容器內(nèi)進(jìn)行所述酶反應(yīng)時，檢測由所述酶反應(yīng)產(chǎn)生的信號。
[0031]所述酶反應(yīng)可以是等溫反應(yīng)。
[0032]作為分析對象的所述試樣可以含有DNA、RNA、miRNA、mRNA、蛋白中的任一種，分析對象物質(zhì)可以是DNA、RNA、miRNA、mRNA、蛋白中的任一種。
[0033]分析對象物質(zhì)可以是核酸、所述酶反應(yīng)可以是侵入反應(yīng)。
[0034]所述試劑可以通過焚光、發(fā)光、pH、吸光、電位中的任一種產(chǎn)生信號。
[0035]所述防吸附劑可以是表面活性劑。
[0036]所述表面活性劑可以是非離子性表面活性劑。
[0037]所述非離子性表面活性劑可以是Tween 20。
[0038]所述非離子性表面活性劑可以是Triton-100。
[0039]所述表面活性劑的濃度可以是0.0005%以上且5%以下。
[0040]本發(fā)明第三方式的生物分子分析方法使用上述第一方式或第二方式的生物分子分析試劑盒。
[0041]本發(fā)明第四方式的生物分子分析試劑盒為如下構(gòu)成:其具有用于進(jìn)行酶反應(yīng)的反應(yīng)容器和能夠供給至所述反應(yīng)容器且在所述酶反應(yīng)中使用的試劑，所述反應(yīng)容器具有能夠通過流路供給試樣的容器形狀部和形成有所述容器形狀部的基體部;所述試劑含有用于降低所述試劑的表面張力的表面活性劑，在所述反應(yīng)容器內(nèi)進(jìn)行酶反應(yīng)時，對由所述酶反應(yīng)產(chǎn)生的熒光或發(fā)色信號進(jìn)行檢測。
[0042]本發(fā)明第五方式的生物分子分析方法具有下述工序:在具有流路及多個容器形狀部的反應(yīng)容器中，將試劑送液至所述流路，將所述試劑填充到所述多個孔中，將油性密封液送液至所述流路，利用所述油性密封液將所述多個孔內(nèi)的所述試劑密封，從而使所述多個孔形成為多個獨立的核酸檢測反應(yīng)容器;其中，所述試劑及所述油性密封液中的任一個含有表面活性劑。
[0043]本發(fā)明第五方式的生物分子分析方法還可以在將所述試劑填充于所述多個孔之前，進(jìn)一步具有通過所述流路將洗滌用的緩沖液填充到所述多個容器形狀部的工序。
[0044]本發(fā)明第六方式的生物分子分析方法是使用了上述第一方式、第二方式或第四方式的生物分子分析試劑盒的生物分子分析方法，其中，在將洗滌用的緩沖液供給至所述容器形狀部之后，將所述試劑供給至所述容器形狀部。
[0045]發(fā)明效果
[0046]根據(jù)本發(fā)明的上述方式，可提供能夠進(jìn)行迅速且定量的生物分子的分析且能夠提高反應(yīng)性的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒。
【附圖說明】
[0047]圖1為應(yīng)用本發(fā)明第一實施方式的生物分子分析方法的生物分子分析試劑盒的截面圖。
[0048]圖2為本發(fā)明第一實施方式的生物分子分析方法的流程圖。
[0049]圖3為表示本發(fā)明第一實施例的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0050]圖4為表示本發(fā)明第一實施例的熒光強度測定試驗的結(jié)果的圖。
[0051]圖5為表示本發(fā)明第一實施例的反應(yīng)時間測定試驗的結(jié)果的表。
[0052]圖6為應(yīng)用本發(fā)明第二實施方式的生物分子分析方法的生物分子分析試劑盒的截面圖。
[0053]圖7為應(yīng)用本發(fā)明第二實施方式的生物分子分析方法的生物分子分析試劑盒的截面圖。
[0054]圖8為應(yīng)用本發(fā)明第二實施方式的生物分子分析方法的生物分子分析試劑盒的截面圖。
[0055]圖9為表示本發(fā)明第二實施方式的生物分子分析方法的流程圖。
[0056]圖10為表示本發(fā)明第二實施例的孔的顯微鏡照片。
[0057]圖1lA為表示本發(fā)明第二實施例中、在Tween20的濃度為0%、加熱時間為10分鐘的條件下的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0058]圖1lB為表示本發(fā)明第二實施例中、在Tween20的濃度為0.0005%、加熱時間為10分鐘的條件下的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0059]圖1lC為表示本發(fā)明第二實施例中、在Tween20的濃度為0.001 %、加熱時間為10分鐘的條件下的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0060]圖1lD為表示本發(fā)明第二實施例中、在Tween20的濃度為0.005%、加熱時間為10分鐘的條件下的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0061 ]圖1IE為表示本發(fā)明第二實施例中、在Tween 20的濃度為0.05%、加熱時間為10分鐘的條件下的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0062]圖1lF為表示本發(fā)明第二實施例中、在Tween20的濃度為0.5%、加熱時間為10分鐘的條件下的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0063]圖1lG為表示本發(fā)明第二實施例中、在Tween20的濃度為5%、加熱時間為10分鐘的條件下的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0064]圖1lH為表示本發(fā)明第二實施例中、在Tween20的濃度為0.0005%、加熱時間為20分鐘的條件下的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0065]圖1lI為表示本發(fā)明第二實施例中、在Tween20的濃度為0.001 %、加熱時間為20分鐘的條件下的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0066]圖1lJ為表示本發(fā)明第二實施例中、在Tween20的濃度為0.005%、加熱時間為20分鐘的條件下的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0067]圖1IK為表示本發(fā)明第二實施例中、在Tween20的濃度為0.05%、加熱時間為20分鐘的條件下的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0068]圖1lL為表示本發(fā)明第二實施例中、在Tween20的濃度為0.5%、加熱時間為20分鐘的條件下的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0069]圖1lM為表示本發(fā)明第二實施例中、在Tween20的濃度為5%、加熱時間為20分鐘的條件下的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0070]圖12為表示本發(fā)明第二實施例的熒光強度測定試驗的結(jié)果的圖。
