專利名稱：一種鑒定植物遠(yuǎn)緣雜交種中外源染色體和染色體片段的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物染色體涂染技術(shù)的建立及其在植物遠(yuǎn)緣雜交種中外源染色體和染色體片段鑒定中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及一種利用染色體涂染技術(shù)鑒定植物遠(yuǎn)緣雜交種外源染色體和染色體片段的方法。
背景技術(shù)：
小麥(Triticum aestirum L.) (2n = 6x = AABBDD)是世界上重要的糧食作物之一，其種植面積和產(chǎn)量均居于谷類作物首位。在我國，小麥僅次于水稻，在農(nóng)業(yè)上占有十分重要的地位。中國小麥品種的遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，在很大程度上限制了小麥產(chǎn)量的提高和品質(zhì)的改良。小麥的近緣種是一個(gè)巨大的、彌足珍貴的基因資源庫，遺傳變異非常豐富，具 有許多栽培小麥所不具有的優(yōu)良特性，如抗病、抗逆、耐瘠薄，高營養(yǎng)、高蛋白和大穗多花多粒等。因此，運(yùn)用遠(yuǎn)緣雜交、染色體工程的方法，將近緣種中的優(yōu)良基因?qū)肫胀ㄐ←溁蚪M中，利用細(xì)胞分子生物學(xué)鑒定技術(shù)發(fā)掘、標(biāo)記和利用近緣種染色體上潛在的抗病基因、營養(yǎng)高效基因、適應(yīng)性和豐產(chǎn)性的基因，創(chuàng)制遠(yuǎn)緣雜交新種質(zhì)基因資源，可進(jìn)一步拓寬小麥的遺傳基礎(chǔ)，提高其生產(chǎn)潛力，培育出多抗、營養(yǎng)高效、廣適、穩(wěn)產(chǎn)型的小麥新品種，以保障我國的糧食安全。黑麥(Secale cereal L. ) (2n = 2x = 14)是最早也是最成功地用于改良小麥的近緣物種之一。黑麥具有許多普通小麥所不及的優(yōu)良性狀，如抗病蟲性(銹病、白粉病、蚜蟲等)、抗逆性(耐寒、耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿、耐干熱風(fēng)等)、抗倒伏、分蘗力強(qiáng)且含有較高的賴氨酸等^2]。特別是黑麥IRS染色體片段上攜帶有抗葉銹病(Lr26)、抗條銹病(Yr9)、抗桿銹病(Srfl)、抗白粉病(Ρι·ο8)及抗飛虱(Gb2)等大量的抗性基因。據(jù)報(bào)道，黑麥的IR、2R、3R、6R染色體上分布的一些抗病基因已被導(dǎo)入小麥中[3]。中間偃麥草(Agropyromintermedium) (2n = 6x = 42)具有BYDV(Bailey yellowdwarf virus，大麥黃矮病)抗性，同時(shí)它具有許多可供小麥利用的優(yōu)良農(nóng)藝性狀，對(duì)桿銹、條銹、葉銹、白粉病和腥黑穗病免疫，高抗根腐病、叢矮病，抗葉枯病，并具有根莖再生能力，耐鹽能力強(qiáng)，是小麥育種的理想抗性來源之一。小冰麥異附加系TAI-27是將中間偃麥草(又稱天藍(lán)冰草)的兩個(gè)染色體組14對(duì)染色體，分別附加到普通小麥中建立起來的兩套小冰麥異附加系中的附加系之一 [4]，經(jīng)人工接種鑒定，表現(xiàn)為高抗大麥黃矮病[5]，表明已將中間偃麥草的BYDV抗性基因轉(zhuǎn)移到了 TAI-27中，為小麥的抗性育種提供了優(yōu)質(zhì)的抗源[4]。長 ill 麥草(Elytrigia elongate = Thinopyrum elongatum = Agropyronelongatum) (2n = IOx = 70)具有抗病、抗逆、高蛋白等多種優(yōu)良性狀,是小麥遺傳改良中應(yīng)用最為廣泛的近緣野生種之一。中國科學(xué)院院士李振聲等發(fā)現(xiàn)長穗偃麥草有很好的抗銹性，于是以長穗偃麥草為主系統(tǒng)開展遠(yuǎn)緣雜交研究。