專利名稱:一種培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES cell)也稱ES細(xì)胞，是一種存在于著床前早期胚胎中的具有全能性的細(xì)胞。全能性即分化發(fā)育成三個(gè)胚層的組織細(xì)胞的能力。胚胎干細(xì)胞能在體外進(jìn)行培養(yǎng)傳代，保持未分化二倍體狀態(tài)以及其全能性，具有形成嵌合體動(dòng)物(chimeric animal)的能力。小鼠胚胎干細(xì)胞最早由Evans和Kaufman(1981)兩人以及Martin(1981)分別從小鼠早期胚胎中分離培養(yǎng)成功并建立細(xì)胞系。由于其具有全能性，故廣泛用于胚胎發(fā)育及胚胎工程方面的研究。例如在培養(yǎng)液中加入不同的分化因子，可定向誘導(dǎo)其分化發(fā)育成心肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞，甚至可用它培養(yǎng)出器官；可用不同的外源性基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞，或在胚胎干細(xì)胞水平上進(jìn)行基因敲除或基因打靶，經(jīng)體外篩選后建立帶有目的基因的細(xì)胞系或?qū)⒑Y選后帶有目的基因的胚胎干細(xì)胞注射到宿主著床前胚胎內(nèi)，并移植到假孕母體子宮腔內(nèi)使之發(fā)育成個(gè)體。從而建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因敲除動(dòng)物和基因打靶動(dòng)物，研究基因在分化發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)與調(diào)控以及制備人類疾病動(dòng)物模型等。由于小鼠胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中極易分化和失去正常二倍體核型，進(jìn)而失去全能性和喪失形成嵌合體動(dòng)物的能力，故需要特殊的培養(yǎng)條件。
胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)的原則是在促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖的同時(shí)，維持其未分化二倍體狀態(tài)。胚胎干細(xì)胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍體正常核型的細(xì)胞則會(huì)大大降低形成嵌合體(chimera)的能力，特別是進(jìn)入種系形成生殖細(xì)胞的能力。
目前體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的方法歸納起來(lái)有二大類有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法和無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)法。無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)法則是利用各種能分泌抑制分化因子的細(xì)胞制備條件培養(yǎng)基，如果使用這樣的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞，可以不使用飼養(yǎng)層細(xì)胞，能保證小鼠胚胎干細(xì)胞增殖的同時(shí)維持未分化二倍體狀態(tài)。由于無(wú)滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)方法在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室在長(zhǎng)時(shí)間難以維持mES多能性。目前主要使用滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)方法。有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法主要應(yīng)用MEF和SIM小鼠成纖維細(xì)胞耐硫代鳥(niǎo)嘌呤和耐烏苯苷亞系STO細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞；經(jīng)絲裂霉素-C或γ-射線處理終止其分裂后制備成飼養(yǎng)單層，將胚胎干細(xì)胞種植在這樣的單層上。MEF和STO都能分泌促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖和抑制胚胎干細(xì)胞自主分化的因子。MEF和STO培養(yǎng)上清中抑制胚胎干細(xì)胞自主分化因子-LIF含量在500～1000IU/ml(分泌型)，同時(shí)在MEF和STO基質(zhì)上還存在LIF(基質(zhì)型)。STO細(xì)胞是已建系的SIM小鼠成纖維細(xì)胞耐硫代鳥(niǎo)嘌呤和耐烏本苷亞系(Hogan et al.1994)。它可以長(zhǎng)期進(jìn)行體外培養(yǎng)傳代和凍存。但效果不如MEF而未能廣泛使用。使用MEF作為飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞是一種最早和常用的方法。MEF能產(chǎn)生抑制胚胎干細(xì)胞自主分化和促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖的因子，故它能有效地促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖并維持其未分化二倍體狀態(tài)和全能性。通常準(zhǔn)備12.5～14.5d懷孕小鼠制備MEF。因?yàn)榈?～5代的MEF生長(zhǎng)和各種因子分泌都旺盛，雜細(xì)胞也較少，因此選擇第3～5代的MEF制備滋養(yǎng)層細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)mES時(shí)，常要在培養(yǎng)液中加入抑制胚胎干細(xì)胞自主分化的因子-人工重組LIF。
小鼠胚胎干細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是高糖的DMEM。培養(yǎng)液配制時(shí)，還要添加β-巰基乙醇(β-ME)或單硫甘油、谷氨酰胺、非必需氨基酸、重組的LIF和胎牛血清等多種成分。高糖的DMEM有助于囊胚的貼壁、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的增殖及小鼠胚胎干細(xì)胞集落的形成；胎牛血清是胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液中不可缺少的成分。在促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖方面起到很好的作用；β-巰基乙醇(β-ME)可以保護(hù)細(xì)胞內(nèi)酶和蛋白質(zhì)中的硫基不被氧化，從而促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的貼壁及克隆形成；LIF是六十年代末發(fā)現(xiàn)的一種多功能細(xì)胞因子。