專利名稱：假連翹提取物、假連翹殺菌微乳劑及該微乳劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物提取物，尤其是假連翹提取物，還涉及該提取物的用途，以及 由此提取物為組分的微乳劑。
背景技術(shù)：
目前隨著人們對植物的研究開發(fā)能力逐漸加強，從植物中尋找天然活性物質(zhì)并用 于病蟲害防治是目前國際上農(nóng)藥開發(fā)的一種研究趨勢。據(jù)統(tǒng)計，世界上至少有50萬種不同 植物，其中藥用植物有11020種(含種下等級1208個)，隸屬2313屬，383種，目前已報道 過具有控制有害生物活性的高等植物達2400余種，其中具有殺蟲活性的1000多種，抗真菌 的94種，抗細菌的11種，抗病毒的17種。假連翹(Durante repens Lirm.)為馬鞭草科植物，有刺或無刺，嫩枝有毛；葉片 呈卵狀橢圓形或倒卵形，長2 6. 5厘米，寬1. 5 3厘米，邊緣在中部以上有鋸齒；花冠 呈藍色或淡藍紫色；果實成熟時橘黃色，有光澤。原產(chǎn)中、南美洲，我國華南地區(qū)廣有栽培， 由于其終年翠綠，樹形美觀，環(huán)境適應(yīng)能力較強，近年來已成為一種重要的園林綠化植物。 有研究報道假連翹的果實中含有二萜類和黃酮類化合物，有抑制凝血酶和脯氨酸基內(nèi)肽酶 (PEP)的活性。但迄今為止還未發(fā)現(xiàn)有以假連翹植物為原料，制造植物源殺菌劑的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對不足，提出一種假連翹的提取物，利用該提取物作為植物源殺菌劑的 主要成分；同時還提出了以該提取物為主要成分的假連翹微乳劑和水乳劑，以及上述兩種 乳劑的制備工藝。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案假連翹提取物，以假連翹的 莖、葉、花或果實為原料，采用有機溶劑進行提取，對提取液進行濃縮，得假連翹提取物。本發(fā)明中采用假連翹藥材的不同部位，如莖、葉、花或果實，作為提取的原料，經(jīng)有 機溶劑進行浸泡或其它處理方式來提取，將原料中的有效成分萃取出來，然后對提取液濃 縮，如常壓或減壓蒸餾，即可得到假連翹的提取物。該假連翹提取物的原料來源廣泛，提取 方式簡單，適宜于廣泛使用和推廣。本發(fā)明還提出了假連翹提取物在制備預(yù)防和治療胡椒瘟病菌、香蕉枯萎病菌或芒 果炭疽病菌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明又提供了采用假連翹提取物作為主要有效成分的假連翹殺菌微乳劑，由重 量百分比如下的組分構(gòu)成假連翹提取物10 30%溶劑5 20%助溶劑5 10%乳化劑10 20%余量為水；
其中，所述溶劑或助溶劑選自石油醚、乙酸乙酯、丙酮、環(huán)己酮、二甲基甲酰胺、二 甲亞砜、無水乙醇、異丙醇、甲醇中的一種或幾種；所述乳化劑選自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、二芐基聯(lián) 苯基聚氧乙烯醚、苯乙樟苯酚甲醛樹脂聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基苯磺酸鈣 和十二烷基苯磺酸鈉中的一種或幾種。在上述假連翹殺菌微乳劑的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了該微乳劑的制備方法，包括 以下步驟a、按配方稱取各組分；b、將假連翹提取物加入到溶劑和助熔劑中攪拌，制成油相液體待用；c、將乳化劑和水混合均勻，在攪拌下，將步驟b中的油相液體緩慢加入水相，常溫 攪拌lh后停止，靜置lh，即得假連翹殺菌微乳劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的假連翹提取物對疫霉引起的病害具有較好的保護效 果，尤其對胡椒瘟病保護效果顯著。該殺菌劑中的活性化合物是天然存在的物質(zhì)，來源于自 然，在長期的進化過程中已形成了其固有的參與能量與物質(zhì)循環(huán)代謝途徑，所以施用于環(huán) 境中或植物上，無殘留，不會引起生物富集；對非把靶標生物相對安全；且制造工藝簡單， 原料易得，成本低廉，符合目前農(nóng)藥的發(fā)展趨勢，具有廣闊的推廣應(yīng)用潛力。
