專利名稱：在植物腺毛特異表達(dá)的紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉 及一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的基因啟動(dòng)子，具體是一種在植物腺毛特異表達(dá)的紫穗槐二烯(Artemisinic Aldehyde Delta-Il (13)Reductase)基因啟動(dòng)子。
背景技術(shù)：
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素是從其地上部分分離出的一種含有過(guò)氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯化合物，是目前世界上公認(rèn)的最有效的治療瘧疾藥物，特別是對(duì)腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾更加有效。目前，世界衛(wèi)生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯(lián)合療法(ACTs)。另外，隨著對(duì)青蒿素藥理研究的逐步深入， 科學(xué)家發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)的功能，可見(jiàn)青蒿素是一種極具潛力的天然藥物。目前青蒿素的主要來(lái)源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，為0. 01 % -1 %，低含量使得青蒿素的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到了限制。由于青蒿素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成難度大、產(chǎn)量低、成本高，因此人工生產(chǎn)缺乏可行性。也有人嘗試用組織培養(yǎng)和細(xì)胞工程的方法來(lái)生產(chǎn)青蒿素，然而青蒿素在愈傷組織中的含量低于干重的0. 1%，在芽中含量最高也只有干重的0. 16%，大多數(shù)研究沒(méi)有檢測(cè)到青蒿素。因此，利用組織培養(yǎng)及細(xì)胞工程來(lái)生產(chǎn)青蒿素的也不具備可行性。Dahua Chen等在《Plant Science))(植物科學(xué))2000 年 155 期 179-185 頁(yè)發(fā)表了題為 “Expression of a chimeric farnesyl diphosphate synthase gene in Artemisia annua L. transgenic plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，，(通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在青蒿植株中表達(dá)法尼基焦磷酸合酶基因)的論文，文中評(píng)述，通過(guò)過(guò)量表達(dá)法尼基焦磷酸合酶 (farnesyl diphosphate synthase,FPS)可在原有基礎(chǔ)上提高青蒿素含量2倍_3倍，達(dá)到左右。紫穗槐二烯是從青蒿腺毛特異cDNA文庫(kù)中分離出的一個(gè)編碼紫穗槐二烯還原酶的基因。隨著青蒿素生物合成途徑的逐漸清晰，采用基因工程手段提高青蒿中青蒿素含量具有非常大的潛力，例如過(guò)量表達(dá)代謝途徑中的青蒿素合成途徑關(guān)鍵酶編碼基因被證實(shí)是一種提高青蒿素含量的有效方法。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的啟動(dòng)子大多數(shù)是組成性的啟動(dòng)子，例如煙草花葉病毒35S啟動(dòng)子(CaMV35)。這種啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在所有的組織和器官中表達(dá)，可能會(huì)對(duì)植物的正常生長(zhǎng)造成一定的負(fù)擔(dān)和危害。由于腺毛不是植物生長(zhǎng)所必需的，利用腺毛特異表達(dá)的啟動(dòng)子對(duì)植物的腺毛系統(tǒng)進(jìn)行遺傳操作不會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成危害。先前的研究表明紫穗槐二烯基因在青蒿腺毛中大量表達(dá)，而在其它組織中表達(dá)量很低，這暗示紫穗槐二烯的啟動(dòng)子很可能是腺毛特異表達(dá)的啟動(dòng)子。 因此，克隆紫穗槐二烯基因的啟動(dòng)子對(duì)利用植物腺毛組織表達(dá)和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種具有重要意義?？寺∑鋯?dòng)子將為研究紫穗槐二烯基因的表達(dá)調(diào)控、分析啟動(dòng)子上的順式作用元件奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種在植物腺毛特異表達(dá)的紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子。本發(fā)明的基因啟動(dòng)子能引導(dǎo)基因在轉(zhuǎn)基因植物腺毛中特異表達(dá)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及在植物腺毛特異表達(dá)的紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子具有序列表中SEQ IDN0. 1的2422bp的核苷酸序列。所述紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子能引導(dǎo)基因在植物腺毛中特異表達(dá)。所述紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子能在利用植物腺毛組織表達(dá)和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種中應(yīng)用。所述的在植物腺毛特異表達(dá)的紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子，其制備方法如下步驟一，培養(yǎng)青蒿無(wú)菌苗；步驟二，采用CTAB法提取青蒿總DNA ；步驟三，Genomic DNAffalking法克隆啟動(dòng)子基因組序列；步驟四，分析啟動(dòng)子上的順式作用元件；步驟五，紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子的載體構(gòu)建；步驟六，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化青蒿；步驟七，啟動(dòng)子所引導(dǎo)的gus報(bào)告基因在植株中的表達(dá)部位的確定。