專(zhuān)利名稱(chēng)：一株生防內(nèi)生真菌-局限曲霉菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及生防內(nèi)生真菌一局限曲霉菌 (Aspergillus restrictus)的培養(yǎng)及其代謝產(chǎn)物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物體內(nèi)都存在大量的內(nèi)生真菌，內(nèi)生真菌最早發(fā)現(xiàn)于牧草，后來(lái)又在木本植物、 草本植物、禾本植物、苔蘚、地衣、海藻等植物中被發(fā)現(xiàn)。迄今的研究表明，植物內(nèi)生真菌可增強(qiáng)宿主的抗病性、提高植物的生產(chǎn)力、抗逆抗蟲(chóng)等。發(fā)揮這些作用是由于內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)繁殖和生長(zhǎng)，并在體內(nèi)產(chǎn)生有生物活性的次生代謝產(chǎn)物。因此，內(nèi)生真菌可能成為生物防治中有潛力的生物控制劑，在生態(tài)農(nóng)業(yè)和生物農(nóng)藥研制方面具有重要的用途。近年來(lái)植物內(nèi)生真菌已引起了微生物學(xué)家、生態(tài)學(xué)家、植物保護(hù)學(xué)家的廣泛興趣，逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前微生物源生物化學(xué)農(nóng)藥的研究和開(kāi)發(fā)在我國(guó)十分活躍，但微生物資源及其應(yīng)用潛力尚沒(méi)有得到充分的發(fā)揮，而植物內(nèi)生真菌即是這樣一類(lèi)有待開(kāi)發(fā)的新興微生物資源。目前對(duì)植物病害的防治，主要采用化學(xué)農(nóng)藥殺滅病原菌，但化學(xué)農(nóng)藥對(duì)人畜的毒副作用和殘留問(wèn)題至今仍難以有效的解決。利用內(nèi)生真菌產(chǎn)生的抗病原真菌的活性物質(zhì)進(jìn)行植物病原真菌病害的生物防治，則具有周期短、易于研究、便于生產(chǎn)和低毒等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明從大蒜中分離到一株生防內(nèi)生真菌，并對(duì)該菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)物進(jìn)行了抑菌作用研究。該發(fā)明為微生物源農(nóng)藥的進(jìn)一步研制和開(kāi)發(fā)提供優(yōu)良的出發(fā)菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)化學(xué)農(nóng)藥不安全與微生物源農(nóng)藥種類(lèi)較少的不足，提供一種從大蒜中分離篩選出的內(nèi)生真菌-局限曲霉菌(Aspergillus restrictus)；本發(fā)明的另一目的是提供利用該菌株代謝產(chǎn)物防治植物真菌病害的方法。本發(fā)明局限曲霉菌的分離、篩選與鑒定是于2009年4月在浙江杭州郊外菜園中采集大蒜，經(jīng)分離、純化、培養(yǎng)、發(fā)酵和活性測(cè)定等步驟獲得并保存；經(jīng)微生物分類(lèi)學(xué)鑒定為局限曲霉菌(Aspergillus restrictus)，定名為局限曲霉菌(Aspergillus restrictus) 28。該菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期2010年12月31日，保藏登記號(hào)CGMCC No.4507。局限曲霉菌28，其固體培養(yǎng)特征為菌落在PDA平板上培養(yǎng)5-7天擴(kuò)展至直徑9cm，初期白色稀疏，菌絲沿培養(yǎng)基表面匍匐生長(zhǎng)，后形成灰色，反面無(wú)色，菌絲具隔，分枝。顯微形態(tài)特征分生孢子梗頂端膨大呈頭狀；分生孢子淺灰色，近球形。本發(fā)明所述的局限曲霉菌觀，經(jīng)發(fā)酵提取可獲得對(duì)部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的代謝產(chǎn)物。本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)
一種防治水稻紋枯病或黃瓜立枯病等植物真菌病害微生物代謝產(chǎn)物的制備方法， 按以下步驟進(jìn)行(1)菌種的活化培養(yǎng)將分離保存的局限曲霉觀菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在士 1°C條件下培養(yǎng)，至菌絲覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿，用直徑為4mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用；(2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)液為每IOOOmL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，可溶性淀粉 20g，麩皮 10g，蛋白胨 8g，NH4NO3 3g，(NH4)2SO4 5g，CaCO3 5g，MgSO4 lg，每 300mL 三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液60mL ；配制后121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無(wú)菌條件下挑取1直徑為 4mm菌餅，在士 1°C條件下，搖床轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵培養(yǎng)7天；(3)發(fā)酵物提取發(fā)酵完畢，離心收集發(fā)酵上清液，用常規(guī)有機(jī)溶劑萃取，經(jīng)真空濃縮后獲得浸膏，用于抑菌活性測(cè)定。本發(fā)明的有益效果一是本發(fā)明從植物大蒜中分離篩選出代謝物對(duì)部分植物真菌病害病原菌具有較強(qiáng)抑制作用的局限曲霉觀，這為農(nóng)業(yè)上防治植物真菌病害病原菌提供了一種微生物菌株；二是本發(fā)明提供了利用局限曲霉觀發(fā)酵獲得活性代謝產(chǎn)物的方法；該代謝產(chǎn)物可應(yīng)用于植物真菌病害的防治，為農(nóng)用殺菌劑的開(kāi)發(fā)增添了新的途徑。