具體實施例方式一種假連翹提取物，以假連翹的莖、葉、花或果實為原料，采用有機溶劑進行提取， 對提取液進行濃縮，得假連翹提取物。優(yōu)選的，所述原料在室溫下晾5 10天后，放入55 60°C恒溫箱內(nèi)烘干至含水量 小于10%，粉碎。將原料進行干燥粉化，增大了原料與有機溶劑的接觸面，更有利于原料中 的有效成分被提取出來。優(yōu)選的，所述提取為向原料中加入5 15倍量的有機溶劑，采用水浴加熱提取。為 使原料中有效成分能充分提取，有機溶劑的用量為原料重量的5 15倍體積量；采用水浴 加熱能避免局部過熱現(xiàn)象，防止原料燒糊，影響產(chǎn)品最終質(zhì)量。優(yōu)選的。所述提取分3次進行，每次提取時間分別為72小時，48小時，24小時，合 并3次提取液。采用3次提取，能有效地將有效成分盡可能地完全提取。優(yōu)選的，所述有機溶劑選自石油醚、乙酸乙酯、丙酮、無水乙醇和甲醇中的一種或 多種。上述有機溶劑由于具有微毒或無毒的特性，適宜于廣泛應(yīng)用。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細描述，本部分的描述僅是示范性和解釋 性，不應(yīng)對本發(fā)明的保護范圍有任何的限制作用。實施例1假連翹提取物的制備將采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所內(nèi)的新鮮假連翹，取其莖、葉、花或果 實，在室溫下晾5 10天后放入55 60°C恒溫烘箱內(nèi)烘干，至含水率低于10%，粉碎，過 孔徑60目篩，加入約10倍量(W/V)的溶劑，重復(fù)3次提取，合并提取液，經(jīng)減壓干燥濃縮得 假連翹提取物浸膏。上述原料還可采用假連翹的莖、葉、花和果實中的多種進行混合，操作步驟同上。1. 1提取溶劑的選擇
準確稱取等重量假連翹干粉樣6份，分別加入10倍量(W/V)的丙酮、乙酸乙酯、無 水乙醇、甲醇、乙酸乙酯和無水乙醇(混合I)、丙酮和甲醇(混合II)，采用水浴加熱提取的 方法分別提取72h，48h，24h，合并3次提取液，減壓濃縮，得假連翹不同溶劑提取物，并測定 其對胡椒瘟病菌菌絲生長的抑菌活性。表1假連翹不同溶劑提取物對胡椒瘟病菌的抑菌率 結(jié)果見表1。從表1中可以看出，在供試濃度下，乙醇提取溶劑制備的假連翹提取 物對胡椒瘟病菌的抑菌率最高，為28. 62%。因此，制備假連翹提取物的提取溶劑選擇無水乙醇。1. 2提取方法的篩選準確稱取等重量假連翹干粉樣三份，分別加入10倍量(W/V)上述篩選的溶劑，采 用水浴加熱提取、超聲波浸提、冷浸提三種方法制備假連翹提取物，并測定其對胡椒瘟病菌 菌絲生長的抑菌活性。表2假連翹不同提取方法對胡椒瘟病菌的抑菌率 結(jié)果見表2。從表2中可以看出，在無水乙醇為提取溶劑下采用水浴加熱提取法制 備的假連翹提取物對胡椒瘟病菌的抑菌活性較好，抑菌率達到了 91.71%。因此，制備假連 翹提取物的方法選擇無水乙醇水浴加熱提取法。實施例2由于提取過程不同只影響假連翹的提取程度，并不影響假連翹提取物的性能，下 面就以假連翹無水乙醇提取物對供試病原菌的抑菌活性測定。2. 1對供試病原菌菌絲生長抑制活性的測定2. 1. 1供試菌株胡椒瘟病菌(Phytophthora capsici)由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所植 保中心提供；香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口 實驗站提供；芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境 與植物保護研究所提供。2. 1. 2實驗方法
