專利名稱：一株弗氏鏈霉菌及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株弗氏鏈霉菌Streptomyces fradiae及其應用，主要應用與植物病害的生物防治方面，該弗氏鏈霉菌可以用于拮抗魔芋軟腐病菌Erwiniacarotovoravar. carotovora、水稻白葉枯病菌 Xaothomonas campestris pv. oryzae 和水稻稻痕病菌Magnaporthe oryzae。
背景技術(shù)：
鏈霉菌(Sti^ptomyces)在分類學上屬于原核生物界、放線菌目、鏈霉菌科，是一類具有分枝絲狀體的好氧革蘭氏陽性細菌，是土壤中主要的微生物類群之一。鏈霉菌基因組約為大腸桿菌基因組的兩倍，平均大小為8000kb。同其它生物相比，其基因組最大特征之一就是其DNA具有極高的G+Cmol %，可高達69-78 %，是迄今為止已知的G+Cmol %含量最高的生物類群之一。鏈霉菌可以產(chǎn)生多種次生代謝物質(zhì)，包括水解酶及抗生物質(zhì)，不僅在人體醫(yī)藥、飼料添加劑等領(lǐng)域有廣泛的應用，而且在植物保護方面發(fā)揮了巨大作用。一般而言，農(nóng)用抗生素具有較低毒性及低殘留性質(zhì)，可以抑制病原微生物的生長和繁殖，或者能改變病原菌的形態(tài)而達到防治病害的效果。農(nóng)用抗生素可作用于病原菌的細胞壁、細胞膜、蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)、能量代謝系統(tǒng)及細胞分裂而抑制病原菌的生長，同時還可以提高植物的抗病能力。鏈霉菌產(chǎn)生的農(nóng)用抗生素種類多，而且大多已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用，可防治真菌、細菌、線蟲病害及一些重要的害蟲，有的還具有除草活性。鏈霉菌作為農(nóng)用抗生素防治病害有廣泛的例子，如我國的井R霉素、農(nóng)抗120、春雷霉素、中生霉素等，對防治植物細菌性病害及真菌性病害有很好的防治效果。國外報道的抗菌素有殺稻瘟素等。鏈霉菌還產(chǎn)生許多抗生素用于農(nóng)業(yè)害蟲防治，僅我國就研制了殺蚜素、韶關(guān)霉素、瀏陽霉素、南昌霉素等。最著名的為阿維菌素A (vermectins,簡稱Am)，是一種殺消化道線蟲和外寄生蟲的高效廣譜驅(qū)蟲劑。它對線蟲、蜂蝸類(Aearina)、甲蟲類(Coleoptera)及鱗翅目(Lepidoptera)、直翅目(Orthoptera)、雙翅目D(Ptiear)和膜翅目H(ymenoPter) a等多種害蟲也有殺滅作用。另外，由Sukyo公司研究小組在Streptomyes hygroscopicus的一個菌株中發(fā)現(xiàn)的殺蜻菌素(Mlibemycni)也具有廣譜殺線蟲、昆蟲活性。從金色鏈霉菌(Streptomyes aureus)的菌絲中獲得的與殺蝸化合物類似的物質(zhì)單活菌素(Monaetin)、二活菌素(Dinatin)和三活菌素(Trinactin)也都具有殺螨活性。具有除草活性的雙丙氨麟已商品化用于農(nóng)田雜草的防除。這些農(nóng)用抗生素的開發(fā)和應用帶來了巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。鏈霉菌拮抗植物病原菌的原理可分為抗生、競爭和超寄生作用。鏈霉菌是植物生物防治微生物中的主要成員之一。本發(fā)明從魔芋地土壤中分離得到一株拮抗鏈霉菌，它對魔芋軟腐病原菌、水稻白葉枯病原菌和水稻稻瘟病原菌有很好的抑制作用，為開發(fā)新的植物生防制劑提供技術(shù)支撐
