專利名稱：：菊芋組織培養(yǎng)的方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及一種菊芋組織培養(yǎng)的方法其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：菊芋(HelianthustuberosusL.)又名洋姜，鬼子姜，為菊科向日葵屬多年生植物。葉片基部下延在兩側(cè)成翼為不完全葉，對生、輪生或互生于直立莖上；莖稈高度一般2m左右；管狀花黃色，頭狀花序較小；果實(shí)為瘦果，一般不能正常成熟，沒有發(fā)芽能力，不能種子繁殖；塊狀地下莖，其產(chǎn)量受地理位置、栽培品種和生長環(huán)境等方面因素影響，多在1250-5000公斤/畝范圍。菊芋原產(chǎn)北美，我國各地普遍栽培。耐旱、耐寒、耐各種病害、抗風(fēng)沙、以塊莖繁殖，即使在不施肥的廢墟、撂荒、鹽堿等地塊都能生長，適應(yīng)性很強(qiáng)。菊芋是一種多用途原料植物，塊莖中含有豐富的菊糖，可供食用。菊糖轉(zhuǎn)為果糖后，不僅甜度高(是蔗糖的1.8倍)，而且其在體內(nèi)代謝不受胰島素影響，進(jìn)入血液速度慢，高血壓、肥胖病、糖尿病患者均可食用，對人類的飲食健康有著非常重要的作用，是制糖和生產(chǎn)高果糖漿的原料。菊芋也能提制酒精和白酒，果糖發(fā)酵后可用來生產(chǎn)乙醇，每升塊莖汁液可以獲得每升大約IOOg乙醇，每公頃每年生產(chǎn)的塊莖可以轉(zhuǎn)化成4500L乙醇和碳?xì)淙剂?，被稱為“綠色石油”，是很好的代用燃料。此外，新鮮的莖、葉可做飼料；莖桿中的纖維也可供造紙用等。因此，菊芋是一種用途廣泛、極具開發(fā)潛力的植物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種菊芋的叢生芽分化培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的菊芋的叢生芽分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的固體培養(yǎng)基IAA、6-BA、ZT、碳源和凝膠劑；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示；所述叢生芽分化培養(yǎng)基中IAA的終濃度是0.05-0.15mg/L、6_BA終濃度是0.1-2.Omg/L、ZT的終濃度是0.3-0.5mg/L。表1.MS基本培養(yǎng)液的溶質(zhì)_大量元素_培養(yǎng)基中濃度(g·!/1)CaCl2.2H200.44<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述凝膠劑可以是瓊脂粉、卡拉膠或Gelrite等組織培養(yǎng)常用固化劑，優(yōu)選的是瓊脂；瓊脂以能達(dá)到的培養(yǎng)基硬度為基礎(chǔ)，可適當(dāng)調(diào)整用量，本發(fā)明中所有培養(yǎng)基中的瓊脂均可以是6g/L。上述碳源可以是20_40g/L的葡萄糖或蔗糖，優(yōu)選為30g/L蔗糖。進(jìn)一步，上述叢生芽分化培養(yǎng)基中IAA、6_BA和ZT的終濃度分別是如下1)_4)中任一種1)IAA為0.05-0.15mg/L、6_BA為0.5-1.5mg/L和ZT為0.3-0.5mg/L；2)IAA為0.lmg/L、6-BA為0.5mg/L和ZT為0.4mg/L；3)IAA為0.lmg/L、6-BA為1.Omg/L和ZT為0.4mg/L；4)IAA為0.lmg/L、6-BA為1.5mg/L和ZT為0.4mg/L。本發(fā)明的又一目的是為了提供一種生產(chǎn)菊芋再生苗的方法。本發(fā)明提供的生產(chǎn)菊芋再生苗的方法，包括以下步驟a)將菊芋的帶葉莖段置于上述的叢生芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到苗；b)將步驟a)得到的苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到菊芋再生苗。所述生根培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中，添加ΙΑΑ、NAA、6_BA、ZT、蔗糖和瓊脂得到的固體培養(yǎng)基；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示；所述生根培養(yǎng)基中IAA的終濃度是0.1-0.3mg/L,NAA的終濃度為0.5-1.5mg/L，6-BA的終濃度為0.05-0.15mg/L,ZT的終濃度為0.05-0.15mg/L以及蔗糖的終濃度為20-40g/Lo進(jìn)一步，上述生根培養(yǎng)基中ΙΑΑ、NAA.6-BA和ZT的終濃度分別是如下1)_3)中任一種1)IAA0.2mg/L、NAA0.5mg/L、6_BA0.lmg/L和ZTO.lmg/L；2)IAA0.2mg/L、NAA1.0mg/L、6_BA0.lmg/L和ZTO.lmg/L；3)IAA0.2mg/L、NAA1.5mg/L、6_BA0.lmg/L和ZTO.lmg/L。