采用菌絲生長速率抑制法，植物提取物重復(fù)3次。具體做法為準確稱取實施例1 中制備的假連翹提取物0. 5g，先用1ml無水乙醇溶解，再用無菌蒸餾水定容至10ml，制成濃 度為50mg/ml的假連翹提取物乙醇溶液。然后將培養(yǎng)基融化并冷卻至50°C左右時，把4ml 濃度為50mg/ml的假連翹提取物乙醇溶液與36ml/瓶的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(簡稱為 PDA培養(yǎng)基)混合，搖勻后，迅速倒入3個直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，待其凝固后，取菌落直徑 為5mm、培養(yǎng)好的各供試病原菌的外層菌塊放置于培養(yǎng)皿中央，以加入等體積無水乙醇滅菌 水的PDA培養(yǎng)平板為對照，每個處理做3個皿重復(fù)。接種后，在人工氣候培養(yǎng)箱(25 28°C ) 下培養(yǎng)5天后，采用十字交叉法分別測量菌落直徑，求其平均值，按下式計算抑菌率。菌落直徑(cm)=測量菌落直徑平均值
抑菌率(％)＝對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑/對照菌落生長直徑xlOO結(jié)果見表3。從表3可以看出，在假連翹無水乙醇提取物濃度為5mg/ml下，對胡椒 瘟病菌菌絲生長的抑菌活性最好，抑菌率達到了 86. 87% ；對香蕉枯萎病菌和芒果炭疽病菌 抑菌活性較差，抑菌率分別為30. 04%和24. 17% ；對芒果蒂腐病菌無抑菌活性。表3假連翹提取物對供試病原菌的抑菌率測定 2. 2對供試病原菌孢子萌發(fā)抑制活性的測定2. 2. 1供試孢子懸浮液由2. 1結(jié)果可以看出假連翹無水乙醇提取物對胡椒瘟病菌菌絲生長抑菌活性較 好，因此，進一步測定其對胡椒瘟病菌孢子萌發(fā)的抑制作用。首先將胡椒瘟病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后，取邊緣菌餅轉(zhuǎn)接于燕麥培養(yǎng)基上 使其產(chǎn)孢，并配置孢子懸浮液備用。2. 2. 2實驗方法將實施例1中制備的假連翹提取物用滅菌水稀釋至2個濃度，每濃度重復(fù)3次，具 體方法為將假連翹提取物用滅菌水稀釋為100mg/ml和50mg/ml，以滅菌水為空白對照，每 處理重復(fù)3次。將孢子懸浮液與供試藥劑的不同濃度按1 1的比例混合均勻后，滴加1 滴于滅菌的凹玻片上，28°C培養(yǎng)6 12h，當空白對照的孢子萌發(fā)率達到80%以上時，在顯 微鏡下檢查200個孢子的萌發(fā)情況，計算各供試藥劑的孢子萌發(fā)抑制率。
孢子萌發(fā)擺率=對照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率/對照萌發(fā)率x100％ 結(jié)果見表4。表4假連翹提取物對胡椒瘟病菌孢子萌發(fā)的抑制活性測定
從表4可以看出，假連翹提取物對胡椒瘟病菌孢子萌發(fā)也具有一定的抑制活性。 在濃度為10mg/ml時對孢子萌發(fā)的抑制率達到了 50%以上，為62. 89%。2. 3對胡椒瘟病菌的室內(nèi)抑菌毒力測定準確稱取實施例1中制備的假連翹提取物浸膏，用無水乙醇和滅菌水一定比例配 成8、6、5、4、3、2mg/ml等6個系列濃度的藥液，按上述的菌絲生長速率法進行測定。實驗重 復(fù)3次，建立毒力回歸方程。將抑菌率轉(zhuǎn)換成幾率值，濃度轉(zhuǎn)換成對數(shù)，進行幾率值分析，求 出假連翹無水乙醇提取物對胡椒瘟病菌的抑制中濃度(EC50)。結(jié)果見表5。表5假連翹提取物對胡椒瘟病菌的室內(nèi)抑菌毒力測定 從表5可以看出，假連翹無水乙醇提取物對胡椒瘟病菌的抑菌毒力較低。