在體外具有誘導(dǎo)M1細(xì)胞(一種髓樣白血病細(xì)胞，myeloid leukaemiccell)向正常分化和抑制胚胎干細(xì)胞自主分化能力，以及能夠促進(jìn)8細(xì)胞期以后的桑椹胚至著床前胚胎的發(fā)育，提高囊胚的存活率，促進(jìn)滋胚層細(xì)胞增殖和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)。許多組織和細(xì)胞都有LIF和LIF受體的表達(dá)，如子宮內(nèi)膜、蛻膜、胚胎滋胚層細(xì)胞、胚胎成纖維細(xì)胞、人膀胱癌細(xì)胞等有LIF的表達(dá)；胚胎干細(xì)胞、M1髓樣白血病細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、胚胎瘤(癌)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等有LIF受體的表達(dá)。LIF分為兩種類型分泌型(D型)和基質(zhì)型(M型)。D型可分泌到細(xì)胞外液中，M型則錨定到細(xì)胞外基質(zhì)上。人和鼠LIF基因有78％～94％的同源性。有用人LIF培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞抑制其分化的報(bào)道，但未見(jiàn)有用鼠LIF培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的報(bào)道。目前，人工重組的LIF制品已被商品化，可用來(lái)制備LIF條件培養(yǎng)基。LIF最適用量為1000IU/ml。當(dāng)LIF濃度降至50～100單位/ml時(shí)，胚胎干細(xì)胞未分化的克隆數(shù)會(huì)下降至50％～60％。
自從mES建系以來(lái)20多年時(shí)間內(nèi)，盡管小鼠胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)最為成熟，但是上述培養(yǎng)體系仍存在如下缺點(diǎn)(1)操作復(fù)雜mES體外培養(yǎng)過(guò)程包括12.5～14.5d懷孕小鼠的準(zhǔn)備、MEF的分離和培養(yǎng)、MEF滋養(yǎng)層細(xì)胞制備、條件培養(yǎng)基配制、mES的傳代等。(2)MEF生命期有限，不能在體外長(zhǎng)期傳代。在體外傳代時(shí)間太長(zhǎng)，其產(chǎn)生促增殖因子和抑制分化因子的能力會(huì)減弱甚至喪失。這就需要經(jīng)常準(zhǔn)備12.5～14.5d懷孕小鼠制備MEF。(3)種植胚胎干細(xì)胞前，如果用絲裂霉素-C處理MEF，清洗不徹底時(shí)，殘余的絲裂霉素-C會(huì)影響胚胎干細(xì)胞的增殖。(4)在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，死亡的MEF細(xì)胞的染色體釋出可能會(huì)引起胚胎干細(xì)胞的突變及影響正常核型的保持。(5)培養(yǎng)液成分復(fù)雜在mES培養(yǎng)體系中，除基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清外，需要添加β-巰基乙醇(β-ME)或硫代甘油、谷氨酰胺、非必需氨基酸、重組的LIF。同時(shí)，其中氨基酸成分、重組LIF等長(zhǎng)時(shí)間放置易導(dǎo)致生物活性喪失。(6)傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法中使用孕鼠、各種氨基酸、人工重組LIF等具有非常高昂費(fèi)用的生物材料和試劑，對(duì)于我國(guó)科研經(jīng)費(fèi)相對(duì)缺乏的國(guó)情，使得有關(guān)mES的研究工作受到極大的限制。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便、有效、低成本的培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的方法及其專用培養(yǎng)基。
本發(fā)明所提供的培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞(mES)的方法，是在滋養(yǎng)層細(xì)胞上，用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞，其中，所述滋養(yǎng)層細(xì)胞為上皮或內(nèi)皮細(xì)胞。
所述上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞可來(lái)源于人和哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。
所述上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞具體可來(lái)源于人和哺乳動(dòng)物上皮組織或內(nèi)皮細(xì)胞且具有自發(fā)分泌LIF的功能(包括自發(fā)分泌基質(zhì)型LIF和分泌型LIF)。
所述上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞包括已建系的上皮細(xì)胞系、內(nèi)皮細(xì)胞系和原代培養(yǎng)獲得的上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。
所述內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、心血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓組織內(nèi)皮細(xì)胞等；所述上皮細(xì)胞優(yōu)選為人膀胱上皮組織、泌尿生殖道上皮組織、呼吸道、消化道等組織來(lái)源上皮細(xì)胞。
所述人膀胱癌上皮細(xì)胞系可為人膀胱癌上皮細(xì)胞T24；所述人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV-304。
人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV-304源自1984年日本科學(xué)家從新生男嬰臍靜脈分離的，具有永生特性并不依賴任何細(xì)胞因子的內(nèi)皮細(xì)胞系，后來(lái)證實(shí)ECV-304細(xì)胞系來(lái)自人膀胱癌上皮細(xì)胞系T24。
因上述動(dòng)物上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞具有類似MEF滋養(yǎng)層細(xì)胞特性如均具有自發(fā)分泌LIF的功能，為小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新、細(xì)胞分裂和增殖提供必需的基質(zhì)成分和必要的細(xì)胞因子，故可作為培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的滋養(yǎng)層細(xì)胞。
上述方法中，所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液可為基礎(chǔ)培養(yǎng)基是高糖的DMEM，添加β-巰基乙醇(β-ME)或硫代甘油、和胎牛血清等多種成分。
所述培養(yǎng)液優(yōu)選是在含有L-谷氨酰胺的高糖DMEM中，添加胎牛血清或小牛血清以及硫代甘油，使胎牛血清或小牛血清的質(zhì)量百分含量為10-20％，硫代甘油的含量為1.5-3.0×10-4mol/L。