[0071]圖13為用于說明本發(fā)明第二實施方式的生物分子分析方法的作用效果的圖。
[0072]圖14A為表示本發(fā)明第三實施例的樣品I的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0073]圖14B為表示本發(fā)明第三實施例的樣品2的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0074]圖14C為表示本發(fā)明第三實施例的樣品3的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0075]圖14D為表示本發(fā)明第三實施例的樣品4的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0076]圖14E為表示本發(fā)明第三實施例的樣品5的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
[0077]圖14F為表示本發(fā)明第三實施例的樣品6的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。
【具體實施方式】
[0078](第一實施方式)
[0079]以下一邊參照圖1及圖2—邊說明本發(fā)明第一實施方式的生物分子分析試劑盒及生物分子分析方法。
[0080]圖1為能夠應(yīng)用本實施方式的生物分子分析方法的生物分子分析試劑盒的截面圖。本實施方式的生物分子分析試劑盒中，作為進(jìn)行分析的生物分子，選擇DNA、RNA、miRNA、mRNA(以下有時稱作RNA類)、蛋白中的任一種。
[0081]如圖1所示，生物分子分析試劑盒100具備構(gòu)成反應(yīng)容器10的軟性平板12及玻璃基板14、和能夠?qū)⒎磻?yīng)容器10密封的蓋玻片13。
[0082]反應(yīng)容器10具有:成形為具有一端開口的有底圓柱形狀微小空間11(容器形狀部)的基體部2、和配置于基體部2表面的低吸附結(jié)構(gòu)部3。
[0083]通過對聚二甲基娃氧燒(？0]\^(口017(1;[11161:11718；[1(?3116))制的軟性平板12進(jìn)行壓印，制作微小空間11，從而形成反應(yīng)容器10。
[0084]構(gòu)成反應(yīng)容器10的微小空間11是一端具有開口部的有底圓柱形狀的空間。微小空間11例如具有5μπι的直徑LI及5μπι的深度L2。例如，微小空間11的容量為約100飛升(f I)。反應(yīng)容器10中形成有多個微小空間11的陣列。即，微小空間11在反應(yīng)容器10中整列地配置。
[0085]例如，微小空間11在軟性平板12中，相對于具有縱橫為5mm長方形的表面、排列成沿著其各邊的格子狀。各微小空間11之間的間隙大小在各微小空間11中根據(jù)能夠獨立地進(jìn)行信號檢測的分解能力來設(shè)定。
[0086]微小空間11的容積可以適當(dāng)?shù)卦O(shè)定，但微小空間11的容積小時能夠縮短至信號能夠檢測的反應(yīng)時間。作為一例，微小空間11的容積為100皮升(pi)或更低。
[0087]具體而言，當(dāng)為了縮短使信號飽和、產(chǎn)生足夠的信號所需的時間時，根據(jù)分析對象分子在I個孔中為I個以下的液量設(shè)定微小空間11的容積。
[0088]軟性平板12例如形成在玻璃基板14上。玻璃基板14的厚度考慮到以軟性平板12為材料、在通過壓印形成多個微小空間11的過程中具有充的分強度的問題來適當(dāng)設(shè)定。
[0089]本實施方式中，低吸附結(jié)構(gòu)部3例如具有以下的構(gòu)成。
[0090](構(gòu)成例I)
[0091]低吸附結(jié)構(gòu)部3在基體部2的表面中位于反應(yīng)容器10的微小空間11內(nèi)表面的區(qū)域具有疏水性。例如，低吸附結(jié)構(gòu)部3具有通過按照基體部2的表面變?yōu)槭杷远M(jìn)行改性所形成的改性部4。
[0092](構(gòu)成例2)
[0093]低吸附結(jié)構(gòu)部3在基體部2的表面中在位于反應(yīng)容器10內(nèi)表面的區(qū)域具有低吸附物質(zhì)層4A。低吸附物質(zhì)層4A由成為使用了本實施方式的生物分子分析試劑盒100的分析對象的試樣或其分析試劑的吸附率低的材料形成。例如，低吸附物質(zhì)層4A為疏水性覆膜。
[0094]另外，作為低吸附物質(zhì)層4A的另一例子，可舉出具有熒光物質(zhì)不能透過的分子結(jié)構(gòu)的高分子覆膜。該高分子覆膜優(yōu)選具有與上述TOMS相比更為致密的分子結(jié)構(gòu)，通過抑制熒光物質(zhì)的透過而發(fā)揮防止信號強度降低的效果。另外，對于除PDMS以外，可以根據(jù)成為基體部2的材料的物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)來選擇具有能夠防止試劑透過的分子結(jié)構(gòu)的高分子覆膜。這些高分子覆膜可抑制信號強度的降低。
[0095]另外，低吸附結(jié)構(gòu)部3的高分子覆膜不限于抑制熒光物質(zhì)透過的覆膜，還可以根據(jù)所使用的試劑適當(dāng)選擇抑制與酶反應(yīng)有關(guān)的物質(zhì)透過的覆膜。
[0096]接著，說明能夠優(yōu)選應(yīng)用于本實施方式的生物分子分析試劑盒100的試劑的組成。
[0097]本實施方式中，通過在各試劑中含有防吸附劑，可以防止試劑的構(gòu)成成分吸附于生物分子分析試劑盒100的反應(yīng)容器10內(nèi)表面。
[0098]防吸附劑的組成例如是含有表面活性劑、磷酸脂質(zhì)、其他高分子化合物中的至少I種的組成，還可以混合使用任意的材料。若進(jìn)行舉例，作為表面活性劑，可舉出非離子性表面活性劑。作為非離子性表面活性劑，可舉出Tween或glycerol、Triton-X100等。另外，作為高分子化合物，可舉出PolyethyIeneglycol(聚乙二醇，PEG)、DNA、蛋白。
[0099]另外，作為混合了2種以上材料的防吸附劑，例如可舉出混合了磷酸脂質(zhì)和PEG的防吸附劑。
[0100]作為表面活性劑使用非離子性表面活性劑時，優(yōu)選試劑所含的非離子性表面活性劑的濃度為5%以下。使用Tween 20時，試劑所含的Tween 20的濃度優(yōu)選為0.0005%以上且5%以下的范圍、特別優(yōu)選為0.001 %以上且0.5%以下的范圍。Tween 20的濃度為0.0005%以上時，可以獨立地對多個微小空間11中的反應(yīng)進(jìn)行檢測，可以準(zhǔn)確地測量微小空間11的熒光。TWeen20的濃度為5 %以下時，可獲得充分的酶反應(yīng)。