在相關(guān) 系數(shù)為0. 9718時，提取物對胡椒瘟病菌的EC50為1. 4951mg/ml, EC90為6. 2522mg/ml。實施例3 20%假連翹殺菌微乳劑的制備準確稱取實施例1中制備的假連翹提取物浸膏20kg，溶于15kg無水乙醇和5kg 甲醇的混合溶液中，充分攪拌，然后加入20kg的乳化劑Tween-20，攪拌均勻后，在高剪切機 的作用下，逐步加入自來水40kg，在常溫攪拌一定時間后停止，靜置，即得20%假連翹微乳 劑。實施例4 10%假連翹殺菌微乳劑的制備準確稱取實施例1中制備的假連翹提取物浸膏10kg，溶于20kg 二甲基甲酰胺和 10kg乙酸乙酯的混合溶液中，充分攪拌，然后加入20kg的乳化劑十二烷基苯磺酸鈣和十二 烷基苯磺酸鈉，攪拌均勻后，在高剪切機的作用下，逐步加入自來水40kg，在常溫攪拌一定 時間后停止，靜置，即得10%假連翹微乳劑。實施例5 30%假連翹殺菌微乳劑的制備準確稱取實施例1中制備的假連翹提取物浸膏30kg，溶于10kg石油醚和5kg 二甲 亞砜的混合溶液中，充分攪拌，然后加入15kg的乳化劑苯乙樟苯酚甲醛樹脂聚氧乙烯醚， 攪拌均勻后，在高剪切機的作用下，逐步加入自來水40kg，在常溫攪拌一定時間后停止，靜 置，即得30%假連翹微乳劑。實施例6假連翹殺菌乳劑的保護和治療作用測定6. 1供試藥劑
實施例3 5制備的假連翹殺菌微乳劑；烯酰 錳鋅WP (山東圣鵬農(nóng)藥有限公司生產(chǎn))6. 2供試作物及防治對象供試作物胡椒(Piper nigrum Linn.)，品種為印尼大葉種；防治對象胡椒癌病(Phytophthora capsici)。6. 3試驗方法保護作用測定方法采摘健康、新鮮、葉齡相同的胡椒嫩葉(直徑不大于9cm)，洗 凈放于吸水紙上晾干；將假連翹殺菌微乳劑分別稀釋為50和100倍，烯酰 錳鋅WP配制成 2000和4000倍，以及不含有效成分的空白對照。先于嫩葉上施藥，晾干藥液后，用接種針將 3塊直徑為5mm的胡椒瘟病菌菌餅等距離接在葉子正面，每皿1片嫩葉，正面朝上放于培養(yǎng) 皿中，然后于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后測量各處理的病斑生長直徑。按下式計算保護 效果。病斑直徑=測量直徑-5mm
im生丨丨安,G/、對照病斑生長直徑-處理病斑生長直徑inn 抑制軍(%) =-^㈣…T、T+ .. ^^-xlOO
對照病斑生長直徑治療作用測定方法先于嫩葉上接種菌餅，放于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 3天， 測量各嫩葉上病斑生長直徑dl后施藥，施藥后再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后測量各處 理的病斑生長直徑d2，按下式計算治療效果。病斑直徑增長量(mm)
、盧廣鄭里 、對照病斑直徑增長量_處理病斑直徑增長量 治療效果(％):--xlOO
對照病斑直徑增長量6. 4結(jié)果與分析結(jié)果見表6;表6供試藥劑對胡椒瘟病菌的保護和治療效果
8供試藥劑 實施例3 實施例4
實施例5
烯酰.錳鋅
WP 溶劑對照
稀釋保護作用治療作用倍數(shù)病斑直徑(cm)保護效果(；％；)病斑增長量(cm)治療效果(％)500.5577.550.937.061001.2250.201.1122.38500.4183.270.8143.361001.0357.961.0427.27500.4880.410.8639.861001.2349.801.0824.4820000100.000.3575.5240000.2291.020.5263.64一2.45一1.43一從表6可以看出，假連翹殺菌微乳劑在稀釋50倍和100倍時，對胡椒瘟病的保護 作用分別達到了 77%以上和49%以上，說明假連翹殺菌微乳劑對胡椒瘟病具有較好的保 護作用。