本發(fā)明選擇上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，用于mES細(xì)胞培養(yǎng)，建立了一種新型的mES培養(yǎng)體系。這種體系不依賴于外源的人工重組LIF，同時(shí)也不需要利用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。而傳統(tǒng)的飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)mES時(shí)，在培養(yǎng)液中加入抑制胚胎干細(xì)胞自主分化的因子-人工重組LIF。本發(fā)明利用上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞自發(fā)分泌LIF的特點(diǎn)，可以避免增加外源的人工重組的LIF。本發(fā)明所提供的mES培養(yǎng)體系無(wú)需孕鼠、無(wú)需谷氨酰胺、無(wú)需非必需氨基酸、無(wú)需人工重組的LIF。傳統(tǒng)培養(yǎng)體系因制備MEF不定期需要孕鼠，需具備養(yǎng)飼小鼠的設(shè)備和條件；同時(shí)傳統(tǒng)培養(yǎng)體系需要多種氨基酸和重組LIF。本發(fā)明使得mES的培養(yǎng)成本大大降低。利用本發(fā)明的方法，mES可以穩(wěn)定傳代20代以上，并能夠保持mES未分化的二倍體狀態(tài)和多能性，維持自我更新和快速增值。本發(fā)明的培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的方法，操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)成分簡(jiǎn)單，成本低廉，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
圖1為ECV-304細(xì)胞為滋養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)2天的復(fù)蘇的小鼠胚胎干細(xì)胞R1照片圖2為人膀胱癌上皮細(xì)胞T24為滋養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)2天的復(fù)蘇的小鼠胚胎干細(xì)胞R1照片圖3為RT-PCR檢測(cè)mES干性分子表達(dá)圖4A為未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1中的Oct3/4的免疫熒光檢測(cè)照片圖4B為未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1中的SSEA-1的免疫熒光檢測(cè)照片圖4C為用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1中的Oct3/4的免疫熒光檢測(cè)照片圖4D為用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1中的SSEA-1的免疫熒光檢測(cè)照片圖5為ECV-304細(xì)胞為滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)的mES經(jīng)過(guò)20代后形成4天的EB
圖6A為Real-time RT-PCR檢測(cè)形成的EB中的Neuro D的表達(dá)圖6B為Real-time RT-PCR檢測(cè)形成的EB中的Sox17的表達(dá)圖6C為Real-time RT-PCR檢測(cè)形成的EB中的Brachyury(T)的表達(dá)具體實(shí)施方式
本發(fā)明所提供的培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的方法無(wú)需反復(fù)多次準(zhǔn)備孕鼠，無(wú)需反復(fù)多次制備MEF，無(wú)需反復(fù)多次準(zhǔn)備MEF滋養(yǎng)層細(xì)胞。本發(fā)明方法直接用上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞按一定密度(與傳統(tǒng)的mES培養(yǎng)體系中要求接種的MEF滋養(yǎng)層細(xì)胞密度一致)接種在經(jīng)過(guò)明膠處理后的培養(yǎng)器皿中后，通過(guò)或不經(jīng)過(guò)絲裂霉素處理，接種mES(接種密度與傳統(tǒng)的mES培養(yǎng)體系中要求接種的mES密度一致)。共同培養(yǎng)2-4天后按照1∶2-5的比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。傳代時(shí)，如開(kāi)始的上皮或內(nèi)皮滋養(yǎng)層細(xì)胞未用絲裂霉素處理，只需按照普通貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方式對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞和mES同時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；如在開(kāi)始對(duì)上皮或內(nèi)皮滋養(yǎng)層細(xì)胞使用絲裂霉素處理(處理方法與傳統(tǒng)的mES培養(yǎng)體系中要求的處理方法一致)，消化、收集mES前，準(zhǔn)備上皮或內(nèi)皮滋養(yǎng)層細(xì)胞，而消化和收集mES的方法同傳統(tǒng)的mES培養(yǎng)方法。如使用的為已建系的上皮或內(nèi)皮細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，可以將此上皮或內(nèi)皮細(xì)胞系進(jìn)行凍存和復(fù)蘇。未用絲裂霉素處理的上皮或內(nèi)皮細(xì)胞系和mES共培養(yǎng)時(shí)，連同共培養(yǎng)的上皮或內(nèi)皮細(xì)胞系和mES同時(shí)凍存和復(fù)蘇。
為了簡(jiǎn)化研究系統(tǒng)，以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV-304(日本DSMZ公司，DSMZno.ACC310)或人膀胱癌上皮細(xì)胞系T24(美國(guó)ATCC公司，ATCC no.HTB-4TM)為滋養(yǎng)層細(xì)胞，以小鼠胚胎干細(xì)胞R1(美國(guó)ATCC公司。ATCCNumberSCRC-1011)作為mES。以下實(shí)驗(yàn)是在該體系中進(jìn)行的研究工作，其研究結(jié)果說(shuō)明了本發(fā)明，同時(shí)不限制本發(fā)明的范圍(包括已建系的上皮或內(nèi)皮細(xì)胞和原代培養(yǎng)獲得的上皮或內(nèi)皮細(xì)胞及其他類型的mES)。另外，下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中，除了CO2的百分含量為體積百分含量外，其它百分含量如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV-304作為滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞一、ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞的制備1、ECV-304細(xì)胞培養(yǎng)主要實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV-304(日本DSMZ公司，DSMZ no.ACC310)，以下簡(jiǎn)稱ECV-304。