[0101]這些防吸附劑即使是吸附到反應(yīng)容器10的微小空間11內(nèi)表面的物質(zhì)也可以。通過將含有防吸附劑的試劑供給至反應(yīng)容器10內(nèi)，使防吸附劑吸附于反應(yīng)容器10的內(nèi)表面。其結(jié)果，反應(yīng)容器10的內(nèi)表面與不含防吸附劑的情況相比，成為酶反應(yīng)中使用的酶、作為分析對象的核酸或蛋白以及信號檢測中利用的標(biāo)記物質(zhì)等不易吸附的狀態(tài)。
[0102]另外，當(dāng)在微小空間11中加入油時，還可以在油中加入上述防吸附劑。
[0103]在從最開始將酶反應(yīng)中使用的酶、作為分析對象的核酸或蛋白以及信號檢測中利用的標(biāo)記物質(zhì)等中的至少I個供給至反應(yīng)容器10內(nèi)部之前到信號檢測結(jié)束的期間，優(yōu)選與反應(yīng)容器10內(nèi)部接觸的試劑中的至少任一個含有防吸附劑。例如，防吸附劑可以混合在用于將試劑稀釋至規(guī)定濃度的緩沖液等溶劑中。
[0104]在從最開始將酶反應(yīng)中使用的酶、作為分析對象的核酸或蛋白以及信號檢測中利用的標(biāo)記物質(zhì)等中的至少I個供給至反應(yīng)容器10內(nèi)部之前到信號檢測結(jié)束的期間，與反應(yīng)容器10內(nèi)部接觸的全部試劑可以含有吸附劑。
[0105]另外，防吸附劑優(yōu)選是不阻礙酶反應(yīng)或信號擴增反應(yīng)的物質(zhì)。
[0106]接著，對使用了本實施方式的生物分子分析試劑盒100的生物分子分析方法進(jìn)行說明。圖2為表示本實施方式的生物分子分析方法的流程圖。
[0107]首先，向反應(yīng)容器10的微小空間11滴加含有作為分析對象的物質(zhì)(本實施方式中例如為DNA)的試劑(圖2所示的步驟S101)。具體而言，在本實施方式中滴加的試劑含有侵入反應(yīng)試劑(IyM Allele Probe、0.4yM Invader 01igo、lyM FAM Labelling Armn2OmM MOPSpH為7.5、15mM NaCl、6.25mM MgCl2、50U/yL Cleacase)及DNA0
[0108]滴加至反應(yīng)容器10的微小空間11的試劑的液量可以根據(jù)微小空間11的數(shù)量適當(dāng)設(shè)定。另外，滴加至反應(yīng)容器10的微小空間11的試劑的液量及其濃度按照在I個微小空間11內(nèi)加入I個DNA的方式進(jìn)行調(diào)整。例如，本實施方式中，滴加至反應(yīng)容器1的微小空間11中的試劑的液量總計為0.5yL，將0.5yL的液體分配到多個微小空間11中。
[0109 ]接著，用蓋玻片13覆蓋反應(yīng)容器1的微小空間11 (圖2所示的步驟S102)。由此，各微小空間11成為密封有侵入反應(yīng)試劑及DNA的獨立的反應(yīng)室。
[0110]接著，微小空間11內(nèi)密封有侵入反應(yīng)試劑及DNA的反應(yīng)容器10例如用62°C的烘箱進(jìn)行孵育(圖2所示的步驟S103)。通過該孵育，侵入反應(yīng)中等溫下進(jìn)行的信號擴增適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行。
[0111]接著，各微小空間11內(nèi)密封有侵入反應(yīng)試劑及DNA的反應(yīng)容器10在經(jīng)過預(yù)先設(shè)定的時間后取出，測量具有熒光的孔數(shù)及其熒光量(圖2所示的步驟S104)。
[0112]需要說明的是，本實施方式中，除了熒光的檢測以外，還可以應(yīng)用以可見光的發(fā)光、發(fā)色、PH的變化、電位變化等為信號進(jìn)行檢測的檢測體系。另外，還可將本實施方式的構(gòu)成應(yīng)用于分析蛋白。
[0113](第二實施方式)
[0114]以下一邊參照圖6—邊說明本發(fā)明第二實施方式的生物分子分析試劑盒及生物分子分析方法。本實施方式的生物分子分析試劑盒10A含有核酸定量用陣列器件20、試劑和油性密封液。
[0115]圖6為本實施方式的核酸定量用陣列器件20的截面圖。本實施方式的生物分子分析試劑盒中，作為進(jìn)行分析的生物分子，選擇DNA、RNA、miRNA、mRNA(以下有時稱作RNA類)及蛋白中的任一種。
[0116]如圖6所示，核酸定量用陣列器件20具備反應(yīng)容器30、蓋部27、注入口部(未圖示)和排出口部(未圖示)。反應(yīng)容器30具有基體部23和流路31?；w部23上形成有多個孔(容器形狀部)26、基板24和微小孔陣列層25。
[0117]微小孔陣列可以直接形成在基板24上，也可利用粘接、熔融粘合等手段將形成有微小孔陣列的構(gòu)件固定設(shè)置在基板24上。
[0118]基板24是由實質(zhì)上透明的材料構(gòu)成的板狀構(gòu)件?；?4的材質(zhì)例如為樹脂或玻璃。具體而言，基板24可以由聚苯乙烯或聚丙烯形成?；?4只要是搬送核酸定量用陣列器件20的裝置或者具有在操作者手動操作處理時不會破損的程度的剛性即可。
[0119]微小孔陣列層25是多個貫通孔25a排列形成的層。微小孔陣列層25的層厚為3μπι、在微小孔陣列層25與蓋部27之間空有ΙΟΟμπι的間隔。貫通孔25a是一端具有開口部的有底圓柱形狀的空間。貫通孔25a是直徑為5μπι、中心線方向的長度為3μπι的圓柱形狀。例如，貫通孔25a的容積為約60飛升(f I)。
[0120]各貫通孔25a的容積可以適當(dāng)設(shè)定，但貫通孔25a的容積小時，能夠縮短至信號能夠檢測的反應(yīng)時間。
[0121]作為一例，各貫通孔25a的容積為100皮升或其以下。
[0122]另外，本實施方式中，除了檢測熒光之外，還可以應(yīng)用以可見光的發(fā)光、發(fā)色、pH的變化、電位變化等為信號進(jìn)行檢測的檢測體系。另外，還可以將本實施方式的構(gòu)成應(yīng)用于分析蛋白。
[0123]各貫通孔25a之間的中心線間的距離(間距)只要比各貫通孔25a的直徑大即可。
[0124]各貫通孔25a的間隔(間隙)的大小在各貫通孔25a中獨立地根據(jù)能夠進(jìn)行信號檢測的分解能力來設(shè)定。
[0125]各貫通孔25a相對于微小孔陣列層25呈三角格子狀進(jìn)行排列。
[0126]其中，各貫通孔25a的排列方式并無特別限定。通過形成于微小孔陣列層25的貫通孔25a和基板24的表面24a，在基體部23上形成以基板24為底面部26a的有底筒狀的微小的孔26 (容器形狀部)。