上述菊芋的帶葉莖段是由菊芋頂芽置于頂芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的無菌小苗經(jīng)剪切得到的。所述頂芽培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中，添加IAA、6_BA、蔗糖和瓊脂得到的固體培養(yǎng)基；所述頂芽培養(yǎng)基中IAA的終濃度為0.05-0.15mg/L,6-BA的終濃度為0.05-0.lmg/L以及蔗糖的終濃度為20-40g/L。進(jìn)一步，上述頂芽培養(yǎng)基中IAA和6-BA終濃度分別是如下1)_3)中任一種1)IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為0.lmg/L；2)IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為0.5mg/L；3)IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為1.Omg/L。上述生產(chǎn)菊芋再生苗的方法中的步驟a)與步驟b)之間還有一繼代培養(yǎng)的步驟；所述繼代培養(yǎng)的步驟是將所述步驟a)得到的苗轉(zhuǎn)接在繼代培養(yǎng)基上擴(kuò)繁得到無根苗的步驟；所述繼代培養(yǎng)基為上述的叢生芽分化培養(yǎng)基。上述菊芋頂芽可以是經(jīng)過預(yù)處理的，所述預(yù)處理是將菊芋頂芽用70%的乙醇消毒后，再用0.1%的HgCl2進(jìn)行消毒，然后用無菌水沖洗至少一次。本發(fā)明的方法是利用菊芋的頂芽作為外植體建立組織培養(yǎng)體系，最終通過誘導(dǎo)叢生芽的分化建立穩(wěn)定高效的組織培養(yǎng)體系。該體系可用于菊芋的快速繁殖，也可以用于外源基因的快速遺傳轉(zhuǎn)化、還可用于分化率遺傳研究、組織培養(yǎng)的材料選育等方面。采用本發(fā)明提供的菊芋組織培養(yǎng)的方法，叢生芽的分化率可達(dá)到100%，每個(gè)芽的年增殖系數(shù)理論上達(dá)1.6XIO7以上，生根率可達(dá)95%，移栽成活率可達(dá)95%。圖1為菊芋頂芽無菌苗。圖2為菊芋誘導(dǎo)分化得到的叢生芽。圖3為菊芋再生苗的生根情況。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、菊芋再生苗的獲得及其觀察分析一、帶葉莖段的獲得1)外植體的獲得選生長健壯的菊芋(從北京市石景山蘋果園農(nóng)貿(mào)市場購買)塊莖作材料，在28°C，5000Lx、14h/D光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)培養(yǎng)10天，取頂芽作外植體，建立無菌體系，提供誘導(dǎo)不定芽的材料。2)外植體的預(yù)處理取上述步驟1)中健康飽滿的菊芋頂芽，用70%的乙醇表面消毒1分鐘，再用0.的升汞消毒10分鐘，滅菌蒸餾水洗三次，每次10分鐘。將預(yù)處理好的菊芋頂芽外植體備用。3)得到無菌小苗將上述步驟2)中處理好的菊芋頂芽外植體接種到頂芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到無菌小苗。上述頂芽培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加IAA、6_BA、蔗糖和瓊脂得到的培養(yǎng)基。其中蔗糖的終濃度為30g/L，瓊脂的終濃度為6g/L，MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示，該培養(yǎng)基的PH值為5.8-6.0；IAA和6-BA的終濃度設(shè)置為以下Tl、T2、T3三組Tl=IAA的終濃度為0.lmg/L，6-BA的終濃度為0.lmg/L；T2IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為0.5mg/L；T3=IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為1.Omg/L。培養(yǎng)基的滅菌均采用121°C滅菌20分鐘高壓濕熱滅菌。頂芽外植體培養(yǎng)的條件為光照培養(yǎng)箱中，溫度為25°C士2，光照時(shí)間為12小時(shí)，光照強(qiáng)度為90μMHT2s-1。4)統(tǒng)計(jì)觀察實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)觀察上述步驟3)中三組頂芽培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果。接種在頂芽培養(yǎng)基中的菊芋頂芽在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23周后大部分都能萌發(fā)長出幼葉，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表2。