細(xì)胞培養(yǎng)液在高糖DMEM(Hyclone公司的產(chǎn)品，貨號(hào)為SH30243.01)中添加小牛血清和硫代甘油(MTG)，使小牛血清的質(zhì)量百分含量為10％，使硫代甘油的含量為1.5×10-4mol/L。
消化液0.25％胰蛋白酶以1∶1的體積比加入0.02％EDTA得到的溶液。
2、ECV-304細(xì)胞復(fù)蘇(1)細(xì)胞復(fù)蘇自凍存液氮罐中取出凍存細(xì)胞，迅速置入37℃-42℃水浴中，使細(xì)胞快速融化；離心去除凍存液，加入ECV-304細(xì)胞培養(yǎng)液，置在37℃、5％(體積比)CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
(2)ECV-304細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇的細(xì)胞在24小時(shí)后換液，繼續(xù)培養(yǎng)3-4天，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70％融合時(shí)，按1∶3～1∶6傳代培養(yǎng)。
2、ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞的制備主要實(shí)驗(yàn)材料絲裂霉素-C絲裂霉素-C 2mg溶解于4ml的0.01mol/L、pH為7.2-7.5 PBS中，配制成0.5mg/ml的母液；4℃避光保存。使用前，用上述細(xì)胞培養(yǎng)液配成終濃度為10ug/ml。稀釋后4℃保存，不超過(guò)一周。
0.1％明膠水溶液明膠0.1g，超純水100ml。稍加熱溶解后高壓滅菌45min。4℃保存?zhèn)溆谩?br> (1)未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞制備將ECV-304細(xì)胞在傳代后2-3天制備滋養(yǎng)層細(xì)胞。用上述消化液消化ECV-304細(xì)胞，用上述細(xì)胞培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液，種植到預(yù)先用0.1％明膠水溶液處理過(guò)的培養(yǎng)瓶(皿)內(nèi)。種植的細(xì)胞密度為1×104個(gè)/cm2。將制備好的飼養(yǎng)單層在37℃、5％(體積比)CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)，第二天備用。
(2)用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞制備A.當(dāng)ECV-304細(xì)胞生長(zhǎng)連成一片時(shí)，在培養(yǎng)上清中加入絲裂霉素-C，使終濃度為10ug/ml，放回培養(yǎng)箱作用2～3hr。
或當(dāng)ECV-304細(xì)胞生長(zhǎng)連成一片時(shí)，用γ-射線照射，照射量為3000～10000rad。
B.用明膠預(yù)先處理培養(yǎng)瓶(皿)。處理方法是將0.1％明膠水溶液吸入培養(yǎng)瓶(皿)內(nèi)，以能覆蓋培養(yǎng)瓶(皿)表面即可，在室溫下靜置2hr以上。使用前，吸棄多余的明膠水溶液，用PBS洗滌一次。
C.棄含有絲裂霉素-C的飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清。用PBS洗滌五次；若用γ-射線處理，則省去用PBS洗滌。
D消化飼養(yǎng)細(xì)胞。用上述細(xì)胞培養(yǎng)液制備成3×105個(gè)/ml密度的細(xì)胞懸液，種植到預(yù)先用明膠處理過(guò)的培養(yǎng)瓶(皿)內(nèi)。種植的細(xì)胞數(shù)為7.5×104～1×105個(gè)/cm2。
E.在37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
F.待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行觀察，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞過(guò)稀，補(bǔ)加處理過(guò)的細(xì)胞，以保證細(xì)胞能連成一片而沒(méi)有間隙。
G.將制備好的飼養(yǎng)單層放置在培養(yǎng)箱內(nèi)備用。當(dāng)細(xì)胞貼壁后即可使用(處理的細(xì)胞約需6-8小時(shí)即可貼壁)，使用前要更換細(xì)胞培養(yǎng)液。絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞與小鼠胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)2天，必須對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞傳代，否則，因ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞死亡導(dǎo)致小鼠胚胎干細(xì)胞的分化或凋亡。
二、已建系的胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)1.胚胎干細(xì)胞R1在未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞中的培養(yǎng)(1)將復(fù)蘇的小鼠胚胎干細(xì)胞R1用上述細(xì)胞培養(yǎng)液重懸或?qū)⒁言趥鹘y(tǒng)的mES培養(yǎng)體系MEF滋養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)2-4d、生長(zhǎng)旺盛的胚胎干細(xì)胞R1克隆消化成單細(xì)胞懸液，用于傳代。
(2)重懸復(fù)蘇的小鼠胚胎干細(xì)胞R1直接接種到步驟一制備的新的未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304飼養(yǎng)單層細(xì)胞上(飼養(yǎng)單層細(xì)胞密度為1×104/cm2)。需傳代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1用ECV-304細(xì)胞培養(yǎng)液以1∶3～1∶6比例轉(zhuǎn)種到步驟一制備的新的未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304飼養(yǎng)單層細(xì)胞上(飼養(yǎng)單層細(xì)胞密度為1×104/cm2)。37℃、5％(體積比)CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液。結(jié)果表明無(wú)論是復(fù)蘇的小鼠胚胎干細(xì)胞R1，還是傳代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1，2天后均觀察到mES有胚胎干細(xì)胞樣小集落出現(xiàn)，3-4天增大。圖1顯示的是培養(yǎng)2天的小鼠胚胎干細(xì)胞R1照片。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法培養(yǎng)2天的小鼠胚胎干細(xì)胞R1相同。