[0127]具體而言，當(dāng)為了縮短使信號飽和而產(chǎn)生充分的信號所花費的時間時，根據(jù)達(dá)到分析對象分子在I個孔中為I個以下的液量，設(shè)定孔26的容積。
[0128]微小孔陣列層25的材質(zhì)可以是樹脂或玻璃等。微小孔陣列層25的材質(zhì)可以與基板24的材質(zhì)相同，也可與基板24的材質(zhì)不同。另外，微小孔陣列層25還可以利用與基板24相同的材料進(jìn)行一體化。另外，微小孔陣列層25還可以利用與基板24相同的材料進(jìn)行一體成型。作為由樹脂構(gòu)成的微小孔陣列層25的材質(zhì)的例子，可舉出環(huán)烯烴聚合物或有機硅、聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚醋酸乙烯酯、氟樹脂、無定形氟樹脂等。另外，作為微小孔陣列層25的例子顯示的這些材質(zhì)僅僅是例子，微小孔陣列層25的材質(zhì)并不限定于這些。
[0129]另外，微小孔陣列層25還可以被著色。若對微小孔陣列層25進(jìn)行著色，則當(dāng)在孔26內(nèi)進(jìn)行熒光、發(fā)光、吸光度等光的測定時，來自與作為測定對象的孔26相鄰的其他孔26的光的影響得以減小。
[0130]微小孔陣列層25通過對層疊在基板24上的疏水性膜的整面圖案進(jìn)行蝕刻、壓花形成或切削等加工而形成貫通孔25a。另外，當(dāng)微小孔陣列層25與基板24—體成型時，通過對基板24實施蝕刻、壓花形成或切削等加工，形成與微小孔陣列層25的貫通孔25a相當(dāng)?shù)牟糠?。由此，可以在基板上形成具有疏水部及親水部的圖案。
[0131]蓋部27與基體部23之間具有間隙并按照將多個孔26的開口部分覆蓋的方式重疊在基體部23上?；w部23與蓋部27之間成為各種液體流過的流路31。本實施方式中，各種液體從注入口部向排出口部從基體部23與蓋部27之間流過。
[0132]接著，對可適宜應(yīng)用于本實施方式的生物分子分析試劑盒100A的試劑的組成進(jìn)行說明。
[0133]如圖7及圖8所示，檢測反應(yīng)試劑21是能夠從注入口部送液至基體部23與蓋部27之間的溶液。檢測反應(yīng)試劑21是用于針對分析對象物質(zhì)進(jìn)行酶反應(yīng)等生化反應(yīng)的試劑。
[0134]針對分析對象物質(zhì)的生化反應(yīng)例如在DNA(核酸)為分析對象物質(zhì)時，在核酸存在的條件下發(fā)生信號擴增等的反應(yīng)。檢測反應(yīng)試劑21例如根據(jù)能夠檢測核酸的方法進(jìn)行選擇。例如，在Invader(注冊商標(biāo))法、LAMP法(注冊商標(biāo))、TaqMan(注冊商標(biāo))法或熒光探針法或者其他方法中使用的試劑包含在本實施方式的檢測反應(yīng)試劑21中。
[0135]本實施方式中，當(dāng)分析對象物質(zhì)為核酸時，可以不進(jìn)行如以往那樣的PCR法中的核酸擴增工序地進(jìn)行檢測，也可根據(jù)需要將使用PCR法等對分析對象核酸進(jìn)行擴增而得到的產(chǎn)物作為樣品使用。
[0136]另外，當(dāng)分析對象物質(zhì)為核酸以外時，為了能夠應(yīng)用于本實施方式，也可在進(jìn)行必要的前處理后應(yīng)用本實施方式。
[0137]本實施方式中，通過在各試劑的至少I個中含有防吸附劑，可以防止試劑的構(gòu)成成分吸附在生物分子分析試劑盒100A的孔26的內(nèi)表面。也可以是各試劑全部含有防吸附劑。
[0138]作為試劑的例子，可舉出緩沖液、檢測反應(yīng)試劑、樣品(分析對象物:DNA、RNA類、蛋白等)溶液、密封液、試劑或樣品的稀釋用溶劑。
[0139]防吸附劑的組成例如是含有表面活性劑、磷酸脂質(zhì)、其他高分子化合物中的至少I種的組成，可以與任意的材料混合使用。若進(jìn)行舉例，作為表面活性劑，可舉出非離子性表面活性劑。作為非離子性表面活性劑，可舉出Tween或glycerol、Triton-X100等。另外，作為高分子化合物，可舉出PolyethyIeneglycol(乙二醇，PEG)或DNA、蛋白。
[0140]另外，作為混合有2種以上材料的防吸附劑，例如可舉出混合有磷酸脂質(zhì)和PEG的防吸附劑。
[0141]作為表面活性劑使用非離子性表面活性劑時，試劑中所含的非離子性表面活性劑的濃度優(yōu)選為5%以下。使用Tween 20時，試劑中所含的Tween20的濃度優(yōu)選為0.0005%以上且5 %以下的范圍、特別優(yōu)選為0.001 %以上且0.5 %以下的范圍。當(dāng)Tween 20的濃度為0.0005 %以上時，可以獨立地檢測多個孔26中的反應(yīng)，可以準(zhǔn)確地測量孔26的熒光。Tween20的濃度為5%以下時，可獲得充分的酶反應(yīng)。
[0142]表面活性劑并不限定于非離子性。作為表面活性劑，可以使用離子性表面活性劑(陰離子、陽離子、兩性離子)。可以使用離子性表面活性劑之間的混合物、或者離子性表面活性劑與非離子性表面活性劑的混合物。
[0143]另外，也可使用表面活性劑與高分子化合物的混合物作為防吸附劑。
[0144]接著，對可適宜應(yīng)用于本實施方式的生物分子分析試劑盒100A的油性密封液22的組成進(jìn)行說明。
[0145]本實施方式中，為了防止試劑的構(gòu)成成分吸附在生物分子分析試劑盒100A的孔26的內(nèi)表面，油性密封液22中也可含有防吸附劑。
[0146]油性密封液22 (參照圖8)是能夠自注入口部送液至基體部2 3與蓋部2 7之間的溶液。油性密封液22可以選自不與含有分析對象物質(zhì)的試樣相混合的材料。作為油性密封液22，可以使用礦物油或氟系液體的FC40等。
[0147]另外，本實施方式中，為了防止試劑的構(gòu)成成分吸附在生物分子分析試劑盒100A的孔26的內(nèi)表面，還可在對試劑進(jìn)行送液之前，對孔洗滌用的緩沖液進(jìn)行送液。緩沖液中可含有防吸附劑。
[0148]這些防吸附劑即使是吸附在反應(yīng)容器30的孔26的內(nèi)表面的物質(zhì)也沒有關(guān)系。通過將含有防吸附劑的試劑供給至反應(yīng)容器30內(nèi)，使防吸附劑吸附在反應(yīng)容器30的內(nèi)表面。其結(jié)果，與不含防吸附劑的情況相比，反應(yīng)容器30的內(nèi)表面成為不易吸附酶反應(yīng)中使用的酶、作為分析對象的核酸或蛋白及信號檢測中利用的標(biāo)記物質(zhì)等的狀態(tài)。
[0149]洗滌用的緩沖液中含有的防吸附劑可以是非離子性表面活性劑。作為非離子性表面活性劑，可舉出Tween或glycerol、Triton-XlOO等。另外，洗滌用的緩沖液還可以構(gòu)成試劑的一部分。
[0150]在從最開始將酶反應(yīng)中使用的酶、作為分析對象的核酸或蛋白以及信號檢測中利用的標(biāo)記物質(zhì)等中的至少I個供給至反應(yīng)容器30的內(nèi)部之前到信號檢測結(jié)束的期間，優(yōu)選與反應(yīng)容器30內(nèi)部接觸的試劑中的至少I個含有防吸附劑。例如，防吸附劑可以混合在用于將試劑稀釋至規(guī)定濃度的緩沖液等的溶劑中。