經(jīng)過20多年的努力，成功地將長穗偃麥草的染色體組、染色體、染色體片段導(dǎo)入普通小麥中，創(chuàng)制了八倍體小偃麥(小偃68、小偃693、小偃784、小偃7430、小偃763)、附加系(小偃759)、代換系(小偃藍(lán)粒)和易位系(小偃96)等小偃麥新種質(zhì)，育成了小偃4號(hào)、小偃5號(hào)、小偃6號(hào)、小偃54和小偃81等高產(chǎn)、抗病的優(yōu)質(zhì)小麥品種[6-7]。通過遠(yuǎn)緣雜交將外源染色體或染色體片段成功導(dǎo)入到普通小麥背景后，需要對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，才能有效地加以利用。目前已運(yùn)用C分帶、生化標(biāo)記、分子標(biāo)記、基因組原位雜交(Genome in situ hybridization,GISH)、多色基因組原位雜交(multicolor GISH)等方法來分析和鑒定小麥背景中的外源遺傳物質(zhì)。C分帶方法對(duì)沒有特異性帶型或帶紋少、顏色淺、片段小的染色體不太理想，同時(shí)C分帶對(duì)環(huán)境條件非常敏感，使用不同的試劑、選擇不同的材料往往會(huì)得出不同的結(jié)果。生化標(biāo)記數(shù)目比較少，有些同工酶基因在進(jìn)化過程中已喪失活性，這給外源染色質(zhì)的鑒定帶來了困難。PCR分子標(biāo)記具有方便快速的優(yōu)點(diǎn)，但在一些染色體區(qū)域的遺傳標(biāo)記只對(duì)跟蹤特定的染色體或片段有效。基因組原位雜交技術(shù)利用基因滲入的不同物種基因組作為探針，對(duì)于鑒定小麥異源雙二倍體中的外源染色質(zhì)是一種非常有用的技術(shù)[8]。例如，用生物素標(biāo)記的簇毛麥染色體DNA作為探針，以普通小麥染色體組DNA進(jìn)行封阻，利用GISH技術(shù)可以成功檢測導(dǎo)入小麥中的簇毛麥染色質(zhì)， 而且清楚地顯示出易位染色體斷裂點(diǎn)的確切位置[9];同樣，GISH技術(shù)可以成功地檢測小麥遺傳背景中的長穗偃麥草染色體或易位的片段[1°]。使用多個(gè)不同基因組作為探針，多色基因組原位雜交為同時(shí)鑒定多倍體中兩個(gè)或多個(gè)基因組提供了另外一種可能。例如，GISH及多色-GISH技術(shù)被成功應(yīng)用于鑒定小麥與中間偃麥草雜交獲得的五個(gè)雙二倍體系的細(xì)胞遺傳學(xué)組成;同樣，GISH和多色-GISH技術(shù)也被成功應(yīng)用于鑒定小麥-長穗偃麥草附加、代換和易位系的分子細(xì)胞學(xué)特征[12]。但基因組原位雜交有一定的局限性，如單純用GISH無法確定外源染色體或染色體片段屬于哪個(gè)同源群、代換系所取代的特定染色體、易位系所發(fā)生的位置和斷點(diǎn)。此外，當(dāng)外源染色體與小麥染色體親緣關(guān)系較近時(shí)，難以得到比較理想的雜交效果O相比而言，染色體涂染技術(shù)(chromosome painting)可以更好的鑒定雜交種中的外源染色體。染色體涂染技術(shù)即將整條染色體、某條染色體臂(長臂或短臂)或者染色體某個(gè)片段的DNA制備成探針，然后用熒光標(biāo)記原位雜交的方法，將探針雜交到中期分裂相染色體上，利用熒光顯微鏡觀察熒光素在染色體上的信號(hào)分布，從而分析和研究染色體的重組和畸變[13]。在人類和動(dòng)物中，染色體涂染技術(shù)較為成熟，此技術(shù)具有很高的特異性和分辨力，可用來檢測人類和動(dòng)物的染色體畸變[14]、性別鑒定[15]、顯微克隆[16]等。以微分離的染色體或染色體片段 D0P-PCR(Degenerate-Oligonucleotide-Primed PCR)擴(kuò)增產(chǎn)物為探針，許多學(xué)者對(duì)小麥(Triticum aestivum)[17]、蠶豆(Vicia faba)[18]、大麥(Horeum vulgare)[18]、云杉(Picea abies)[18]、矮牽牛(Petunia hybrida)[19]、黑麥(Secalecereale) [2°]等中期分裂相染色體也進(jìn)行了染色體涂染實(shí)驗(yàn)，但是結(jié)果表明不管有沒有封阻，在所有染色體上均出現(xiàn)相同的雜交信號(hào)。