(3)培養(yǎng)2-4天后，將培養(yǎng)的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞和上述mES細(xì)胞同時(shí)按常規(guī)細(xì)胞傳代方法消化，以1∶3～1∶6比例將兩種細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)接種到用0.1％明膠預(yù)處理過(guò)的培養(yǎng)器皿中。此過(guò)程無(wú)需再制備ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞。
(4)按上述方法連續(xù)傳代。3-4代后，根據(jù)ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞密度變化，適當(dāng)增加ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞，保持細(xì)胞密度≥7.5×104個(gè)/cm2。過(guò)低密度的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞不易保持mES的多能性。
(5)凍存和復(fù)蘇細(xì)胞凍存用消化液消化ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞和上述mES細(xì)胞5-15分鐘，加入上述細(xì)胞培養(yǎng)液終止反應(yīng)，離心后去除上清，用凍存液---上述細(xì)胞培養(yǎng)液含有10-15％DMSO(體積比)，重懸細(xì)胞至4.0-6.0×106個(gè)/ml，每個(gè)凍存管加入1ml細(xì)胞懸液，按照4℃放置0.5-2小時(shí)，-20℃放置2小時(shí)，-80℃放置24小時(shí)，凍入液氮罐中。
ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞和上述mES細(xì)胞的復(fù)蘇按照上述“ECV-304細(xì)胞復(fù)蘇”的方法操作。
2.胚胎干細(xì)胞在用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞中的培養(yǎng)(1)將步驟一制備的用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細(xì)胞接種到用0.1％明膠預(yù)處理的培養(yǎng)器皿中，接種密度為7.5×104個(gè)/cm2，作為飼養(yǎng)單層。
(2)第二天，將復(fù)蘇的小鼠胚胎干細(xì)胞R1用上述細(xì)胞培養(yǎng)液重懸或?qū)⒁言趥鹘y(tǒng)的mES培養(yǎng)體系MEF滋養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)2-4d、生長(zhǎng)旺盛的小鼠胚胎干細(xì)胞R1克隆分別消化成單細(xì)胞后用上述細(xì)胞培養(yǎng)液重懸。
(3)將重懸的mES接種到用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞中，37℃、5％(體積比)CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液。
結(jié)果表明無(wú)論是復(fù)蘇的小鼠胚胎干細(xì)胞R1，還是在傳統(tǒng)的mES培養(yǎng)體系MEF滋養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞R1，2天后均觀察到mES有胚胎干細(xì)胞樣小集落出現(xiàn)，3-4天增大。它們的增殖速度和胚胎干細(xì)胞克隆的形態(tài)均與圖1顯示的在未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)2天的復(fù)蘇的小鼠胚胎干細(xì)胞R1相同。
(4)培養(yǎng)2-4天后，按傳統(tǒng)mES培養(yǎng)方法繼續(xù)傳代。但需在傳代的前一天制備ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞A.將已培養(yǎng)2～3d、生長(zhǎng)旺盛的胚胎干細(xì)胞克隆消化成單細(xì)胞懸液。消化方法同前。
B.添加上述細(xì)胞培養(yǎng)液，以1∶3-1∶6比例轉(zhuǎn)種到新的飼養(yǎng)單層上。
C.37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
(5)凍存和復(fù)蘇同步驟1的(5)。
實(shí)施例2、以人膀胱癌上皮細(xì)胞T24為滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞一、T24滋養(yǎng)層細(xì)胞的制備除了實(shí)驗(yàn)材料中的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液外，其它實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法均同實(shí)施例1的步驟一。
細(xì)胞為人膀胱癌上皮細(xì)胞T24(美國(guó)ATCC公司，ATCC no.HTB-4TM)；細(xì)胞培養(yǎng)液為T24細(xì)胞培養(yǎng)液在高糖DMEM(Hyclone公司的產(chǎn)品，貨號(hào)為SH30243.01)中添加胎牛血清和硫代甘油(MTG)，使胎牛血清的質(zhì)量百分含量為20％，使硫代甘油的含量為3.0×10-4mol/L。
二、已建系的胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)除了滋養(yǎng)層細(xì)胞為人膀胱癌上皮細(xì)胞T24、細(xì)胞培養(yǎng)液為T24細(xì)胞培養(yǎng)液外，其它實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法均同實(shí)施例1的步驟二。
結(jié)果表明，以用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細(xì)胞T24作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，與未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細(xì)胞T24作為為滋養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)復(fù)蘇或傳代的小鼠胚胎干細(xì)胞，2天后均觀察到mES有胚胎干細(xì)胞樣小集落出現(xiàn)，3-4天增大。圖2顯示的是用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細(xì)胞T24作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)2天的小鼠胚胎干細(xì)胞R1照片。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法培養(yǎng)2天的小鼠胚胎干細(xì)胞R1相同。
實(shí)施例3、以ECV-304或人膀胱癌上皮細(xì)胞T24作為滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)的mES干性標(biāo)記分子檢測(cè)。