[0151]另外，在從最開始將酶反應(yīng)中使用的酶、作為分析對象的核酸或蛋白以及信號檢測中利用的標(biāo)記物質(zhì)等中的至少I個供給至反應(yīng)容器10的內(nèi)部之前到信號檢測結(jié)束的期間，與反應(yīng)容器1內(nèi)部接觸的全部試劑中還可以含有吸附劑。
[0152]另外，防吸附劑優(yōu)選是不阻礙酶反應(yīng)或信號擴增反應(yīng)的物質(zhì)。
[0153]接著，對使用了本實施方式的生物分子分析試劑盒100A的生物分子分析方法進(jìn)行說明。圖9為表示本實施方式的生物分子分析方法的流程圖。
[0154]首先，開放未圖示的注入口部及排出口部，利用例如分注移液管等將含有防吸附劑的洗滌用緩沖液33通過注入口部送液至基體部23與蓋部27之間的間隙中(圖9所示的步驟S201)。緩沖液33按照將多個孔26全部覆蓋的方式在基體部23與蓋部27之間的間隙內(nèi)擴散(參照圖6)。由此，在基體部23的表面中位于貫通孔25a內(nèi)表面的區(qū)域、及位于相鄰孔之間的區(qū)域34中形成具有低吸附物質(zhì)層35的低吸附結(jié)構(gòu)部32。
[0155]也可以不對緩沖液33進(jìn)行送液，而是在反應(yīng)容器30中預(yù)先充滿緩沖液33。此時，還可以利用膜等將注入口部、排出口部密封，預(yù)先將緩沖液33密封在反應(yīng)容器30中。
[0156]接著，利用例如分注移液管等將含有作為分析對象的物質(zhì)(本實施方式中例如為DNA)的試劑通過注入口部送液至基體部23與蓋部27之間的間隙中(圖9所示的步驟S202)。具體而言，本實施方式中所填充的試劑含有侵入反應(yīng)試劑(檢測反應(yīng)試劑21) (ΙμΜ AlleleProbe、lyM Invader 01igo、lyM FAM Labelling Armn1mM MOPS pH為7.5、6.25mM MgCl2n50U/yL Cleacase,Tween 20)及作為分析對象物質(zhì)的DNA。試劑按照將多個孔26全部覆蓋的方式在基體部23與蓋部27之間的間隙內(nèi)擴散(參照圖7)。另外，通過將試劑送液至基體部23與蓋部27之間的間隙中，將緩沖液33從排出口部排出。另外，此時當(dāng)試劑與緩沖液33為不同顏色時，可以容易地把握是否將試劑送液至了基體部23與蓋部27之間的部分。
[0157]如圖6所示，在由基體部23和蓋部27形成的流路31中配置由基板24和微小孔陣列層25形成的多個孔26。充滿于多個孔26內(nèi)的緩沖液33通過使試劑流入，依次地在孔內(nèi)從緩沖液33替換成試劑。
[0158]但是，將緩沖液33以保持在孔26內(nèi)表面的狀態(tài)維持的孔26也是存在的。此時，試劑不與充滿于多個孔26內(nèi)的緩沖液33相替換，而是成為試劑疊層于緩沖液33的狀態(tài)。但是，由于緩沖液33與試劑相互間易于混合，因此在成為試劑疊層于緩沖液33的狀態(tài)后，試劑中的溶質(zhì)向緩沖液33擴散。因此，在緩沖液和試劑相替換的孔中的反應(yīng)與緩沖液33和試劑相疊層的孔中的反應(yīng)實質(zhì)上是相同的。
[0159]填充于孔26中的液量可根據(jù)貫通孔25a的數(shù)量適當(dāng)設(shè)定。另外，滴加入孔26中的液量及其濃度按照I個孔26中含有I個DNA的方式進(jìn)行調(diào)整。例如，本實施方式中，填充于孔26的液量在反應(yīng)容器整體中為0.5yL，將0.5yL的液體分配到多個孔26中。
[0160]接著，如圖8所示，自注入口部將油性密封液22送液至由基體部23和蓋部27形成的流路31內(nèi)。油性密封液22通過以試劑擴散至緩沖液的狀態(tài)將多個孔26內(nèi)的液體密封，使多個孔26成為多個獨立的反應(yīng)室(核酸檢測反應(yīng)容器)36。即，本實施方式中，通過油性密封劑22將各孔26覆蓋，與第一實施方式中公開的微小空間同樣，成為各孔26獨立的狀態(tài)。另外，油性密封液22在基體部23與蓋部27之間的間隙內(nèi)將處于多個孔26外部的液體自排出口部擠出(圖9所示的步驟S203)。
[0161]進(jìn)而，將各孔26中填充有侵入反應(yīng)試劑及DNA的陣列器件20例如在62°C的烘箱中孵育(圖9所示的步驟S204)。通過該孵育，侵入反應(yīng)中在等溫下進(jìn)行的信號擴增適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行。
[0162]接著，將各孔中填充有侵入反應(yīng)試劑及DNA的陣列器件20在預(yù)先規(guī)定的時間之后取出，測量具有熒光的孔數(shù)及其熒光量(圖9所示的步驟S205)。
[0163]S卩，使用了本實施方式的生物分子分析試劑盒100A的生物分子分析方法具有以下工序:在具有流路及多個容器形狀部的反應(yīng)容器中，將試劑送液到流路中，向多個孔中填充試劑的工序(試劑送液工序);在試劑送液工序之后，將油性密封液送液至流路，利用油性密封液將多個孔內(nèi)的試劑密封，從而制成使多個孔為多個獨立的核酸檢測反應(yīng)容器的工序(密封工序)。
[0164]另外，本實施方式中，除了檢測熒光之外，還可以應(yīng)用將可見光的發(fā)光、發(fā)色、pH的變化、電位變化等作為信號進(jìn)行檢測的檢測體系。另外，還可將本實施方式的構(gòu)成應(yīng)用于分析蛋白。。
[0165]另外，本實施方式中，通過在各試劑中含有防吸附劑，可以防止試劑的構(gòu)成成分吸附到生物分子分析試劑盒100A的反應(yīng)容器30的內(nèi)表面。防吸附劑可以含有在全部試劑中，也可含有在試劑的一部分中。
[0166]另外，還可代替這樣的防吸附劑，試劑中含有用于降低試劑構(gòu)成成分的表面張力的物質(zhì)。例如，表面活性劑會降低試劑的表面張力。因此，為了將試劑填充到各孔中，在試劑中含有表面活性劑也是有效的。
[0167]實施例
[0168](第一實施例)
[0169]接著，對用于確認(rèn)本發(fā)明第一實施方式的生物分子分析方法的作用效果的實施例進(jìn)行說明。圖3為表示本實施例的熒光量測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。圖4為表示本實施例的熒光強度測定試驗的結(jié)果的圖。其中，圖4的橫軸表示反應(yīng)時間、圖4的縱軸表示熒光強度。圖5為表示本實施例的反應(yīng)時間測定試驗的結(jié)果的表。其中，圖5中，“良”表示定量性良好、“差”表示就定量性而言比本實施例差。
[0170]<發(fā)出熒光的孔數(shù)的測量試驗>