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 (局限曲霉28的分離與篩選)本發(fā)明于2009年4月在浙江杭州郊外菜園中采集大蒜，經(jīng)表面消毒、內(nèi)生真菌分離、培養(yǎng)、發(fā)酵、活性測(cè)定以及對(duì)抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的篩選等步驟，從中獲得局限曲霉菌(Aspergillus restrictus) 28，保存。局限曲霉菌(Aspergillus restrictus)觀抑菌活性測(cè)定取經(jīng)0. 22 μ m膜過(guò)濾的發(fā)酵上清液ImL于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，與9mL冷卻至50°C的PDA培養(yǎng)基迅速混勻，冷卻后在每個(gè)培養(yǎng)基平面分別放1個(gè)直徑為4mm的黃瓜立枯病菌(lihizoctonia solani)或水稻紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris)等供試菌菌餅，菌餅接于培養(yǎng)皿中央(培養(yǎng)皿直徑為9cm)， 置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h，以無(wú)菌水處理作為對(duì)照，重復(fù)3次；采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，以下列公式計(jì)算抑制率
難生·釁=順，直徑
對(duì)照菌落直徑-4測(cè)定結(jié)果表明局限曲霉菌(Aspergillus restrictus)觀代謝產(chǎn)物對(duì)黃瓜立枯病菌和水稻紋枯病菌的抑制率分別為85%和88%。實(shí)施例2 (局限曲霉觀發(fā)酵代謝產(chǎn)物的制備方法)按以下步驟進(jìn)行(1)菌種的活化培養(yǎng)將分離保存的局限曲霉28菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在士 1°C條件下培養(yǎng)，至菌絲覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿，用直徑為4mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用；(2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)液為每IOOOmL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，可溶性淀粉 20g，麩皮 10g，蛋白胨 8g，NH4NO3 3g，(NH4)2SO4 5g，CaCO3 5g，MgSO4 lg，每 300mL 三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液60mL ；配制后121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無(wú)菌條件下挑取1直徑為4mm菌餅，在士 1°C條件下，搖床轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵培養(yǎng)7天；(3)發(fā)酵物提取發(fā)酵完畢后離心收集發(fā)酵液，采用等體積乙酸乙酯萃取，取上層，并在真空條件下濃縮至浸膏，得乙酸乙酯萃取物，供抑菌活性測(cè)定。以下實(shí)施例3、4中所述的局限曲霉觀代謝產(chǎn)物均為實(shí)施例2所制產(chǎn)品；所述產(chǎn)品的百分含量均為質(zhì)量/體積百分比。實(shí)施例3 (局限曲霉觀代謝產(chǎn)物對(duì)水稻紋枯病菌和黃瓜立枯病菌的抑制作用)(1)準(zhǔn)確稱(chēng)取局限曲霉觀代謝產(chǎn)物30mg，并加入IOmL體積的無(wú)菌水，超聲波震蕩充分溶解，最終配置成濃度為3000mg/L的母液；(2)抑菌活性測(cè)定取上述母液分別稀釋成濃度為1250mg/L、1000mg/L和500mg/L 的溶液，取各濃度溶液ImL于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，與9mL冷卻至50°C的PDA培養(yǎng)基迅速混勻(局限曲霉28代謝產(chǎn)物終濃度為125mg/L、100mg/L和50mg/L)，冷卻后在每個(gè)培養(yǎng)基平面分別放1個(gè)直徑為4mm的水稻紋枯病菌或黃瓜立枯病菌菌餅，菌餅接于培養(yǎng)皿中央(培養(yǎng)皿直徑為9cm)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h，以井R霉素藥劑和無(wú)菌水處理作為對(duì)照，重復(fù)3次；
采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，以下列公式計(jì)算抑制率
權(quán)利要求
1. 一種局限曲霉菌菌株，其特征在于，命名為局限曲霉菌(Aspergillus reStriCtUS)28，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日 2010年12月31日，保藏登記號(hào)為CGMCC No. 4507。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明所述的大蒜內(nèi)生真菌是從浙江杭州郊外菜園中采集的大蒜植物活體中采用內(nèi)生真菌微生物分離技術(shù)分離獲得的，經(jīng)微生物分類(lèi)學(xué)鑒定，命名為局限曲霉菌(Aspergillus restrictus)28，該菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期2010年12月31日，保藏登記號(hào)CGMCC No.4507。本發(fā)明最顯著的特征是該菌株液體發(fā)酵能夠產(chǎn)生對(duì)植物真菌病害病原菌如黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)和水稻紋枯病菌(Thanatephorus cucumeris)等有抑制作用的活性代謝產(chǎn)物，是農(nóng)業(yè)上重要的微生物資源。
文檔編號(hào)A01P3/00GK102191185SQ20111008820
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月8日
發(fā)明者俞曉平, 申屠旭萍, 董勝?gòu)? 邊亞琳, 郝培應(yīng), 馬正 申請(qǐng)人:中國(guó)計(jì)量學(xué)院