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae),該弗氏鏈霉菌對魔芋軟腐病原菌、水稻白 葉枯病原菌和水稻稻瘟病原菌有很好的抑制作用，為開發(fā)新的生物農(nóng)藥品種、植物生物防治菌劑提供了新選擇。所述弗氏鏈霉菌SJK18,拉丁名為Streptomyces fradiae,分離自三峽大學生物技術(shù)研究中心魔芋種植實驗地土壤，于2011年12月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2011457，保藏地址為中國，武漢，武漢大學。本發(fā)明還有一個目的是提供一種分離鏈霉菌SJK18的方法，該方法的分離過程為將土樣自然風干過篩，取IOg置于含90ml無菌水的錐形瓶中(帶數(shù)粒玻璃珠)，充分混勻。采用梯度稀釋法將土樣懸液依次稀釋至10-2—10-6。分別取10-4、10-5和10-6的土樣懸液O. Iml涂布于高氏I號培養(yǎng)基(含O. 15%重鉻酸鉀)培養(yǎng)皿中，置于30°C培養(yǎng)5d后，計數(shù)、標記，并挑取形態(tài)不同的菌落純化后備用。用平板對峙法篩選拮抗放線菌。抑菌試驗表明，鏈霉菌SJK18對部分植物病原真菌具有抑制效果，如魔芋軟腐病菌 Erwinia carotovora var. carotovora、/K稻白葉枯病菌 Xaothomonas campestrispv. oryzae 和水稻稻痕病菌 Magnaporthe oryzae。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易想到將本發(fā)明菌株的發(fā)酵液或菌懸液作為農(nóng)藥的有效成分用于植物病害的生物防治，或者將本發(fā)明菌株制備成菌劑用于植物病害的生物防治。因而，本發(fā)明還包括含有所述菌株或者其發(fā)酵液的生物農(nóng)藥，以及含有所述菌株的微生物菌劑。本發(fā)明還有一個目的是提供一種用于生物防治植物病害的菌劑，其活性成分為鏈霉菌SJK18或其發(fā)酵液。其中所述植物病害為魔芋軟腐病、水稻白葉枯病或水稻稻瘟病。本發(fā)明還有一個目的是提供一種生物農(nóng)藥，該生物農(nóng)藥含有鏈霉菌SJK18或其發(fā)酵菌液，可拮抗魔芋軟腐病原菌、水稻白葉枯病原菌或水稻稻瘟病菌。本發(fā)明還有一個目的是將本發(fā)明的鏈霉菌SJK18、含有該鏈霉菌的菌劑或生物農(nóng)藥應用于植物病害的生物防治。其中所述的植物病害是魔芋軟腐病、水稻白葉枯病或水稻稻痕病。本發(fā)明還有一個目的是將本發(fā)明的鏈霉菌SJK18或含有該鏈霉菌的菌劑應用于制備生物農(nóng)藥。其中所述的生物農(nóng)藥抑制魔芋軟腐病原菌、水稻白葉枯病原菌或水稻稻瘟病原菌。本發(fā)明方法如下I、弗氏鏈霉菌SJK18的鑒定(I)形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察用扦片法觀察SJK18的形態(tài)。將SJK18接種于高氏一號、察氏、燕麥粉瓊脂、葡萄糖天冬素、酵母膏麥芽、淀粉銨瓊脂、克氏一號和甘油天冬素培養(yǎng)基，觀察其氣生菌絲與基內(nèi)菌絲的顏色、可溶性色素的有無及顏色。培養(yǎng)基成分高氏一號培養(yǎng)基可溶性淀粉20. 0g, NaClO. 5g，KNO3L 0g, MgSO4O. 5g，K2HPO4O. 5g，F(xiàn)eSO4O. Olg,水 1000ml, pH7. 0。察氏培養(yǎng)基:蔗糖30. 0g，KC10. 5g, MgSO4O. 5g，K2HPO4L 0g，F(xiàn)eSO4O. 01g，NaN032. Og,水 1000ml, pH7. 0。