[0171]首先，在反應(yīng)容器10的微小空間11內(nèi)封入侵入反應(yīng)試劑，同時封入3種人工合成DNA。這里，將各人工合成DNA的濃度設(shè)定為I個孔加有I分子的為30pM、I個孔中加有1666分子的為50nM、l個孔中連I分子也沒有的是0M。
[0172]然后，將反應(yīng)容器10在62°C的烘箱中分別進(jìn)行孵育，確認(rèn)O分鐘、10分鐘、15分鐘后的狀態(tài)。
[0173]如圖3所示，若DNA濃度為30pM以上，則相對于為OM時的背景、在幾乎所有的微小空間11內(nèi)熒光量均產(chǎn)生差異，可知存在DNA。
[0174]<熒光強度的測量試驗>
[0175]接著，將密封有上述設(shè)定的人工合成DNA的反應(yīng)容器10在62°C的烘箱中孵育，為了確認(rèn)O分鐘、1分鐘、15分鐘后的狀態(tài)，每個DNA濃度選擇5孔的圖像，求出各圖像中21像素的熒光量的平均值。這里，反應(yīng)后的孔使用熒光顯微鏡(Zeiss公司、AX10)、物鏡(EC Plan-Neofluar 40Xoil NAl.3)、光源(LEJ公司、FluoArcOO 1.26A Usable with HBO 10)、傳感器(Hamamatsu Photonics公司、EM-CCD C9100)、濾光鏡(奧林巴斯公司、U-MNIBA2)及分析軟件(Hamamatsu Photonics公司、AQUAC0SM0S 2.6:曝光時間為64.3ms、EM增益為 180、偏移為O、像素組合為X I)進(jìn)行測量。
[0176]如圖4所示，在作為I個微小空間11內(nèi)收納有I個分子的濃度即30pM下，與OM時相比，檢測到能夠區(qū)分強度的熒光。
[0177]<反應(yīng)時間測定試驗>
[0178]接著，比較現(xiàn)有分析方法和本發(fā)明分析方法中的反應(yīng)時間。在反應(yīng)時間的測定試驗中，作為與本發(fā)明的比較對象，采用以I納升(nl) X多孔的試劑量進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)的方法(比較例1)、以20微升(μ?)的試劑量進(jìn)行PCR反應(yīng)的方法(比較例2)、以20μ1的試劑量進(jìn)行PCR+侵入反應(yīng)的方法(比較例3)、以20μ1的試劑量進(jìn)行侵入反應(yīng)的方法(比較例4)、以及以100飛升(fl)X多孔的試劑量進(jìn)行數(shù)字ELI SA反應(yīng)的方法(比較例5)。
[0179]如圖5所示，由反應(yīng)時間的測定試驗可知，在以InlX多孔的試劑量進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)的比較例I中，需要60分鐘的反應(yīng)時間，溫控為變溫，定量性良好。在以20μ1的試劑量進(jìn)行PCR反應(yīng)的比較例2中，需要60分鐘的反應(yīng)時間，溫控為變溫，定量性不良。在以20μ1的試劑量進(jìn)行PCR+侵入反應(yīng)的比較例3中，需要60分鐘的反應(yīng)時間，溫控為變溫，定量性不良。
[0180]在以20μ1的試劑量進(jìn)行侵入反應(yīng)的比較例4中，需要120分鐘的反應(yīng)時間，溫控雖然為等溫，但定量性不良。在以10fl X多孔的試劑量進(jìn)行數(shù)字ELISA反應(yīng)的比較例5中，需要15分鐘的反應(yīng)時間，溫控為等溫，定量性良好。
[0181 ]與它們相對，以10fl X多孔的試劑量進(jìn)行數(shù)字侵入反應(yīng)的本實施例中，僅為10分鐘的反應(yīng)時間，溫控為等溫、定量性良好。由此可知，這是由于本實施例以10fl X多孔的試劑量進(jìn)行了數(shù)字侵入反應(yīng)。
[0182](第二實施例)
[0183]接著，對用于確認(rèn)本發(fā)明第二實施方式的生物分子分析方法的作用效果的實施例進(jìn)行說明。圖1O為表不本實施例的孔的9?光圖像圖。圖11A?圖1IM為表不本實施例的9?光強度測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。圖12為表示本實施例的熒光強度測定試驗的結(jié)果的表。其中，圖12中的橫軸表示Tween 20的濃度、圖12的縱軸表示熒光強度。
[0184]<核酸定量用陣列器件的制作>
[0185]在0.5mm厚的玻璃制基板上旋涂CYTOP(注冊商標(biāo))(旭硝子制)之后，在180°C下烘焙I小時。所形成的CYTOP的厚度為3μπι。利用旋涂將CYTOP涂覆到基板上之后，涂覆正性光刻膠，使用光掩模形成圖案。之后，通過O2等離子體對CYTOP進(jìn)行干式蝕刻。為了將殘留于表面的光刻膠除去，用丙酮和乙醇對表面進(jìn)行洗滌、沖淋。
[0186]如圖1O所示，由CYTOP形成的孔(微小空間)的直徑為5μπι、具有能夠在數(shù)分鐘內(nèi)檢測通過侵入反應(yīng)產(chǎn)生的信號的體積。在I個基體部上設(shè)有100塊的孔陣列。另外，各個塊具有10000個孔。因此，形成共計100萬個孔。如圖6所示，使用具有50μπι厚度且加工成流路形狀的雙面膠將具有送液口(注入口部:未圖示)的玻璃制板與基體部粘接。
[0187]<試樣與檢測反應(yīng)試劑的混合液的送液>
[0188]確認(rèn)由表面活性劑即Tween 20的濃度帶來的液滴形成的容易度。
[0189]首先，將含有表面活性劑的洗滌緩沖液通過送液口送液至核酸定量用陣列器件中。之后，通過送液口將侵入反應(yīng)試劑(檢測反應(yīng)試劑21: ΙμΜ Allele ProbeUyM Invader01igo、lyM FAM Labelling Arm、1mM MOPS pH為7.5、6.25mM MgCl2、50UAiL Cleacase、Tween 20)22μ1及作為分析對象物質(zhì)的DNA送液至核酸定量用陣列器件。
[0190]之后，通過送液口送液氟系液體FC40(油性密封液22)80μ1，將試劑分別封入各孔內(nèi)。將其在63 °C的加熱板上加熱，實施侵入反應(yīng)。
[0191]接著，使用熒光顯微鏡(奧林巴斯制)檢測63°C下經(jīng)過10分鐘、20分鐘時的各孔的熒光。曝光時間為明視野:100毫秒、NIBA: 2000毫秒、mCherry: 2000毫秒。
[0192]將利用顯微鏡觀察加熱10分鐘后的各孔的結(jié)果示于圖1lA?圖1lG中。將利用顯微鏡觀察加熱20分鐘后的各孔的結(jié)果示于圖1IH?圖11M。
[0193]當(dāng)Tween20的濃度為0%時，由于即使在位于相鄰孔之間的區(qū)域內(nèi)也檢測到熒光，因此無法準(zhǔn)確地進(jìn)行數(shù)字測量。作為其理由，考慮由于相鄰孔的反應(yīng)溶液的液滴之間相結(jié)合，因此在位于相鄰孔之間的區(qū)域內(nèi)試樣發(fā)生了反應(yīng)。另外，雖然相鄰孔的反應(yīng)溶液的液滴之間未結(jié)合，但考慮殘留于位于相鄰孔之間的基體部表面的試樣發(fā)生了反應(yīng)。另一方面，若Tween 20含有0.0005%以上，則確認(rèn)到反應(yīng)溶液的液滴各個分離。