一.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)mES干性分子標(biāo)記在mRNA水平表達(dá)1.小鼠胚胎干細(xì)胞干性分子(標(biāo)記分子)轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4，Nanog，Sox2。
2.RT-PCR反應(yīng)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA使用通用引物OligodT，PCR擴(kuò)增上述基因引物序列分別是OctP15’AATGCCGTGAAGTTGGAG3’，OctP25’GAAGCGACAGATGGTGGT3’；NanogP15’GCCCTGATTCTTCTACCA3’，NanogP25’AGATGCGTTCACCAGATAG3’；Sox2P15’CCCGTGGTTACCTCTTCC3’，Sox2P25’TTCTCCAGTTCGCAGTCC3’；內(nèi)參基因β-actin P15’GCTGTCCCTGTATGCCTCT3’，β-actin P25’TTGATGTCACGCACGATTT3’。其中，OctP1和OctP2是擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4的引物，NanogP1和NanogP2是擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子Nanog的引物，Sox2P1和Sox2P2是擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子Sox2的引物。
3.收集在上述ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞或人膀胱癌上皮細(xì)胞T24中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1，常規(guī)方法提取細(xì)胞總RNA，并按照常規(guī)方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件如下94℃4分鐘變性；(94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒)40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析。
同時(shí)以按照下述方法得到的傳統(tǒng)mES培養(yǎng)體系培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞R1作為對(duì)照(1)用絲裂霉素-C或γ-射線處理已生長(zhǎng)成片的MEF飼養(yǎng)細(xì)胞，制備成飼養(yǎng)單層。制備方法同實(shí)施例1。
(2)將已培養(yǎng)2～3d、生長(zhǎng)旺盛的胚胎干細(xì)胞R1克隆消化成單細(xì)胞懸液。消化方法同實(shí)施例1。
(3)添加胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM中添加15％小牛血清(FBS)、1000IU/ml LIF、0.1mMβ-琉基乙醇(β-ME)或0.15mM單硫甘油(monothioglycerol)、2mM L-谷氨酰胺、2mM非必需氨基酸、青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml，以1∶3～1∶6比例轉(zhuǎn)種到新的飼養(yǎng)單層上。
(4)37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
結(jié)果表明，在下述滋養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1中，均擴(kuò)增得到198bp的Oct3/4條帶，383bp的Nanog條帶和221bp的Sox2條帶a、在未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細(xì)胞；b、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細(xì)胞；c、未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細(xì)胞T24作為滋養(yǎng)層細(xì)胞；d、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細(xì)胞T24作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。說(shuō)明在上述滋養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1有Oct3/4，Nanog，Sox2分子的表達(dá)。傳統(tǒng)mES培養(yǎng)體系和本發(fā)明的mES培養(yǎng)體系培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞仍具有相同的干性。
圖3顯示的是未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞中，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1。圖3中，mES傳統(tǒng)mES培養(yǎng)體系培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞R1；co-mES未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細(xì)胞為滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞R1。
二.細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)干性標(biāo)記分子在蛋白質(zhì)水平表達(dá)(1)小鼠胚胎干細(xì)胞干性分子Oct3/4，SSEA-1。
(2)檢測(cè)用抗體鼠源抗鼠Oct3/4單克隆抗體(R&D公司，Cat No.MAB1759)；鼠源抗鼠SSEA-1單克隆抗體(R&D公司，Cat No.MAB2155)；FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG(北京中杉金橋公司，Cat No.ZF-0304)。
(3)收集在上述滋養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞，按細(xì)胞免疫熒光常規(guī)操作染mES，并用DAPI染細(xì)胞核。
結(jié)果表明，在下述滋養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1中，均有Oct3/4和SSEA-1分子的表達(dá)a、在未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細(xì)胞；b、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細(xì)胞；c、未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細(xì)胞T24作為滋養(yǎng)層細(xì)胞；d、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細(xì)胞T24作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。