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明克隆得到的紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子，可以特異性地在腺毛組織啟動(dòng)并高效表達(dá)外源基因，能應(yīng)用于利用植物腺毛組織表達(dá)和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種中。本發(fā)明涉及的根癌農(nóng)桿菌EHA105已在《黃亞麗，蔣細(xì)良，田云龍，郭萍，朱昌雄；根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的哈茨木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究，中國(guó)生物工程雜志，2008，觀(3) :38-43》文獻(xiàn)中公開。根癌農(nóng)桿菌EHA105可通過(guò)公開市售的商業(yè)渠道取得，如可以從澳大利亞CAMBIA 公司購(gòu)得，菌株編號(hào)為Gambarl。


圖1為5’端啟動(dòng)子與gus基因融合的植物雙元表達(dá)載體示意圖。圖2為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化青蒿；圖中A為Kan抗性叢生芽，B為Kan抗性再生青蒿植株，C為可供檢測(cè)的植株。圖3為轉(zhuǎn)基因青蒿植株的PCR檢測(cè)結(jié)果。圖4為啟動(dòng)子所引導(dǎo)的gus報(bào)告基因在植株中的表達(dá)部位的確定；圖中A為沒(méi)有進(jìn)行GUS組織染色得青蒿葉片；B為利用紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子同gus基因融合的載體轉(zhuǎn)化青蒿后，PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的青蒿植株，所獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中的 ⑶S組織染色；C為非轉(zhuǎn)基因的青蒿植株的對(duì)照組，取其葉片進(jìn)行⑶S組織染色。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)見(jiàn) New York Co Id Spring Harbor LaboratoryPress的1989年版中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例步驟一，培養(yǎng)青蒿無(wú)菌苗青蒿種子用75% (ν/ν)乙醇浸泡lmin，再用20% (w/v)NaClO浸泡20min后，無(wú)菌水沖洗3次-4次，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，接種于無(wú)激素的MS固體培養(yǎng)基上，250C、 16h/8h (light/dark)光照培養(yǎng)(14天)，即可獲得青蒿無(wú)菌苗。步驟二，CTAB法小量抽提青蒿葉片總DNA取約IOOmg 葉片于 1. 5mLEP 管中，加入預(yù)熱的 CTAB buffer 600 μ L, buffer 中含2% (ν/ν)的β-巰基乙醇，用研磨棒將葉片研磨至無(wú)明顯顆粒；將EP管置于65°C水浴 45min，使細(xì)胞充分裂解。待溶液冷卻后，加入等體積(600 μ L) 24 1 (ν/ν)的氯仿異戊醇，混勻，靜置5min，25°C、13000rpm離心IOmin ；吸取上清液約500 μ L于新的干凈的離心管中，加入等體積24 1 (ν/ν)的氯仿異戊醇，混勻，靜置5min，25°C、13000rpm離心IOmin; 吸取上清液約400 μ L于新的干凈的離心管中，加入一滴3Μ醋酸鈉溶液，然后加入等體積預(yù)冷的異丙醇混勻，_20°C靜置約30min后，25°C、13000rpm離心IOmin ；棄上清液，用75% (ν/ ν)乙醇沖洗沉淀所得DNA —次，離心后，吸干上清，通風(fēng)櫥中晾干。將DNA溶解在40μ L水中，-20°C保存。步驟三，Genomic DNA Walking法克隆啟動(dòng)子基因組序列由于TAIL-PCR只擴(kuò)增出較小片段，本研究采用Genomic DNA Walking進(jìn)一步分離紫穗槐二烯基因5，側(cè)翼序列。Genomic DNA Walking的方法參照基因組WalkerTM Universal Kit (Clontech，638904)的說(shuō)明書。具體步驟如下①「基因組酶切采用3種平末端的限制性內(nèi)切酶DraI、EcoRV和MuI分別對(duì)青蒿基因組DNA進(jìn)行酶切。反應(yīng)體系如表1:表1限制性內(nèi)切酶體系
權(quán)利要求
1.一種在植物腺毛特異表達(dá)的紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子，其特征在于，該啟動(dòng)子如SEQ ID NO. 1 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在植物腺毛特異表達(dá)的紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子，其特征是， 該啟動(dòng)子能引導(dǎo)基因在植物腺毛中特異表達(dá)。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于，該啟動(dòng)子基因工程育種中應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征是，所述的基因工程育種中應(yīng)用是指利用植物腺毛組織表達(dá)和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物。
全文摘要
一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子序列具有序列表中SEQ ID NO.1的2422bp的核苷酸序列；該啟動(dòng)子能引導(dǎo)基因在植物腺毛中特異表達(dá)，能在利用植物腺毛組織表達(dá)和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種中應(yīng)用。本發(fā)明得到的紫穗槐二烯基因啟動(dòng)子能引導(dǎo)基因在植物腺毛中特異表達(dá)，對(duì)利用植物腺毛組織表達(dá)和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種具有重要意義。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102154297SQ201110044609
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月22日
發(fā)明者唐克軒, 王玥月, 郭新波, 陳韻斐 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)