Schubert等認(rèn)為這可能由于與哺乳動(dòng)物染色體相比，植物染色體之間發(fā)生經(jīng)常性的轉(zhuǎn)座、易位事件導(dǎo)致植物不同染色體基因組序列之間存在廣泛的一致性_。不過，利用一些含有特殊序列的植物特異染色體DOP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為探針，進(jìn)行染色體涂染實(shí)驗(yàn)，卻獲得了成功。比如，利用微分離矮牽牛(Petuniahybrid)B染色體作為探針，對(duì)矮牽牛中期分裂相染色體進(jìn)行涂染，結(jié)果表明B染色體上的雜交信號(hào)要比A組染色體雜交信號(hào)亮度強(qiáng)得多[21]。同樣，利用微分離的酸模(Rumexacetosa) Y染色體DOP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為探針進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)，Y染色體由于含有特殊的重復(fù)序列，其很容易與常染色體區(qū)分開來[22]。但是，染色體涂染技術(shù)對(duì)于植物的常染色體(即，A染色體)的檢測一直沒有獲得成功。與植物基因組原位雜交(GISH)相比而言，植物染色體涂染實(shí)驗(yàn)具有GISH所不具備的優(yōu)點(diǎn)(I)植物染色體涂染實(shí)驗(yàn)可以區(qū)分植物遠(yuǎn)緣雜交種中外源染色體細(xì)微的結(jié)構(gòu)變化，如缺失、重復(fù)、易位、倒位等，例如，本研究中對(duì)TAI-27附加染色體進(jìn)行顯微分離及DOP-PCR擴(kuò)增，以其作為探針對(duì)TAI-27中期分裂相染色體進(jìn)行涂染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在TAI-27中除了附加一對(duì)中間偃麥草染色體外，染色體涂染實(shí)驗(yàn)還能鑒定出有一對(duì)染色體發(fā)生了置換，并且其中最小的一對(duì)染色體是由于末端缺失而造成的(這一結(jié)果是植物基因組原位雜交所顯示不出來的)；(2)利用植物染色體涂染實(shí)驗(yàn)，可以對(duì)特定的染色體進(jìn)行顯微分離，進(jìn)而了解特定染色體含有的遺傳信息，如前面提到的B染色體、Y染色體，本研究所涉及到的含有很多特性基因的黑麥IR染色體、TAI-27附加中間偃麥草染色體、7ES/CS附加長穗偃麥草染色體(7E的短臂)，對(duì)其進(jìn)行成功的顯微分離及DOP-PCR擴(kuò)增，為了解其含有的遺傳信息以及為克隆抗性相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種利用染色體涂染技術(shù)鑒定植物遠(yuǎn)緣雜交種中外源染色體和染色體片段的方法。具體地，本發(fā)明的方法包括下述步驟I)顯微分離待測植物中待檢測的染色體的單染色體或染色體片段；2)利用步驟I)分離的單染色體或染色體片段構(gòu)建單染色體或染色體片段熒光探針；3)利用步驟2)構(gòu)建的單染色體或染色體片段熒光探針對(duì)雜交種中期分裂相染色體進(jìn)行熒光原位雜交；和4)分析步驟3)得到的熒光原位雜交結(jié)果，確定待測植物中待檢測的染色體的熒光信號(hào)分布。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟I)通過制備植物遠(yuǎn)緣雜交種根尖中期分裂相，利用單染色體顯微分離技術(shù)分離待檢測的染色體的單染色體或染色體片段或與待檢測的染色體至少部分同源的單染色體或染色體片段。