從表2可以看出，萌發(fā)率最高且生長最好的是Τ3培養(yǎng)基(IAA的終濃度為0.Img/L，6-BA的終濃度為1.Omg/L)，培養(yǎng)1.5個(gè)月后，頂芽生長旺盛，苗高達(dá)2.Ocm-4.Ocm0其中T3培養(yǎng)基培養(yǎng)1個(gè)月的照片如圖1所示。表2.頂芽在不同頂芽培養(yǎng)基中的萌發(fā)情況統(tǒng)計(jì)(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)—培養(yǎng)基編號丨TlIΤ2T3“TT-TT外植體塊數(shù)909090接禾中3周----萌發(fā)塊數(shù)__83__84__87_』萌發(fā)率(％)一92.293.396.7.溫』ijF賊難胃(cm)2.9士0.83.1±1.23.6±1.3備注每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次10瓶，每瓶3個(gè)外植體。二、叢生芽的獲得1)帶葉莖段的獲得采用上述步驟一的T3培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到無菌小苗剪成5IOmm長短的帶葉莖段備用。2)誘導(dǎo)叢生芽分化將上述步驟1)中得到的帶葉莖段接種到叢生芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到叢生芽。上述叢生芽分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的培養(yǎng)基IAA、6-BA、ZT、碳源和凝膠劑；其中蔗糖的終濃度為30g/L，瓊脂的終濃度為6g/L，該培養(yǎng)基的pH值為5.8-6.0，MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示；將叢生芽分化培養(yǎng)基中IAA、6_BA和ZT的終濃度設(shè)置為B1-B6六組BlIAA為Omg/L,6-BA為0.lmg/L,ZT為0.4mg/L；B2JAA為0.lmg/L,6-BA為0.lmg/L,ZT為0.4mg/L；B3JAA為0.lmg/L,6-BA為0.5mg/L,ZT為0.4mg/L；B4JAA為0.lmg/L,6-BA為1.Omg/L,ZT為0.4mg/L；B5:IAA為0.lmg/L,6-BA為1.5mg/L,ZT為0.4mg/L；B6:IAA為0.lmg/L,6-BA為2.Omg/L,ZT為0.4mg/L。培養(yǎng)基的滅菌均采用121°C滅菌20分鐘高壓濕熱滅菌。誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)條件為光照培養(yǎng)箱中，溫度為25°C士2，光照時(shí)間為14小時(shí)，光照強(qiáng)度為100μMπΓΥ1。3)統(tǒng)計(jì)觀察實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)觀察上述Β1-Β6各組叢生芽分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化叢生芽的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表3。從表3可以看出，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周后，高細(xì)胞分裂素、低生長素Β3-Β5培養(yǎng)基中分化較好，以Β4最好，可從莖段葉腋處和基部長出腋芽和不定芽，細(xì)胞分裂素過高將會抑制不定芽的分化。其中Β3培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周的照片如圖2所示。表3、不同叢生芽分化培養(yǎng)基的叢生芽誘導(dǎo)情況(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>備注每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次10瓶，每瓶接5個(gè)莖段。三、繼代培養(yǎng)得到無根苗在得到步驟二中的從生芽后進(jìn)一步進(jìn)行繼代培養(yǎng)。經(jīng)過復(fù)數(shù)次的繼代培養(yǎng)，可得到所需數(shù)量的無根苗。繼代培養(yǎng)的次數(shù)可根據(jù)所需無根苗的數(shù)量和繼代培養(yǎng)的增殖系數(shù)而定。以Β1-Β6各自對應(yīng)的叢生芽分化培養(yǎng)基作為繼代培養(yǎng)基，分別剪取各培養(yǎng)基中長出的所有小芽(包括腋芽)，分別剪切成帶葉莖段，并將較高的小芽切成長約1020mm帶葉莖段，按形態(tài)學(xué)向上的原則，將莖段的下端插入到各自的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)(培養(yǎng)條件與步驟二中的一致)。