[0194]另外，在加熱20分鐘后的孔中，若Tween20含有0.001 %以上，則確認(rèn)到反應(yīng)溶液的液滴各個分離。即，長時間加熱時，若Tween 20含有0.001 %以上，則認(rèn)為與短時間加熱時相比、重現(xiàn)性進(jìn)一步提尚。
[0195]圖12為表示對應(yīng)于Tween20的濃度的熒光強度值的圖。隨著Tween 20的濃度提高、熒光強度減弱。即，隨著Tween 20的濃度增加，確認(rèn)到阻礙了反應(yīng)的行為。因此推測Tween 20的最佳濃度為5%左右。另外，從成本的觀點出發(fā)，更優(yōu)選Tween 20的濃度為0.5%以下。
[0196]另外，將同樣的試劑10μ1分注到96孔板中，使用LightCycler LC480(Roche制)檢測10μ1體積時的反應(yīng)性。LightCycler的溫控條件為63 °C、恒定。利用LightCycler在同樣的組成時確認(rèn)了反應(yīng)，結(jié)果與Tween 20的濃度無關(guān)，侵入反應(yīng)的熒光信號增加是一定的。由此可知，表面活性劑并不是用于提高酶的反應(yīng)性、而是有助于液滴的穩(wěn)定性。
[0197]表面活性劑只要添加能夠防止試劑所含的檢測對象物質(zhì)吸附在CYTOP或玻璃等的濃度即可。為Triron-XlOO等其他的表面活性劑時，最佳的濃度也可不同，但可以考慮Tween20的例子。
[0198](第三實施例)
[0199]接著，對用于確認(rèn)本發(fā)明第二實施方式的生物分子分析方法的作用效果的其他實施例進(jìn)行說明。圖13為用于說明本發(fā)明第二實施方式的生物分子分析方法的作用效果的圖。圖14A?圖14F為表示本實施例的熒光強度測定試驗的結(jié)果的熒光圖像圖。圖13中，反應(yīng)性欄的“良”表示反應(yīng)性良好。圖13中，液滴欄的“?”表示相鄰2個孔之間未觀察到熒光。圖13中，液滴欄的“Λ”是指相鄰2個孔之間觀察到了熒光，但是對濃度測定沒有影響的程度。圖13中，液滴欄的“X”表示由于在相鄰2個孔之間觀察到熒光，存在使用相鄰2個孔之間的區(qū)域時無法準(zhǔn)確地進(jìn)行數(shù)字測量的情況。
[0200]本實施例中使用第二實施例中使用的侵入反應(yīng)試劑及DNA，如圖13所示，對于有無洗滌、洗滌用緩沖液中的有無表面活性劑的添加、反應(yīng)試劑中有無表面活性劑的添加來改變條件，進(jìn)行反應(yīng)，由所得熒光圖像確認(rèn)液滴的狀態(tài)及反應(yīng)性。作為表面活性劑，將0.05%的Tween 20添加到洗滌用緩沖液或反應(yīng)試劑中。對于其他條件，與第二實施例是同樣的。
[0201]對于樣品I及樣品2，在洗滌用的緩沖液中添加表面活性劑進(jìn)行洗滌。對于樣品3及樣品4，在洗滌用的緩沖液中未添加表面活性劑的情況下進(jìn)行洗滌。對于樣品5及6，未進(jìn)行洗滌。此外，在樣品1、3及5的反應(yīng)試劑中添加了表面活性劑。另一方面，在樣品2、4、及6的反應(yīng)試劑中未添加表面活性劑。在任何樣品中，反應(yīng)性均良好。此外，如樣品2所示可知，即使在反應(yīng)試劑中不含有表面活性劑的情況下，當(dāng)洗滌用的緩沖液中含有表面活性劑時，液滴良好地形成、反應(yīng)性也良好。
[0202]如上文說明過的那樣，根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒100及第二實施方式的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒100A，通過在微小空間11或孔26內(nèi)進(jìn)行酶反應(yīng)，可以進(jìn)行迅速且定量的生物分子的分析。
[0203]另外，根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒100及第二實施方式的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒100A，通過作為酶反應(yīng)使用侵入物法，不需要進(jìn)行PCR擴增，等溫反應(yīng)變得可能，因此可以簡化機器構(gòu)成及分析步驟。
[0204]另外，根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒100及第二實施方式的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒100A，由于在收納有I分子分析對象大小的微小空間11內(nèi)或孔26內(nèi)使其反應(yīng)，因此可以縮短信號達(dá)到飽和所需要的時間。
[0205]另外，根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒100及第二實施方式的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒100A，與以往相比，反應(yīng)時間更短、SN比更高。
[0206]另外，根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒100及第二實施方式的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒100A，由于酶反應(yīng)是等溫反應(yīng)，因此與變溫反應(yīng)相比，可以獲得穩(wěn)定的酶反應(yīng)、重現(xiàn)性更高。
[0207]另外，根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒100及第二實施方式的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒100A，由于酶反應(yīng)是侵入反應(yīng)，因此與需要PCR的步驟相比，可以縮短用于進(jìn)行信號的檢測判定的時間。
[0208]另外，根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒100及第二實施方式的生物分子分析方法及生物分子分析試劑盒100A，由于微小空間11或孔26是100皮升以下，因此為了分析可以減少所消耗的試劑的量。
[0209]另外，上述實施方式中公開了將低吸附結(jié)構(gòu)部和防吸附劑并用的例子。但是，只要采用低吸附結(jié)構(gòu)部和防吸附劑中的至少任一者，則與未采用低吸附結(jié)構(gòu)部和防吸附劑中的任一者的情況相比，可以進(jìn)行迅速且定量的分析。
[0210]符號說明
[0211]100、100A生物分子分析試劑盒
[0212]2、23基體部
