專利名稱：一種克服楊樹遠緣雜交障礙的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種克服楊樹遠緣雜交障礙的方法。
背景技術(shù)：
楊屬樹種根據(jù)形態(tài)特征、地理分布和雜交親合力分為5派即白楊派(Leuce 或 Poplus)、黑楊派(Aigeiros)、青楊派(Tacamahaca)、大葉楊派(Leucoides)、胡楊派 (Turanga)，白楊派又分為白楊亞派、山楊亞派，但種內(nèi)變異豐富，種間天然和人工雜種較多，使得楊樹不同派間或種間的親緣關(guān)系不同，親緣關(guān)系較近的楊樹之間容易雜交，而親緣關(guān)系較遠的楊樹存在雜交障礙。Willing R.R和ftror L. D. (1976年)研究了多種楊樹的種間雜交后，認為青、黑、大葉楊三派之間可配性高，容易雜交，而白楊派與其它四派可配性差，很難雜交，胡楊派亦然。但由于白楊派、黑楊派兩派間許多經(jīng)濟性狀優(yōu)缺點互補，因此有必要通過雜交等手段，把兩派間的優(yōu)良性狀集于一體，獲得黑白楊優(yōu)良雜種無性系。國內(nèi)外不少育種學(xué)家對黑白楊之間雜交進行研究，國外研究的主要有Knox等(1972年)所做的美洲黑楊X歐洲山楊雜交，幾乎沒有得到種子。Guris和Melttler (1976年)做了觀個組合的楊樹雜交試驗，發(fā)現(xiàn)美洲山楊與黑楊、青楊雜交嚴(yán)重不親合，授粉1 后，僅有少數(shù)花粉萌發(fā)。他們還發(fā)現(xiàn)美洲黑楊的花粉管不能進入美洲山楊的柱頭，而是在其表面扭曲生長。R0nald(1982年) 用5種白楊作母本，做了 58個組合的楊樹派間雜交試驗，發(fā)現(xiàn)用原種白楊作母本的大多數(shù)組合，花粉發(fā)芽率低，而用雜種白楊作母本的組合，花粉發(fā)芽率相對較高，所得雜種在形態(tài)上介于兩親本之間，能扦插生根。Rougier (1992年)研究美洲黑楊X銀白楊，發(fā)現(xiàn)花粉管長到花柱底部就出現(xiàn)沉積現(xiàn)象。國內(nèi)這方面的工作主要有，徐緯英(1988)用母本花粉的糖蛋白處理柱頭技術(shù)做了銀白楊X歐洲黑楊、毛白楊X歐美楊等組合的雜交，但是幼胚仍然敗育。張金風(fēng)等(1999年)進行了 21個雜交組合白楊與黑楊派間雜交試驗，結(jié)果表明，白楊派與其它派雜交沒有獲得苗木。張金風(fēng)等(2000年)利用黑楊與青楊的雜種作為中介親本，成功地得到了楊樹派間雜種。目前，急需一種有效地克服楊樹派間、楊樹派內(nèi)種間雜交不親和性的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種克服楊樹遠緣雜交障礙的方法。本發(fā)明通過處理雜交親本中母本雌蕊柱頭克服楊樹遠緣雜交障礙。本發(fā)明所提供的處理雜交親本中母本雌蕊柱頭的方法，包括如下步驟1)用正己烷的揮發(fā)氣熏所述母本的雌蕊柱頭；幻所述母本的花粉水提液涂抹經(jīng)步驟1)處理的所述母本的雌蕊柱頭；所述母本為楊屬楊樹；所述花粉水提液是用水提取所述母本的花粉得到的不含花粉粒的液體(提取液)。所述花粉水提液制備過程中，所述提取在20-25°C進行。