圖4A顯示的是，未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1中的Oct3/4的免疫熒光檢測(cè)照片；圖4B顯示的是，未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1中的SSEA-1的免疫熒光檢測(cè)照片；圖4C顯示的是，用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1中的Oct3/4的免疫熒光檢測(cè)照片；圖4D顯示的是，用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1中的SSEA-1的免疫熒光檢測(cè)照片。
圖4A和圖4C為細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)mES干性標(biāo)記分子Oct3/4一抗為鼠源抗鼠Oct3/4單克隆抗體，二抗為FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG；DAPI為染色體染料。左側(cè)圖片為用FITC標(biāo)記的Oct3/4的熒光圖像，中間的圖片為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核圖像，右側(cè)圖片為其左邊兩張圖像的疊加。
圖4B和圖4D為細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)mES干性標(biāo)記分子SSEA-1一抗為是鼠源抗鼠SSEA-1單克隆抗體，二抗為FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG；DAPI為染色體染料。左側(cè)圖片為用FITC標(biāo)記的SSEA-1的熒光圖像，中間的圖片為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核圖像，右側(cè)圖片為其左邊兩張圖像的疊加。
實(shí)施例4、以ECV-304或人膀胱癌上皮細(xì)胞T24作為滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)的mES多能性分析一.胚胎體(embry body，EB)形成實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)材料EB培養(yǎng)液基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM，加入15％胎牛血清，50ng/ml ascorbic acid(維生素A)，0.5％-1％iron-saturated transferrin(鐵離子飽和的運(yùn)鐵蛋白)，3.0×10-4M MTG，2mM谷氨酰胺，青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml。上述百分含量均為質(zhì)量百分含量。
低黏附力φ6cm培養(yǎng)皿BRAND公司，Cat No.452010。
2、制備EB。為去除混合在mES中的ECV-304細(xì)胞，將在上述滋養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1用消化液消化成單個(gè)細(xì)胞，PBS洗一次，用含10％小牛血清的DMEM重懸細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到普通的φ6cm培養(yǎng)皿中，37℃、5％(體積比)CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置15分鐘，小心吸取懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的φ6cm培養(yǎng)皿中，重復(fù)操作一次。再小心吸取懸浮細(xì)胞(因ECV-304細(xì)胞較mES更易貼壁，兩次沉降后，去除了ECV-304細(xì)胞，懸浮的細(xì)胞是mES)，計(jì)數(shù)后，離心，改用EB培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。按照1.8-3.0×104個(gè)/φ6cm培養(yǎng)皿，將細(xì)胞接種在低黏附力φ6cm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿至少加入6ml EB培養(yǎng)液。結(jié)果表明，懸浮培養(yǎng)3-5天后，在下述滋養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1均形成胚胎體(mEB)a、在未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細(xì)胞；b、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細(xì)胞；c、未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細(xì)胞T24作為滋養(yǎng)層細(xì)胞；d、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細(xì)胞T24作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。
圖5顯示的是在用絲裂霉素-C處理的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1在EB培養(yǎng)液培養(yǎng)4天后的EB。
3、Real-time RT-PCR檢測(cè)形成EB的三個(gè)胚層標(biāo)記分子(1)三個(gè)胚層標(biāo)記分子內(nèi)胚層標(biāo)記分子Sox17；中胚層標(biāo)記分子Brachyury(T)；外胚層標(biāo)記分子Neuro D。
(2)RT-PCR反應(yīng)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA使用通用引物OligodT，PCR擴(kuò)增Sox17基因的引物是Sox17P15’GCGGACTACAGCAGACAGG 3’和Sox17P25’AGCCACAAATGCCACAAG 3’；PCR擴(kuò)增Brachyury(T)基因的引物是TP15’TCCCAGACCTACAGCACC 3’和TP25’CATCCACATTGTTCACCC 3’；PCR擴(kuò)增Neuro D基因的引物是NeuP15’CTGCTGAGTCTCGGGATAGTGT 3’和NeuP25’TAGGGTGAAGGCGTTTGG 3’。PCR擴(kuò)增內(nèi)參基因β-actin的引物是β-actin P15’GCTGTCCCTGTATGCCTCT3’，β-actin P25’TTGATGTCACGCACGATTT3’。
(3)收集培養(yǎng)3-5天的EB，PBS洗一次，用0.25％胰酶37℃消化10-15分鐘，制備單細(xì)胞懸液。提取總RNA。并按照常規(guī)方法進(jìn)行Real-time RT-PCR擴(kuò)增。