[0213]3、32低吸附結(jié)構(gòu)部
[0214]4改性部
[0215]4A、35低吸附物質(zhì)層
[0216]10,30反應(yīng)容器
[0217]11微小空間(容器形狀部)
[0218]12軟性平板
[0219]13蓋玻片
[0220]14玻璃基板[0221 ] 22油性密封液
[0222]24基板
[0223]26孔(容器形狀部)
[0224]31流路
[0225]33緩沖液
【主權(quán)項】
1.一種生物分子分析試劑盒，其為如下構(gòu)成: 其具有用于進(jìn)行酶反應(yīng)的反應(yīng)容器， 所述反應(yīng)容器包含具有容器形狀部的基體部和設(shè)置在所述容器形狀部的至少內(nèi)表面的低吸附結(jié)構(gòu)部，所述低吸附結(jié)構(gòu)部與所述酶反應(yīng)中的作為分析對象的試樣和用于所述酶反應(yīng)的試劑中的至少一個的吸附率比所述基體部的吸附率低； 在所述反應(yīng)容器內(nèi)進(jìn)行酶反應(yīng)時，對由所述酶反應(yīng)產(chǎn)生的信號進(jìn)行檢測。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物分子分析試劑盒，其中，所述低吸附結(jié)構(gòu)部與所述試樣的吸附率比所述基體部低，與所述基體部露出至所述反應(yīng)容器內(nèi)的情況相比，所述信號檢測時的背景更低。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物分子分析試劑盒，其中，所述低吸附結(jié)構(gòu)部與所述試樣的吸附率比所述基體部低，與所述基體部露出至所述反應(yīng)容器內(nèi)的情況相比，所述信號檢測時的信號強度更高。4.根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項所述的生物分子分析試劑盒，其中， 為了使所述吸附率比所述基體部低，所述反應(yīng)容器在所述容器形狀部的內(nèi)表面進(jìn)一步具有所述基體部的表面經(jīng)改性的改性部， 所述容器形狀部是具有直徑為5微米以下的大致圓形的開口部的有底圓柱形狀。5.根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項所述的生物分子分析試劑盒，其中， 為了使所述吸附率比所述基體部低，所述反應(yīng)容器在所述容器形狀部的內(nèi)表面進(jìn)一步具有層疊于所述基體部的低吸附物質(zhì)層， 所述容器形狀部是具有直徑為5微米以下的大致圓形的開口部的有底圓柱形狀。6.一種生物分子分析試劑盒，其為如下構(gòu)成: 其具有用于進(jìn)行酶反應(yīng)的反應(yīng)容器和能夠供給至所述反應(yīng)容器并在所述酶反應(yīng)中使用的試劑， 所述反應(yīng)容器具有能夠供給作為分析對象的試樣的容器形狀部及形成有所述容器形狀部的基體部； 所述試劑含有用于降低所述試樣和所述試劑中的至少一個對所述基體部的吸附率的防吸附劑， 在所述反應(yīng)容器內(nèi)進(jìn)行所述酶反應(yīng)時，檢測由所述酶反應(yīng)產(chǎn)生的信號。7.根據(jù)權(quán)利要求1?6中任一項所述的生物分子分析試劑盒，其中，所述酶反應(yīng)是等溫反應(yīng)。8.根據(jù)權(quán)利要求1?7中任一項所述的生物分子分析試劑盒，其中，作為分析對象的所述試樣含有DNA、RNA、miRNA、mRNA、蛋白中的任一種，分析對象物質(zhì)是DNA、RNA、miRNA、mRNA、蛋白中的任一種。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物分子分析試劑盒，其中，分析對象物質(zhì)是核酸、所述酶反應(yīng)是侵入反應(yīng)。10.根據(jù)權(quán)利要求1?9中任一項所述的生物分子分析試劑盒，其中，所述試劑通過熒光、發(fā)光、pH、吸光、電位中的任一種產(chǎn)生信號。11.一種生物分子分析方法，其使用了權(quán)利要求1?10中任一項所述的生物分子分析試劑盒。12.—種生物分子分析試劑盒，其為如下構(gòu)成: 其具有用于進(jìn)行酶反應(yīng)的反應(yīng)容器和能夠供給至所述反應(yīng)容器并在所述酶反應(yīng)中使用的試劑， 所述反應(yīng)容器具有能夠通過流路供給試樣的容器形狀部和形成有所述容器形狀部的基體部； 所述試劑含有用于降低所述試劑的表面張力的表面活性劑， 在所述反應(yīng)容器內(nèi)進(jìn)行酶反應(yīng)時，對由所述酶反應(yīng)產(chǎn)生的熒光或發(fā)色信號進(jìn)行檢測。13.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物分子分析試劑盒，其中，所述防吸附劑是表面活性劑。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的生物分子分析試劑盒，其中，所述表面活性劑是非離子性表面活性劑。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的生物分子分析試劑盒，其中，所述非離子性表面活性劑是Tween 20o16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的生物分子分析試劑盒，其中，所述非離子性表面活性劑是Triton-1OO017.根據(jù)權(quán)利要求13所述的生物分子分析試劑盒，其中，所述表面活性劑的濃度是0.0005%以上且5%以下。18.—種生物分子分析方法，其具有下述工序: 在具有流路及多個容器形狀部的反應(yīng)容器中，將試劑送液至所述流路，將所述試劑填充到所述多個孔中，將油性密封液送液至所述流路，利用所述油性密封液將所述多個孔內(nèi)的所述試劑密封，從而使所述多個孔形成為多個獨立的核酸檢測反應(yīng)容器； 其中，所述試劑及所述油性密封液中的任一個含有表面活性劑。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的生物分子分析方法，其中，在將所述試劑填充于所述多個孔之前進(jìn)一步具有通過所述流路將洗滌用的緩沖液填充到所述多個孔中的工序。20.—種生物分子分析方法，其是使用了權(quán)利要求1?10中任一項或者權(quán)利要求12?17中任一項所述的生物分子分析試劑盒的生物分子分析方法， 其中，在將洗滌用緩沖液供給至所述容器形狀部之后，將所述試劑供給至所述容器形狀部。
【文檔編號】C12Q1/48GK105940096SQ201580006310
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2015年2月2日
【發(fā)明人】牧野洋, 牧野洋一, 國富朋子
【申請人】凸版印刷株式會社