與待測外源染色體同源的染色體的確定可根據(jù)GISH結(jié)果進(jìn)行鑒定，具體的講，利用待測外源染色體來源的基因組DNA構(gòu)建熒光探針對(duì)遠(yuǎn)源雜交種進(jìn)行熒光原位雜交，在顯微鏡下，觀察熒光信號(hào)在染色體上分布情況，從而確定與待檢測的外源染色體至少部分同源的染色體。“至少部分同源”一般指至少20%同源，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用容易地確定所需要的同源性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟2)通過對(duì)步驟I)分離的單染色體或染色體片段進(jìn)行DOP-PCR擴(kuò)增，借助切口平移方法對(duì)所述分離的單染色體或染色體片段DOP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光探針構(gòu)建。其中步驟2)對(duì)微分離的單染色體進(jìn)行兩輪DOP-PCR擴(kuò)增。本發(fā)明的方法適用于多種植物品種，例如，小麥、黑麥、中間偃麥草、長穗偃麥草、水稻、玉米等單子葉植物，同時(shí)也適用于棉花、大豆等雙子葉植物，優(yōu)選適用于單子葉植物，更優(yōu)選適用于禾本科植物。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種利用植物染色體涂染技術(shù)鑒定小麥遠(yuǎn)緣雜交種中外源染色體的方法，其特征在于I)顯微分離小麥遠(yuǎn)緣物種中待檢測的染色體的單染色體或染色體片段，如黑麥的IR染色體、7ES/CS附加的長穗偃麥草染色體、TAI-27中附加的中間偃麥草染色體等；2)利用步驟I)分離的單染色體或染色體片段構(gòu)建單染色體或染色體片段熒光探針；3)利用步驟2)構(gòu)建的單染色體或染色體片段熒光探針對(duì)雜交種中期分裂相染色體進(jìn)行熒光原位雜交；和4)分析步驟3)得到的熒光原位雜交結(jié)果，確定待測植物中所述待檢測的染色體的突光信號(hào)分布。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述待檢測的染色體和染色體片段選自黑麥IR 染色體、中間偃麥草-小麥附加系TAI-27附加染色體、長穗偃麥草-小麥附加系7ES/CS附加染色體。本發(fā)明的方法適用于檢測植物中的常染色體、特殊的B染色體和性染色體，特別地，本發(fā)明的方法首次成功地以高靈敏度檢測植物中的常染色體，克服了現(xiàn)有技術(shù)中植物常染色體檢測效果不理想的問題，是一種技術(shù)突破。具體地講，本發(fā)明的方法有以下幾點(diǎn)技術(shù)突破1)染色體制片技術(shù)的改進(jìn)，本發(fā)明的方法采用了比較先進(jìn)的染色體制片技術(shù)，對(duì)根尖預(yù)處理采用笑氣(N2O)而非傳統(tǒng)的化學(xué)試劑秋水仙素、八羥基喹啉、對(duì)二氯苯等化學(xué)試齊U，主要優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在無毒害、分散效果好；2)熒光探針構(gòu)建及熒光原位雜交技術(shù)與同類方法相比較也體現(xiàn)了快捷、高效、信號(hào)強(qiáng)等特點(diǎn)；3)單染色體涂染技術(shù)的突破，與動(dòng)物染色體涂染技術(shù)相比，植物染色體染色體涂染特別是植物常染色體涂染技術(shù)發(fā)展處于非常落后的階段，主要表現(xiàn)為信號(hào)不清晰、特異性差，很難達(dá)到實(shí)際應(yīng)用的要求，而采用本發(fā)明的方法，熒光原位結(jié)果顯示熒光雜交信號(hào)非常清晰、特異性非常強(qiáng)，可以很好的應(yīng)用到遠(yuǎn)緣雜交種中外源染色體的鑒定，這對(duì)植物染色體涂染技術(shù)的發(fā)展具有很好的推動(dòng)作用。雖然上述技術(shù)中的一種或幾種在相關(guān)的研究中得到了應(yīng)用，但是綜合應(yīng)用這樣幾種技術(shù)構(gòu)成完整的實(shí)驗(yàn)方案，并應(yīng)用到植物遠(yuǎn)緣雜交種中外源染色體或染色體片段的鑒定中未見到相關(guān)研究報(bào)道。本發(fā)明首次利用該套研究方案成功地以高靈敏度檢測遠(yuǎn)緣雜交植物中的外源常染色體，克服了現(xiàn)有技術(shù)中植物常染色體檢測效果不理想的問題，是一種技術(shù)突破，體現(xiàn)了該研究方法具有較好的先進(jìn)性、創(chuàng)新性和實(shí)用性。