培養(yǎng)至1個(gè)月，每個(gè)培養(yǎng)物從葉腋處和基部長出4-7個(gè)腋芽和不定芽，其中B3-B5培養(yǎng)基中分化最好。按此方法每個(gè)月繼代培養(yǎng)，分化頻率為100%，每個(gè)芽的年增殖系數(shù)理論上為1.6XIO7以上。四、再生苗的獲得1)誘導(dǎo)生根選取上述步驟三中得到的生長健壯、高度為1.5-3.Ocm的無根苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到菊芋再生苗。上述生根培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中，添加ΙΑΑ、NAA、6_BA、ZT、蔗糖和瓊脂得到的培養(yǎng)基；其中蔗糖的終濃度為30g/L，瓊脂的終濃度為6g/L，pH值為5.8-6.0，MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示；其中ΙΑΑ、NAA.6-BA和ZT的終濃度設(shè)置為R1-R4四組RlJAA為0.2mg/L,NAA為0.lmg/L,6-BA為0.lmg/L,ZT為0.lmg/L；R2JAA為0.2mg/L,NAA為0.5mg/L,6-BA為0.lmg/L,ZT為0.lmg/L；R3JAA為0.2mg/L,NAA為1.Omg/L,6-BA為0.lmg/L,ZT為0.lmg/L；R4JAA為0.2mg/L,NAA為1.5mg/L,6-BA為0.lmg/L,ZT為0.lmg/L。培養(yǎng)基的滅菌均采用121°C滅菌20分鐘高壓濕熱滅菌。生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件置于光照培養(yǎng)箱中，在溫度為25V士2，光照時(shí)間為10小時(shí)，光照強(qiáng)度為110μMHT2iT1。2)統(tǒng)計(jì)觀察實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)觀察上述R1-R4各組生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根的情況。無根苗在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周統(tǒng)計(jì)觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表4。從表4可以看出，高生長素和低細(xì)胞分裂素的R2R4培養(yǎng)基都有較好效果。表4、不同生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根的情況(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>備注每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次10瓶，每瓶接5個(gè)莖段。3)煉苗移栽將步驟2)中獲得的再生苗在培養(yǎng)瓶中再培養(yǎng)1周后，使根和苗生長更加粗壯(R3培養(yǎng)基的照片如圖3所示)，即可出瓶煉苗。用自來水洗去再生苗的培養(yǎng)基。然后，將再生苗移栽至裝有按11混合的草炭土和蛭石的塑料小盆中，將其轉(zhuǎn)移光照培養(yǎng)箱中，在溫度為25V士2，光照時(shí)間為10小時(shí)，光照強(qiáng)度為ΙΙΟμΜπΓ、—1條件下培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)成活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果叢表5中可以看出，成活率為95%以上。表5、煉苗移栽的成活率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求一種菊芋的叢生芽分化培養(yǎng)基，是在MS基本培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的固體培養(yǎng)基IAA、6-BA、ZT、碳源和凝膠劑；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示；所述叢生芽分化培養(yǎng)基中IAA的終濃度是0.05-0.15mg/L、6-BA終濃度是0.1-2.0mg/L、ZT的終濃度是0.3-0.5mg/L。2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述凝膠劑是瓊脂、卡拉膠或GelriteJt選是瓊脂，所述瓊脂的終濃度為6g/L；所述碳源是終濃度為20-40g/L的葡萄糖或蔗糖，優(yōu)選是終濃度為30g/L的蔗糖。3.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述菊芋的叢生芽分化培養(yǎng)基中IAA、6-BA和ZT的終濃度分別是如下1)_4)中任一種1)IAA為0.05-0.15mg/L、6-BA為0.5-1.5mg/L和ZT為0.3-0.5mg/L；2)IAA為0.lmg/L、6-BA為0.5mg/L和ZT為0.4mg/L；3)IAA為0.lmg/L、6-BA為1.Omg/L和ZT為0.4mg/L；4)IAA為0.lmg/L、6-BA為1.5mg/L和ZT為0.4mg/L。