可按照如下方法用正己烷的揮發(fā)氣熏所述母本的雌蕊柱頭將雌花序豎直伸入盛有液態(tài)正己烷的內(nèi)徑(mm)X長度(mm)為20mmX 180mm的試管中，液態(tài)正己烷的高度為 30-40mm，雌花序的頂端距正己烷液面的垂直距離是110_130mm，用正己烷的揮發(fā)氣熏雌蕊柱頭5 IOmin0所述花粉水提液按照包括如下步驟的方法制備將所述母本的花粉用水提取 50-70min后收集不含花粉粒的液體，該液體即為花粉水提液。所述提取中所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與20-30ml蒸餾水混合。所述方法具體可為所述提取的時間為60min、所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與25ml蒸餾水混合，所述用正己烷的揮發(fā)氣熏所述母本的雌蕊柱頭的時間為8min。所述方法還可具體為所述提取的時間為70min、所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與30ml蒸餾水混合，所述用正己烷的揮發(fā)氣熏所述母本的雌蕊柱頭的時間為IOmin。所述方法還可具體為所述提取的時間為50min、所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與20ml蒸餾水混合，所述用正己烷的揮發(fā)氣熏所述母本的雌蕊柱頭的時間為5min。本發(fā)明所提供的處理雜交親本中母本雌蕊柱頭的方法可應(yīng)用于楊屬白楊派或黑楊派，如中國山楊(Populus davidiana)、美洲黑楊(Populus deltoides)。本發(fā)明所提供的處理雜交親本中母本雌蕊柱頭的方法還應(yīng)可用于楊樹派間或派內(nèi)種間雜交育種，尤其適合于楊屬白楊派與黑楊派楊樹之間的雜交育種。本發(fā)明還提供一種楊樹雜交育種方法，包括如下步驟將雌蕊柱頭經(jīng)過上述方法處理的楊樹母本與作為父本的楊樹雜交，得到雜交種；所述雜交的母本為楊屬白楊派楊樹或山楊亞派楊樹，具體可為中國山楊(Populus davidiana)；所述步驟Α)是在所述母本花序露出苞片2_3厘米時用正己烷的揮發(fā)氣熏所述母本的雌蕊柱頭；所述雜交的父本為楊屬黑楊派楊樹，具體可為美洲黑楊(Populus deltoides)。本發(fā)明的處理雜交親本中母本雌蕊柱頭的方法，可以有效地克服楊樹派間或派內(nèi)種間雜交的不親和性，尤其是有效地克服了白楊派和黑楊派楊樹的雜交障礙，實驗證明，通過該方法獲得雜交種子的結(jié)實率高，飽滿度好，種子發(fā)芽率在70%以上，為楊樹遠緣雜交獲得優(yōu)良雜種無性系提供了一種新的途徑。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、中國山楊X美洲黑楊的雜交實驗1、實驗材料本實施例所用的母本和父本分別為母本中國山楊(Populus davidiana)(邢亞娟.中國山楊與美洲山楊雜交種新品系選育研究[D]，東北林業(yè)大學(xué)，2005，公眾可從遼寧省楊樹研究所獲得)，為楊屬 (Populus)白楊派山楊亞派楊樹；父本美洲黑楊D189楊(P. deltoides cv. ‘D189，)(董雁，彭儒勝等.遼寧楊遺傳改良的研究，中國林副特產(chǎn)，2005 (5)，公眾可從遼寧省楊樹研究所獲得)，為楊屬 (Populus)黑楊派楊樹。2、實驗方法與操作步驟本實驗共設(shè)計5種雜交的處理方法，分別如下處理1是對照，常規(guī)授粉；處理2 是母本花粉水提液點涂母本雌蕊柱頭后正常授粉；處理3是正己烷有機溶劑熏母本雌蕊柱頭后正常授粉；處理4是用正己烷有機溶劑熏母本雌蕊柱頭后再用母本花粉水提液點涂柱頭，然后正常授粉；處理5是用正己烷有機溶劑點涂母本雌蕊柱頭后正常授粉。每個處理2 根花枝共9個花序，分3次重復(fù)。觀測每個處理所獲得的種子數(shù)、種子飽滿度、千粒重及發(fā)芽率等。操作方法如下1)花枝的采集與花粉的收集2月份采集美洲黑楊D189楊和中國山楊的雄花枝入溫室，切枝水培，室溫控制在 15-25°C，相對濕度為50-70%。散粉前套袋隔離，分別收集花粉，收集的花粉放入消毒的培養(yǎng)皿里(培養(yǎng)皿上貼上標(biāo)簽，注明品種、日期等)，然后將培養(yǎng)皿放入干燥器中干燥M小時， 密封后放入0-4°C冰箱中的干燥器內(nèi)備用。在收集花粉時將中國山楊雌花枝入溫室，切枝水培，室溫控制在20°C左右，相對濕度為60-80 %。中國山楊花芽膨大后即套袋隔離，花序露出苞片2-3厘米時進行雜交試驗。2)雜交處理1 當(dāng)母本中國山楊的雌花開放，花序露出苞片2-3厘米時，按常規(guī)方法進行正常授粉。即用毛筆粘少量收集的父本美洲黑楊D189楊花粉輕輕抖動，將花粉灑在母本的柱頭上，授粉時毛筆不能觸及柱頭，授粉量不宜過多，用放大鏡觀察授粉后的柱頭上均勻密布花粉即可(授粉時間最好在上午10時前后)，授粉次數(shù)在三日內(nèi)連續(xù)進行，一天一次。處理2 當(dāng)母本中國山楊雌花開放，花序露出苞片2-3厘米時，用毛筆尖蘸取中國山楊花粉水提液，輕輕地點涂于雌蕊柱頭，點涂均勻，放置0. 5-1. 0小時后待水取液干后， 然后按處理1的方法進行授粉。處理3 當(dāng)母本中國山楊雌花開放，花序露出苞片2-3厘米時，將中國山楊雌花序豎直伸入盛有液態(tài)正己烷的內(nèi)徑(mm) X長度(mm)為20mmX 180mm的試管中，試管內(nèi)液態(tài)正己烷的高度為30-40mm，雌花序的頂端距正己烷液面的垂直距離是110_130mm。用正己烷的揮發(fā)氣熏雌蕊柱頭8min，然后按處理1的方法進行授粉，期間用手握住試管下部以促進揮發(fā)。處理4 當(dāng)母本中國山楊雌花開放，花序露出苞片2-3厘米時，將中國山楊雌花序豎直伸入盛有液態(tài)正己烷的內(nèi)徑(mm) X長度(mm)為20mmX 180mm的試管中，試管內(nèi)液態(tài)正己烷的高度為30-40mm，雌花序的頂端距正己烷液面的垂直距離是110_130mm，用正己烷的揮發(fā)氣熏雌蕊柱頭8min后，再用毛筆尖蘸取中國山楊花粉水提液，輕輕地點涂于雌蕊柱頭，點涂均勻，放置0. 5-1. 0小時后待花粉水提液干后，按照處理1的方法進行授粉。處理5 當(dāng)母本中國山楊雌花開放，花序露出苞片2-3厘米時，用毛筆尖蘸取液態(tài)正己烷輕輕點涂在雌蕊柱頭上，放置0. 5-1. 0小時后待正己烷液干后，按照處理1的方法進行授粉。上述中國山楊花粉水提液的制備方法如下20-25°C條件下，按Ig母本中國山楊花粉與25ml蒸餾水的比例混合并進行充分攪拌，靜置30min，再充分攪拌靜置，反復(fù)2次，然后以定性濾紙過濾，所得淺黃色濾液即為花粉水提液，經(jīng)檢測，該花粉水提液中不含花粉粒。3)雜交后的培養(yǎng)授粉后繼續(xù)水培，室內(nèi)溫度控制在15-25°C、濕度控制在50-70%，每兩天換1次水，直至蒴果變黃或有裂嘴果粒時，用有透明窗的羊皮紙袋將果穗套上，待蒴果開始飛絮后，收集種子在溫室內(nèi)進行播種育苗，播種容器采用72孔或1 孔規(guī)格的穴盤，播種土壤用高溫滅菌的腐質(zhì)土，1穴1粒種子，不用覆土，保持土壤濕潤，待小苗長出3片真葉后移到室夕卜，每天澆水2-3次，保持土壤濕潤，待幼苗長出5-8片真葉后移入大田。4)雜交后代的表型觀測當(dāng)雜種苗平均株高為50cm時，用形態(tài)學(xué)標(biāo)記的方法對雜種苗的特征進行觀測，主要觀測葉形以及葉邊緣、葉基部、葉柄、芽的特征等。3、試驗結(jié)果中國山楊與美洲黑楊雜交，經(jīng)不同方法處理后，所獲得的雜交種子數(shù)、種子飽滿度、千粒重及發(fā)芽率觀測結(jié)果見下表。表1.不同處理獲得的雜交種子調(diào)查表
權(quán)利要求
1.處理雜交親本中母本雌蕊柱頭的方法，包括如下步驟1)用正己烷的揮發(fā)氣熏所述母本的雌蕊柱頭；幻用所述母本的花粉水提液涂抹經(jīng)步驟1)處理的所述母本的雌蕊柱頭； 所述母本為楊屬楊樹；所述花粉水提液是用水提取所述母本的花粉得到的不含花粉粒的液體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述花粉水提液按照包括如下步驟的方法制備將所述母本的花粉用水提取50-70min后收集不含花粉粒的液體，該液體即為花粉水提液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述提取中所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與20-30ml蒸餾水混合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，用正己烷的揮發(fā)氣熏所述母本的雌蕊柱頭的時間為5-lOmin。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述母本為白楊派或黑楊派。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中，所述提取的時間為60min、所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與25ml蒸餾水混合和所述用正己烷的揮發(fā)氣熏所述母本的雌蕊柱頭的時間為8min ；或，所述提取的時間為70min、所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與 30ml蒸餾水混合和所述用正己烷的揮發(fā)氣熏所述母本的雌蕊柱頭的時間為IOmin ；或，所述提取的時間為50min、所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與 20ml蒸餾水混合和所述用正己烷的揮發(fā)氣熏所述母本的雌蕊柱頭的時間為5min。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述的方法在楊屬派間或派內(nèi)種間楊樹雜交育種中的應(yīng)用。
8.楊樹雜交育種方法，包括如下步驟將雌蕊柱頭經(jīng)過權(quán)利要求1-6中任一所述方法處理的楊樹母本與作為父本的楊樹雜交，得到雜交種；所述雜交的母本為楊屬白楊派或山楊亞派楊樹；所述雜交的父本為楊屬黑楊派楊樹。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述母本為中國山楊(Populus davidiana)0
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述父本為美洲黑楊(Populus deltoides)0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種克服楊樹遠緣雜交障礙的方法。該方法為處理雜交親本中母本雌蕊柱頭的方法，包括如下步驟1)正己烷的揮發(fā)氣熏所述母本的雌蕊柱頭；2)用所述母本的花粉水提液涂抹經(jīng)步驟1)處理的所述母本的雌蕊柱頭；所述母本為楊屬楊樹；所述花粉水提液是用水提取所述母本的花粉得到的不含花粉粒的液體。利用本發(fā)明所提供的方法，可以有效地克服楊樹派間或派內(nèi)種間雜交的不親和性，尤其是有效地克服了白楊派和黑楊派楊樹的雜交障礙，實驗證明，通過該方法獲得雜交種子的結(jié)實率高，飽滿度好，種子發(fā)芽率在70％以上，為楊樹遠緣雜交獲得優(yōu)良雜種無性系提供了一種新的途徑。
文檔編號A01H1/02GK102499063SQ20111034362
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者馮連榮, 劉巍, 劉毅, 尹杰, 張興芬, 彭儒勝, 楊志巖, 王勝東, 矯麗曼, 紀(jì)純陽, 蔄勝軍, 趙繼梅, 趙鑫聞 申請人:遼寧省楊樹研究所