從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中圖I.黑麥IR染色體的顯微分離及利用IR染色體探針在小麥-黑麥附加系1R/CS和小麥-黑麥易位系1RS/1BL鑒定黑麥來源的染色體和染色體片段A.黑麥IR染色體的顯微分離過程(左黑麥細(xì)胞中期分裂相，箭頭示IR染色體；右IR染色體被分離后的黑麥細(xì)胞中期分裂相)；B.黑麥IR染色體第二輪DOP-PCR擴(kuò)增電泳圖(M =Marker ；CK 陰性對(duì)照；I :分離的IR單染色體擴(kuò)增產(chǎn)物);C.利用IR單染色體熒光探針對(duì)1R/CS (左圖)、1RS/1BL(右圖)中期分裂相染色體進(jìn)行熒光原位雜交結(jié)果(箭頭示熒光信號(hào)所在染色體，結(jié)果表明只有IR單染色體和IRS染色體片段上有熒光信號(hào))。圖2. TAI-27附加中間偃麥草染色體的顯微分離及其對(duì)TAI-27附加中間偃麥草染色體的染色體涂染鑒定A.TAI-27附加中間偃麥草染色體的顯微分離過程(左細(xì)胞中期分裂相，箭頭示附加中間偃麥草染色體；右附加的小染色體被分離后的細(xì)胞中期分裂相)；B. TAI-27附加中間偃麥草染色體第二輪D0P-PCR擴(kuò)增電泳圖(M =Marker ；CK :對(duì)照；1、2、3、4代表分離的附加單染色體)；C.左圖顯示以中間偃麥草基因組為探針進(jìn)行的基因組原位雜交(GISH)結(jié)果，右圖顯示利用TAI-27附加中間偃麥草單染色體熒光探針對(duì)TAI-27中期分裂相染色體進(jìn)行熒光原位雜交結(jié)果(箭頭示熒光信號(hào)所在染色體，與基因組原位雜交相比，染色體涂染結(jié)果 表明在TAI-27中，一對(duì)外源染色體替換了小麥的一對(duì)染色體，并且小麥附加了一對(duì)外源小染色體，這對(duì)小染色體的產(chǎn)生是由于附加的一對(duì)染色體端部發(fā)生斷裂而產(chǎn)生的)；D.利用TAI-27附加中間偃麥草染色體熒光探針對(duì)中間偃麥草中期分裂相染色體進(jìn)行熒光原位雜交結(jié)果(結(jié)果顯示多數(shù)染色體近著絲粒區(qū)域均出現(xiàn)相似的熒光信號(hào))。圖3. 7ES/CS附加長穗偃麥草染色體的顯微分離及其對(duì)7ES/CS附加長穗偃麥草染色體的染色體涂染鑒定A. 7ES/CS附加長穗偃麥草染色體的顯微分離過程(左細(xì)胞中期分裂相，箭頭示附加長穗偃麥草染色體；右附加的小染色體被分離后的細(xì)胞中期分裂相)；B. 7ES/CS附加長穗偃麥草染色體第二輪D0P-PCR擴(kuò)增電泳圖(M =Marker ;1、2、3、4代表分離的附加單染色體)；C.利用7ES/CS附加長穗偃麥草染色體熒光探針對(duì)7ES/CS中期分裂相染色體進(jìn)行熒光原位雜交結(jié)果(箭頭示熒光信號(hào)所在染色體，結(jié)果表明只有小麥附加的一對(duì)染色體上有突光信號(hào))