結(jié)果表明，在下述滋養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1形成的胚胎體中，均有上述三個(gè)胚層的標(biāo)記分子的表達(dá)a、在未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細(xì)胞；b、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304作為滋養(yǎng)層細(xì)胞；c、未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細(xì)胞T24作為滋養(yǎng)層細(xì)胞；d、用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的人膀胱癌上皮細(xì)胞T24作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。
圖6A顯示的是未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1來(lái)源的mEB，Neuro D在不同分化時(shí)間的表達(dá)譜；圖6B顯示的是未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1來(lái)源的mEB，Sox17在不同分化時(shí)間的表達(dá)譜；
圖6C顯示的是未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1來(lái)源的mEB，Brachyury(T)在不同分化時(shí)間的表達(dá)譜；圖6A-C中，co2d、co3d、co4d、co5d-表示未用絲裂霉素-C處理或γ-射線照射的ECV-304滋養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)20代的小鼠胚胎干細(xì)胞R1來(lái)源的mEB在2天、3天、4天和5天中三種基因的表達(dá)；縱坐標(biāo)為檢測(cè)基因與內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的方法，是在滋養(yǎng)層細(xì)胞上，用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞，其特征在于所述滋養(yǎng)層細(xì)胞為上皮或內(nèi)皮細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述上皮細(xì)胞來(lái)源于人膀胱上皮組織；所述內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源于人臍靜脈。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于所述上皮細(xì)胞來(lái)源于人膀胱癌上皮細(xì)胞系；所述內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；所述內(nèi)皮細(xì)胞包括已建系的內(nèi)皮細(xì)胞和原代培養(yǎng)所獲得的內(nèi)皮細(xì)胞；所述上皮細(xì)胞包括已建系的上皮細(xì)胞和原代培養(yǎng)獲得的上皮細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的方法，其特征在于所述人膀胱癌上皮細(xì)胞系為人膀胱癌上皮細(xì)胞T24；所述人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV-304。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1至4中任一所述的方法，其特征在于所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液是在含有L-谷氨酰胺的高糖DMEM中，添加胎牛血清或小牛血清以及硫代甘油，使胎牛血清或小牛血清的質(zhì)量百分含量為10-20％，硫代甘油的含量為1.5-3.0×10-4mol/L。
6.一種用于培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)基，由滋養(yǎng)層細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液組成；所述滋養(yǎng)層細(xì)胞為上皮或內(nèi)皮細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述上皮細(xì)胞來(lái)源于人膀胱上皮組織；所述內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源于人臍靜脈。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述上皮細(xì)胞來(lái)源于人膀胱癌上皮細(xì)胞系；所述內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；所述內(nèi)皮細(xì)胞包括已建系的內(nèi)皮細(xì)胞和原代培養(yǎng)所獲得的內(nèi)皮細(xì)胞；所述上皮細(xì)胞包括已建系的上皮細(xì)胞和原代培養(yǎng)獲得的上皮細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述人膀胱癌上皮細(xì)胞系為人膀胱癌上皮細(xì)胞T24；所述人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV-304。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液是在含有L-谷氨酰胺的高糖DMEM中，添加胎牛血清或小牛血清以及硫代甘油，使胎牛血清或小牛血清的質(zhì)量百分含量為10-20％，硫代甘油的含量為1.5-3.0×10-4mo1/L。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的方法及其專用培養(yǎng)基。該培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的方法，是在滋養(yǎng)層細(xì)胞上，用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞，其中，所述滋養(yǎng)層細(xì)胞為上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。該方法中所用的培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)基由上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液組成。該胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液優(yōu)選是高糖DMEM，10－20％胎牛血清或小牛血清，1.5－3.0×10
文檔編號(hào)C12N5/06GK1995334SQ200610169528
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年12月22日
發(fā)明者周海勝, 孫曉萌, 鄧宏魁, 丁明孝 申請(qǐng)人:北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan