專利名稱：芝麻栽培種與Sesamum radiatum野生種遠(yuǎn)緣雜交后代的分子鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物雜交后代的分子鑒定方法，特別是涉及一種芝麻栽培種(2n=26)與野生種(Sesame radiatum, 2n=64)遠(yuǎn)緣雜交后代的分子鑒定方法,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
芝麻(Sesame indicumL. , 2n=26)屬胡麻科胡麻屬，是世界上最古老的特色油料作物之一。芝麻在我國已有三千多年的栽培歷史，因品質(zhì)優(yōu)良，在國際生產(chǎn)和貿(mào)易中占有重要地位。然而，由于芝麻抗病耐潰性較差，易受環(huán)境條件的影響，產(chǎn)量的穩(wěn)產(chǎn)性不佳。近二十 年來，開展高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)抗病抗逆新品種選育一直是我國芝麻遺傳育種的一項(xiàng)重點(diǎn)任務(wù)。芝麻野生種(Sesame radiatum, 2n=64)具有較好的抗病抗逆特性,將野生種的抗病抗逆特性轉(zhuǎn)入栽培種，是提高芝麻品種抗性特征的重要技術(shù)途徑。但是由于芝麻遠(yuǎn)緣雜交不具有親和性，后代幾乎不能自交結(jié)實(shí)，目前只能采用幼胚拯救培養(yǎng)、組培苗移栽方式獲得遠(yuǎn)緣雜交后代。在遠(yuǎn)緣雜交后代鑒定方面，受研究技術(shù)限制，目前僅采用外觀形態(tài)、生物學(xué)等鑒定方法判斷芝麻遠(yuǎn)緣雜交Fl代的真?zhèn)?。研究發(fā)現(xiàn)，與實(shí)生苗不同的是，芝麻遠(yuǎn)緣雜交后代組培苗之間在外觀形態(tài)方面差異不明顯，但與親本的差異都很顯著。因此選用外觀形態(tài)、生物學(xué)等方法對(duì)遠(yuǎn)緣雜交后代進(jìn)行鑒定，結(jié)果可靠性較差，且鑒定周期較長(zhǎng)。因此，目前急需建立一種快速穩(wěn)定高效的芝麻遠(yuǎn)緣雜交后代的鑒定方法，為完善芝麻遠(yuǎn)緣雜交育種技術(shù)、加快芝麻遠(yuǎn)緣雜交育種步伐提供技術(shù)支撐。DNA是生物的遺傳物質(zhì)，DNA的多態(tài)性是生物多樣性的本質(zhì)內(nèi)容。目前，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展和廣泛應(yīng)用，國內(nèi)外在植物雜交育種的后代鑒定中越來越多的應(yīng)用各種分子標(biāo)記技術(shù)，如RAPD、ISSR、AFLP、SSR等分子標(biāo)記。與常規(guī)育種相比，分子標(biāo)記可以直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，也不存在表達(dá)與否等問題。其中，SSR標(biāo)記由于其多態(tài)性高、共顯性和穩(wěn)定性好、染色體位置清楚而得到了廣泛應(yīng)用，緊密連鎖的SSR標(biāo)記可用于標(biāo)記輔助選擇和聯(lián)合育種，在應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行雜交后代真實(shí)性的鑒定過程中特異性的引物是關(guān)鍵所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種芝麻栽培種與Sesame radiatum野生種遠(yuǎn)緣雜交后代的分子鑒定方法。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是檢測(cè)芝麻遠(yuǎn)緣雜交后代的SSR引物，包括引物對(duì)HS209正向引物序列5’ -GCAAGAAGCCGACATGITTA-3 ’ (Tm=53. 35 °C )反向引物序列5’-ACTCCAATTCCTCCACCAAG-3’(Tm=55.4°C)。
上述引物用于芝麻栽培種與Sesame radiatum野生種遠(yuǎn)緣雜交后代的分子鑒定方法，具體步驟如下(I)挑選飽滿健康的芝麻栽培種與Sesame radiatum野生種種子,6月播種后于7月下旬植株進(jìn)入花期，進(jìn)行人工授粉雜交，采用組織培養(yǎng)方法對(duì)雜交后代幼胚進(jìn)行培養(yǎng)，獲得遠(yuǎn)緣雜交Fl后代；(2)提取步驟(I)中芝麻栽培種(Sesame indicum L.，2n=26)、野生種(Sesameradiatum, 2n=64)及雜交后代F1基因組DNA，作為模板備用；(3)將步驟(2)提取的DNA模板應(yīng)用于PCR反應(yīng)體系，運(yùn)行PCR擴(kuò)增程序，在引物對(duì)HS209的引導(dǎo)下，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；(4)將步驟(3)的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果有栽培種特異性條帶210bp和野生種特異性條帶200bp、230bp的為真雜種；其余則為假雜種。所述的芝麻親本及雜交后代基因組DNA的提取方法采取CTAB提取法，取植株葉片，加入預(yù)冷的提取緩沖液，研磨，4°C離心，棄上清，于沉淀中加入預(yù)熱的裂解緩沖液，65°C水浴，加入氯仿/異戊醇混合液，混勻，15°C離心，取上清，加預(yù)冷的異丙醇，混勻，靜置，離心，棄上清，于沉淀中加入乙醇洗滌，離心，倒掉上清后干燥，加TE緩沖液，4°C溶解DNA30min以上，于20°C保存?zhèn)溆谩Ｋ龅奶崛【彌_液包括0.35M Glucose, 0. IM Tris-HCl, 5mM Na-EDTA, 2%PVP,1%(V/V) ^ _Me，余量為無菌超純水，4°C保存。所述的裂解緩沖液包括I.4M NaCl，0. IM Tris-HCl，20mM Na-EDTA, 2%CTAB,2%PVP，1%(V/V) ^ _Me，余量為無菌超純水，室溫保存。所述的TE 緩沖液包括10mM Tris-HCl (PH 8. 0)，ImM EDTA (PH 8. 0)，余量為無菌 超純水。所述的PCR 反應(yīng)體系為DNA 模版 50ng，IOXBuffer I u L, IOmmol L-IdNTPs0. 2 u L, 10 u g L-1 引物對(duì) HS2091 u L, 2. 5U u L-ITaq DNA polymerase 0.5iiL,加入無菌超純水至終體積10 u L0所述的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性3min，94°C變性I min，58°C退火45s，72°C延伸60s，30個(gè)循環(huán)，72°C總延伸IOmin ;4°C保存。所述的凝膠電泳檢測(cè)為采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度10%，電泳緩沖液為I X TBE，150V恒壓電泳2小時(shí)，電泳結(jié)束后，凝固定先膠，再銀染，漂洗，顯色，漂洗凝膠后記錄讀取數(shù)據(jù)。本發(fā)明的有益效果(I) HS209SSR標(biāo)記為自主開發(fā)的種間特異性標(biāo)記(GenBank，JP643611)，結(jié)果穩(wěn)定可靠。(2)試驗(yàn)開展不受芝麻生產(chǎn)季節(jié)限制，可以以芝麻幼苗葉片為材料，用材少、周期短，材料的預(yù)處理及試驗(yàn)操作步驟簡(jiǎn)便易行。(3)采用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)野生種與栽培種芝麻的遠(yuǎn)緣雜交后代進(jìn)行鑒定，填補(bǔ)了芝麻遠(yuǎn)緣雜交后代分子生物學(xué)鑒定技術(shù)的空白。與流式細(xì)胞儀細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法相比，該方法不需要基因組參照材料，數(shù)據(jù)更加穩(wěn)定可靠；此外，本發(fā)明技術(shù)要點(diǎn)均屬常規(guī)生物學(xué)技術(shù)方法，成本低，在短時(shí)間內(nèi)可完成大批試驗(yàn)材料的鑒定。可廣泛用于今后的芝麻種質(zhì)創(chuàng)新、遠(yuǎn)緣雜交育種等研究。


圖I遠(yuǎn)緣雜交后代組培苗F1田間長(zhǎng)勢(shì)；圖2親本與芝麻遠(yuǎn)緣雜交后代的SSR標(biāo)記鑒定電泳圖；注1=Marker DL2000 ；2 :豫芝 11 ；3 :野芝 I 號(hào)；4 :真雜種 FlNo. IH 07 ；5 :真雜種FlNo. IH25 ；6 :假雜種 FlNo. IH 01 ；7 :假雜種 FlNo. IH 13。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。 實(shí)施例本實(shí)施例用于芝麻豫芝11號(hào)(Sesame indicum L. , 2n=26)和野芝I號(hào)(Sesameradiatum, 2n=64)雜交F1代的鑒定,具體操作步驟如下(I)遠(yuǎn)緣雜交親本及后代培養(yǎng)挑選飽滿健康的芝麻豫芝11號(hào)(Sesame indicumL. , 2n=26)和野芝I號(hào)(Sesame radiatum, 2n=64)種子,6月播種后于7月下旬植株進(jìn)入花期，進(jìn)行人工授粉雜交。采用組織培養(yǎng)方法對(duì)雜交后代幼胚進(jìn)行培養(yǎng)，獲得遠(yuǎn)緣雜交后代F1共4株(圖I)；(2)提取芝麻豫芝11號(hào)、野芝I號(hào)及雜交后代F1基因組DNA，作為模板備用；基因組DNA的提取采取CTAB小量提取法a.取親本、遠(yuǎn)緣雜種Fl后代各2-3片嫩葉，加入600 ill預(yù)冷的新鮮配制的提取緩沖液，電轉(zhuǎn)研磨，再于5000rpm 4°C離心20min,棄上清；b.于沉淀中加入600 U I 65°C預(yù)熱的裂解緩沖液，65°C水浴30min，期間翻轉(zhuǎn)混勻2-3 次；c.加入SOOiU氯仿/異戊醇(氯仿異戊醇為24:1)混合液，翻轉(zhuǎn)50次以上，9000rpml5°C離心20min，將上清轉(zhuǎn)入I. 5ml的離心管中，加0. 6體積的預(yù)冷的異丙醇，緩慢翻轉(zhuǎn)30次,混勻，靜置IOmin, 9000rpm離心IOmin (RT),棄上清，于沉淀中加入Iml 70%的乙醇洗漆，IOOOrpm離心2min,倒掉上清液,通風(fēng)干燥20min ；d.加30 ill TE緩沖液，4°C溶解DNA30min以上，_20°C保存?zhèn)溆谩Ｌ崛【彌_液包括0.35M Glucose, 0. IM Tris-HCl, 5mM Na-EDTA, 2%PVP, 1%(V/V)3 -Me，余量為無菌超純水，4°C保存。裂解緩沖液包括I. 4M NaCl，0. IM Tris-HCl，20mM Na-EDTA, 2%CTAB, 2%PVP,1%(V/V) ^ _Me，余量為無菌超純水，室溫保存。TE緩沖液包括10mM Tris-HCl (PH 8. 0)，ImM EDTA(PH 8. 0)，余量為無菌超純水。(3)將步驟(2)提取的DNA模板應(yīng)用于PCR反應(yīng)體系，運(yùn)行PCR擴(kuò)增程序，在引物對(duì)HS209的引導(dǎo)下，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；PCR 反應(yīng)體系為DNA 模版 50ng，IOXBuffer I y L，IOmmol PdNTPs 0. 2 u L,10 u g L 1 引物對(duì) HS2091 u L, 2. 5U u L 1Taq DNA polymerase 0. 5 u L,加入無菌超純水至終體積IOuD0PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性 3min，94°C變性 I min，58°C退火 45s，72°C延伸 60s，30個(gè)循環(huán)，72°C總延伸IOmin ;4°C保存。(4)將步驟(3)的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。凝膠電泳檢測(cè)為采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度10%，凝膠大小180mmX120mmX2mm,電泳緩沖液為I X TBE，150V恒壓電泳2小時(shí)。電泳結(jié)束后，將凝膠先固定(10%乙醇、0. 5%冰乙酸)6分鐘；之后0. 2%的硝酸銀水溶液滲透銀染12分鐘；蒸餾水漂洗2分鐘兩次后，于I. 5%氫氧化鈉和0. 4%甲醛混合溶液中適度顯色；最后清水漂洗凝膠并記錄讀取數(shù)據(jù)。鑒定結(jié)果利用HS209引物在父本豫芝11親本擴(kuò)增出了 I條特異帶(210bp)，在母本野芝I號(hào)親本上擴(kuò)增出2條特異帶(分別為200bp和230bpp)。根據(jù)基因重組原理，真正的遠(yuǎn)緣雜交后代Fl應(yīng)同時(shí)具有兩親本特異條帶。分析上述PCR結(jié)果可知，No. IH 07、25同時(shí)具有豫芝11號(hào)與野芝I號(hào)的特異性條帶。因此，判定No. IH 07、25為豫芝11號(hào)與野芝I號(hào)真正的遠(yuǎn)緣雜交后代。No. IH 01、13與母本相同，為假的后代(圖2)。為驗(yàn)證上述技術(shù)鑒定結(jié)果的可靠性，同時(shí)對(duì)遠(yuǎn)緣雜交后代Fl進(jìn)行生物學(xué)方法和流式細(xì)胞DNA含量測(cè)定的鑒定。I.生物學(xué)方法遠(yuǎn)緣雜交后代F1組培移栽植株間的生物學(xué)性狀較為相似，苗期不易區(qū)分，但F1幾乎全為不育，與親本間的生物學(xué)性狀差異明顯。因此，通過判定植株匕的育性特征進(jìn)行鑒定，可育為假雜種，不可育為真雜種。2.流式細(xì)胞DNA含量測(cè)定在流式細(xì)胞DNA含量檢測(cè)中，選用大豆(WiIIiams 82，基因組大小950Mb)作為DNA含量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。豫芝11和野芝I號(hào)的基因組大小分別為383. 60Mb,636. 50Mb,差異顯著，因此可依據(jù)材料的基因組大小初步判定是否為真的遠(yuǎn)緣雜交后代。使用BDFACSCaiburTm流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)試材料的細(xì)胞DNA含量檢測(cè)。利用DNA-ACQ軟件獲取數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖和直方圖，使用ModFit LT軟件分析確定樣品GcZG1峰變異系數(shù)(CV%)，然后依據(jù)Seker等(2003)方法計(jì)算樣品核DNA的2C值(pg)，結(jié)果如表I。表I芝麻遠(yuǎn)緣雜交后代的育性特征和細(xì)胞DNA含量檢測(cè)
權(quán)利要求
1.檢測(cè)芝麻栽培種與Sesameradiatum野生種遠(yuǎn)緣雜交后代的的SSR引物,包括 引物對(duì)HS209 正向引物序列5’ -GCAAGAAGCCGACATGITTA-3’(Tm=53.35°C) 反向引物序列5’ -ACTCCAATTCCTCCACCAAG-3，(Tm=55. 4°C )。