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來 說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種假連翹提取物，以假連翹的莖、葉、花或果實為原料，采用有機溶劑進行提取，對提取液進行濃縮，得假連翹提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的假連翹提取物，其特征在于所述原料在室溫下晾5 10天 后，放入55 60°C恒溫箱內(nèi)烘干至含水量小于10%，粉碎。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的假連翹提取物，其特征在于所述提取為向原料中加入5 15倍量的有機溶劑，采用水浴加熱提取。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的假連翹提取物，其特征在于所述提取分3次進行，每次提取 時間分別為72小時，48小時，24小時，合并3次提取液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、3或4所述的假連翹提取物，其特征在于所述有機溶劑選自石油 醚、乙酸乙酯、丙酮、無水乙醇和甲醇中的一種或多種。
6.假連翹提取物在制備預(yù)防和治療胡椒瘟病菌、香蕉枯萎病菌或芒果炭疽病菌的藥物 中的應(yīng)用。
7.一種假連翹殺菌微乳劑，由重量百分比如下的組分構(gòu)成假連翹提取物10 30%溶劑5 20%助溶劑5 10%乳化劑10 20%余量為水。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的假連翹殺菌微乳劑，其特征在于所述溶劑或助溶劑選自石 油醚、乙酸乙酯、丙酮、環(huán)己酮、二甲基甲酰胺、二甲亞砜、無水乙醇、異丙醇、甲醇中的一種 或幾種；
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的假連翹殺菌微乳劑，其特征在于所述乳化劑選自聚氧乙烯 失水山梨醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、二芐基聯(lián)苯基聚氧乙烯醚、苯乙樟苯酚甲醛樹 脂聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基苯磺酸鈣和十二烷基苯磺酸鈉中的一種或幾 種。
10.一種如權(quán)利要求7所述假連翹殺菌微乳劑的制備方法，包括以下步驟a、按配方稱取各組分；b、將假連翹提取物加入到溶劑和助熔劑中攪拌，制成油相液體待用；c、將乳化劑和水混合均勻，在攪拌下，將步驟b中的油相液體緩慢加入水相，常溫攪拌 1小時后停止，靜置1小時，即得假連翹殺菌微乳劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種假連翹提取物，以假連翹的莖、葉、花或果實為原料，采用有機溶劑進行提取，對提取液進行濃縮，得假連翹提取物。該提取物再和溶劑、農(nóng)藥助劑配制成假連翹殺菌微乳劑。本發(fā)明的假連翹殺菌微乳劑兌水后葉面噴霧或灌根施用，使用方便，對多種熱帶經(jīng)濟作物上主要病害有較好防治效果，尤其是對胡椒瘟病保護效果突出。該制劑的活性成分是天然存在的物質(zhì)，來源于自然，對人、畜無毒，無殘留，對非把靶標生物相對安全，加工工藝簡單，原料易得，成本低，符合目前農(nóng)藥發(fā)展的方向，具有良好的開發(fā)應(yīng)用潛力。
文檔編號A01N25/04GK101856037SQ20101021606
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者劉愛勤, 孫世偉, 李志剛, 桑利偉, 茍亞峰, 譚樂和 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所