具體實(shí)施例方式下面參考實(shí)施例和附圖詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解的是，下述實(shí)施例是舉例說明的目的，其不應(yīng)以任何方式解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍由后附的權(quán)利要求所限定。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，除非另外具體說明，下述實(shí)施例中所用的試劑均為市售分析純級(jí)別的試劑。實(shí)施例I.黑麥IR染色體的顯微分離及對(duì)小麥-黑麥附加系1R/CS和小麥-黑麥易位系1RS/1BL黑麥來源的附加染色體和染色體片段的涂染鑒定I.黑麥有絲分裂中期分裂相的制備所用黑麥(Secale cereal) king II，購自美國農(nóng)業(yè)部牧草與畜牧研究室(USDA，ARS，F(xiàn)RRL，UT,USA)。DN2O處理根尖用鑷子在I. 5ml離心管的蓋子上扎一個(gè)孔，打開蓋子，用噴霧瓶向離心管中噴水至管壁有一層水珠，切取l_2cm的根尖放入管中，蓋上蓋子后放入N2O氣室中處理 l_3h，壓強(qiáng)為 lOATMd. OlMpa)；2)根尖固定用90%乙酸冰上固定根尖10分鐘(不超過Ih)(可向原來的帶孔的1.5ml管中直接加90%乙酸，或轉(zhuǎn)移根尖至新管中固定)；固定后的根尖轉(zhuǎn)入70%的乙醇中放入-20°C可保存多年；3)水洗用水洗根尖10分鐘(換2-3次H2O)，放于冰上；4)轉(zhuǎn)移根尖至干濾紙上，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)根尖去除根尖表面的粘稠物；酶解切下2mm長的生長點(diǎn)部分轉(zhuǎn)入20 μ L冰冷的酶液中(2-3個(gè)根尖/管)(酶解液配制把一個(gè)塑料培養(yǎng)皿放到天平上，向里面加入IX檸檬酸緩沖液(IOmM檸檬酸鈉+IOmM EDTA，pH 5. 5) 4. 85g，取出置于冰上，稱取50mg果膠酶Y-23 (購自北京華綠源科技有限公司，l%w/w)和IOOmg纖維素酶Onozuka R-10 (購自北京華綠源科技有限公司，2% w/w)加入緩沖液中，用槍頭吹吸助溶，酶溶解后用分液器分裝到O. 5ml薄壁PCR管中，放入干冰中迅速冷凍一下，_20°C保存)，放入37°C的水浴中30-50分鐘；5)取出離心管放冰上，加入500 μ L 70%乙醇，混勻，倒掉乙醇后，加入500μ L新的70%乙醇，再倒出乙醇，留40 μ L乙醇，用解剖針搗碎根尖，渦旋幾秒鐘或用手指彈擊管壁幾次懸浮細(xì)胞，在小離心機(jī)上離心10-20秒，轉(zhuǎn)速不超過2000rcf，小心倒置PCR管于濾紙或吸水紙至乙醇完全流盡；6)放離心管于冰上，加30 μ L無水乙酸，渦旋或用槍頭輕輕吹吸混勻，吸5-8 μ L滴片，載玻片已擺放在保濕盒中，滴片后蓋住保濕盒，放置5分鐘后即可利用光學(xué)顯微鏡物鏡20 X下觀察染色體。2.黑麥IR染色體的顯微分離首先將直徑為I. Omm的微細(xì)玻璃棒，在酒精燈下，利用Leitz拉針儀手工拉制成直徑為Iym左右的微細(xì)玻璃針。在倒置顯微鏡下(OlympuslM)用手工拉制的玻璃針借助Leitz顯微操作儀(code-No. 93314,購自德國萊卡公司)對(duì)識(shí)別的染色體進(jìn)行前后左右的劃動(dòng)，輕輕刮取。將粘附有IR染色體(帶有隨體的小染色體，可在不染色的情況下識(shí)別確認(rèn)，圖1A，左箭頭所示；圖1A，右為IR染色體被分離后的圖像)的針尖折斷于預(yù)先裝有
10μ L 蛋白酶 K (Proteinase K, recombinant PCR Grade 03115887001Roche, 50ng/μ L,由IXTaq DNA聚合酶緩沖液配制)反應(yīng)緩沖液的O. 2mlEppend0f管中，室溫高速(離心速率4000rpm)離心30s，_20°C放置待用。3.黑麥 IR 染色體 D0P-PCR(Degenerate-Oligonucleotide-Primed PCR)擴(kuò)增首先將含有按實(shí)施例I. 2得到的微分離染色體的PCR管放于37°C進(jìn)行酶解去蛋白反應(yīng)，2h后90°C處理IOmin失活蛋白酶K，用作第一輪DOP-PCR反應(yīng)的模板。