4.一種生產(chǎn)菊芋再生苗的方法，包括以下步驟a)將菊芋的帶葉莖段置于權(quán)利要求1-3中任一所述的菊芋的叢生芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到苗；b)將步驟a)得到的苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到菊芋再生苗。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述生根培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中，添加IAA、NAA、6-BA、ZT、蔗糖和瓊脂得到的固體培養(yǎng)基；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示；所述生根培養(yǎng)基中IAA的終濃度是0.1-0.3mg/L,NAA的終濃度為0.5-1.5mg/L，6_BA的終濃度為0.05-0.15mg/L,ZT的終濃度為0.05-0.15mg/L以及蔗糖的終濃度為20_40g/L06.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述生根培養(yǎng)基中IAA、NAA.6-BA和ZT的終濃度分別是如下1)_3)中任一種1)IAA0.2mg/L、NAA0.5mg/L、6_BA0.lmg/L和ZT0.lmg/L；2)IAA0.2mg/L、NAA1.Omg/L,6-BA0.lmg/L和ZT0.lmg/L；3)IAA0.2mg/L、NAA1.5mg/L、6_BA0.lmg/L禾口ZT0.lmg/L。7.如權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述菊芋的帶葉莖段是由菊芋頂芽置于頂芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的無菌小苗經(jīng)剪切得到的。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述頂芽培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中，添加IAA、6-BA、蔗糖和瓊脂得到的固體培養(yǎng)基；所述頂芽培養(yǎng)基中IAA的終濃度為0.05-0.15mg/L,6-BA的終濃度為0.05-0.lmg/L以及蔗糖的終濃度為20_40g/L。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述頂芽培養(yǎng)基中IAA和6-BA終濃度分別是如下1)_3)中任一種1)IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為0.lmg/L；2)IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為0.5mg/L；3)IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為1.Omg/L。10.如權(quán)利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述步驟a)與步驟b)之間還有一繼代培養(yǎng)的步驟；所述繼代培養(yǎng)的步驟是將所述步驟a)得到的苗轉(zhuǎn)接在繼代培養(yǎng)基上擴(kuò)繁得到無根苗的步驟；所述繼代培養(yǎng)基為權(quán)利要求1-3中任一所述的菊芋的叢生芽分化培養(yǎng)基。全文摘要本發(fā)明公開了一種菊芋組織培養(yǎng)的方法及其專用培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的專用培養(yǎng)基是叢生芽分化培養(yǎng)基，具體是在MS基本培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的培養(yǎng)基IAA、6-BA、ZT、碳源和凝膠劑；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水，溶質(zhì)如表1所示；所述叢生芽分化培養(yǎng)基中IAA的終濃度是0.05-0.15mg/L、6-BA終濃度是0.1-2.0mg/L、ZT的終濃度是0.3-0.5mg/L。采用本發(fā)明提供的菊芋組織培養(yǎng)的方法，叢生芽的分化率可達(dá)到100％，每個(gè)芽的年增殖系數(shù)理論上達(dá)1.6X107以上，生根率可達(dá)95％，移栽成活率可達(dá)95％。文檔編號A01H4/00GK101803575SQ201010160829公開日2010年8月18日申請日期2010年4月26日優(yōu)先權(quán)日2010年4月26日發(fā)明者曹川申請人:曹川