2.—種如權(quán)利要求I所述的引物用于芝麻栽培種與Sesame radiatum野生種遠(yuǎn)緣雜交后代的分子鑒定方法，其特征在于，具體步驟如下 (1)挑選飽滿健康的芝麻栽培種(Sesameindicum L.，2n=26)與野生種(Sesameradiatum, 2n=64)種子，6月播種后于7月下旬植株進(jìn)入花期，進(jìn)行人工授粉雜交，采用組織培養(yǎng)方法對(duì)雜交后代幼胚進(jìn)行培養(yǎng)，獲得遠(yuǎn)緣雜交F1后代； (2)提取步驟(I)中芝麻栽培種(Sesameindicum L.，2n=26)、野生種(Sesameradiatum, 2n=64)及雜交后代F1基因組DNA，作為模板備用； (3)將步驟(2)提取的DNA模板應(yīng)用于PCR反應(yīng)體系，運(yùn)行PCR擴(kuò)增程序，在引物對(duì)HS209的引導(dǎo)下，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物； (4)將步驟(3)的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果有栽培種特異性條帶210bp和野生種特異性條帶200bp、230bp的為真雜種；其余則為假雜種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的基因組DNA的提取方法取植株葉片，加入預(yù)冷的提取緩沖液，研磨，4°C離心，棄上清，于沉淀中加入預(yù)熱的裂解緩沖液，65°C水浴，加入氯仿/異戊醇混合液，混勻，15°C離心，取上清，加預(yù)冷的異丙醇，混勻，靜置，離心，棄上清，于沉淀中加入乙醇洗滌，離心，倒掉上清后干燥，加TE緩沖液，4°C溶解DNA30min以上，于20°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的提取緩沖液包括0.35MGlucose,0. IM Tris-HCl, 5mM Na-EDTA, 2%PVP, 1%(V/V) P-Me，余量為無菌超純水。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的裂解緩沖液包括1.4MNaCl,0. IM Tris-HCl, 20mM Na-EDTA, 2%CTAB, 2%PVP, 1%(V/V) ^ -Me,余量為無菌超純水。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的TE緩沖液包括IOmMTris-HCl (PH 8. 0), ImM EDTA(PH 8. 0)，余量為無菌超純水。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)體系為DNA模版 50ng，IOXBuffer I u L, IOmmol L^dNTPs 0. 2 y L，10 y g L-1 引物對(duì) HS2091 u L,2.5U u L 1Taq DNApolymerase 0. 5 U L,加入無菌超純水至終體積 10 U L。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性 3min，94°C變性 I min，58°C退火 45s，72°C延伸 60s，30 個(gè)循環(huán)，72°C總延伸 IOmin ;4°C保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子鑒定方法，其特征在于，凝膠電泳檢測(cè)為聚丙烯酰胺凝膠濃度為10%，電泳緩沖液為1XTBE，150V恒壓電泳2小時(shí)，電泳結(jié)束后，凝固定先膠，再銀染，漂洗，顯色，漂洗凝膠后記錄讀取數(shù)據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種芝麻栽培種與Sesame radiatum野生種遠(yuǎn)緣雜交后代的分子鑒定方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。通過提取栽培種(Sesame indicum L.,2n=26)、野生種(Sesame radiatum,2n=64)及雜交后代F1的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)是否能夠同時(shí)擴(kuò)增出親本的特異性條帶判定遠(yuǎn)緣雜交F1代的真假。本發(fā)明建立的芝麻遠(yuǎn)緣雜交后代的分子鑒定方法，解決了芝麻遠(yuǎn)緣雜交育種研究過程中的遠(yuǎn)緣雜種鑒定周期長(zhǎng)、準(zhǔn)確率低等難題，填補(bǔ)了我國芝麻遠(yuǎn)緣雜交育種技術(shù)的空白。利用該方法可以高效快速地鑒定芝麻遠(yuǎn)緣雜交后代F1，為芝麻抗病新品種育種奠定了材料和技術(shù)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102965431SQ20121031849
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者張海洋, 苗紅梅, 張?bào)w德, 魏利斌, 李春, 琚銘, 王慧麗 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院