將DOP-PCR 引物(5，-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ) (N 表示 A，G，T 或 C)、水、緩沖液(D0P-PCR擴(kuò)增試劑盒所帶，DOP-PCR擴(kuò)增試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)在紫外燈下照射30min，操作均在超凈操作臺(tái)上操作。第一輪DOP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種利用染色體涂染技術(shù)鑒定植物遠(yuǎn)緣雜交種外源染色體和染色體片段的方法，其包括下述步驟 1)顯微分離待測植物中的待檢測的染色體的單染色體或染色體片段； 2)利用步驟I)分離的單染色體或染色體片段構(gòu)建單染色體或染色體片段熒光探針； 3)利用步驟2)構(gòu)建的單染色體或染色體片段熒光探針對(duì)雜交種中期分裂相染色體進(jìn)行熒光原位雜交；和 4)分析步驟3)得到的熒光原位雜交結(jié)果，確定待測植物中所述待檢測的染色體的熒光信號(hào)分布。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟I)通過制備植物遠(yuǎn)緣雜交種根尖中期分裂相，利用單染色體顯微分離技術(shù)分離待檢測的染色體的單染色體或染色體片段。
3.權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟2)通過對(duì)步驟I)分離的單染色體或染色體片段進(jìn)行DOP-PCR擴(kuò)增，借助切口平移方法對(duì)所述分離的單染色體或染色體片段DOP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光探針構(gòu)建。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟2)對(duì)微分離的單染色體進(jìn)行兩輪DOP-PCR擴(kuò)增。
5.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述單子葉植物為禾本科植物。
7.權(quán)利要求5所述的方法,其中所述植物選自小麥、黑麥、中間偃麥草-小麥附加系TAI-27、長穗偃麥草-小麥附加系7ES/CS。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述待檢測的染色體和染色體片段選自黑麥IR染色體、中間偃麥草-小麥附加系TAI-27附加染色體、長穗偃麥草-小麥附加系7ES/CS附加染色體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用染色體涂染技術(shù)鑒定植物遠(yuǎn)緣雜交種中外源染色體和染色體片段的方法，所述方法包括下述步驟1)顯微分離待測植物中的待檢測的染色體的單染色體或染色體片段；2)利用步驟1)分離的單染色體或染色體片段構(gòu)建單染色體或染色體片段熒光探針；3)利用步驟2)構(gòu)建的單染色體或染色體片段熒光探針對(duì)雜交種中期分裂相染色體進(jìn)行熒光原位雜交；和4)分析步驟3)得到的熒光原位雜交結(jié)果，確定待測植物中所述待檢測的染色體的熒光信號(hào)分布。利用本發(fā)明提供的方法不但可以用來對(duì)小麥遠(yuǎn)緣雜交種中外源染色體和染色體片段進(jìn)行鑒定，也可以應(yīng)用到對(duì)其他農(nóng)作物遠(yuǎn)緣雜交種中外源染色體和染色體片段的鑒定工作中。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102876801SQ20121040285
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日
發(fā)明者胡贊民, 鄧傳良, 符書蘭, 韓方普, 尹維波, 陳宇紅 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所