克氏一號培養(yǎng)基=NaClO.2g，KNO3L 0g, MgSO4O. Olg, K2HPO4L Og,葡萄糖 20. Og,MgCO3O. 3g, CaCO3O. 5g，水 1000ml, ρΗ7· O。葡萄糖天冬素培養(yǎng)基天冬素O. 5g,葡萄糖10. 0g, K2HPO4O. 5g,水1000ml, pH7. O。葡萄糖麥芽汁培養(yǎng)基葡萄糖4. 0g，麥芽10. 0g，酵母膏4. OgjjC 1000ml，pH7. O。燕麥粉培養(yǎng)基燕麥粉20. 0g，痕量鹽I. 0ml，水1000ml，pH7. O。甘油天冬素培養(yǎng)基甘油10. 0g，天冬素l.Og，K2HPO4L Og,痕量鹽1.0ml，水1000ml, ρΗ7· O。淀粉銨培養(yǎng)基可溶性淀粉10. Og,硫酸銨2. 0g, CaC033. 0g, NaCll. Og,^MgSO4 1.5g, K2HPO4O. 5g，水 1000ml, ρΗ7· O。(2)生理生化特征Α、碳源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分(NH4)2S042. 64g，Κ2ΗΡ045· 56g，Κ2ΗΡ042· 38g，MgSO4 · 7H20 I. Og,CuSO4 ·5Η20 0. 0064g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 001 lg，MnCl2 · 4Η200· 0079g，ZnSO4 · 7H20 0.0015g，瓊脂20. Og,蒸餾水1000ml。將D-葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露醇、棉子糖、L-阿拉伯糖、七葉苷、醋酸鈉、肌醇、麥芽糖、檸檬酸三鈉、甘油、柳醇、果糖、乳糖、木糖醇和D-山梨醇置于紫外燈下滅菌2h后，按I %的量分別加入已熔化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻，待糖溶化后倒入平板上，凝固，接SJK18孢子。30°C培養(yǎng)7天后觀察菌落生長情況。B、明膠液化培養(yǎng)基成分:蛋白胨5. 0g，葡萄糖20. Og,明膠200. 0g，蒸餾水1000ml。將SJK18接種于明膠表面，于28°C下培養(yǎng)，經(jīng)15天后觀察明膠液化情況。C、牛奶凝固與胨化將SJK18接種于滅菌的脫脂牛奶中，28°C下培養(yǎng)，于10d，15d，及20d分別觀察牛奶凝固與胨化情況。D、淀粉水解培養(yǎng)基成分可溶性淀粉10. 0g, K2HPO4O. 3g，NaCl 0. 5g，MgCO3L 0g, KNO3L Og,瓊脂15. OgjjC 1000ml，pH7. 2。將SJK18接種于上述培養(yǎng)基中，28°C下培養(yǎng)10天后，往培養(yǎng)基表面倒入碘液，以菌落周圍有無透明圈來判斷有無淀粉酶產(chǎn)生。E、纖維素水解培養(yǎng)基=MgSO4· 7H20 0. 5g, K2HPO4O. 5g, NaClO. 5g, KNO3L 0g，蒸餾水 1000ml。上
述培養(yǎng)基分裝試管后，每管插一濾紙條，使其一半浸入培養(yǎng)基中，一半露于管內(nèi)空氣中。將SJK18接種于濾紙條上，28°C下培養(yǎng)30天后，觀察其是否能在濾紙上生長。F、H2S 的產(chǎn)生培養(yǎng)基蛋白胨10.0g，檸檬酸鐵0. 5g，瓊脂15.0g，蒸餾水1000ml，pH7. 2。將SJK18接種于上述培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一周后觀察有無黑色硫化鐵產(chǎn)生作為H2S產(chǎn)生的依據(jù)。(3)總DNA的提取采用改進的CTAB法提取總DNA，以反復凍融破碎細胞，氯仿/異戊醇(24 I)抽提。取約0. 2g菌體于2ml的離心管中，加I. 5ml提取液(I % CTAB, I. 5molNaCl,0. lmolEDTA，0. Imol Tris，0. Imol 磷酸緩沖液，pH8. 0)混勻后置于 _70°C冰箱靜置 30min,取出后于65水浴融化，反復凍融三次；加20% SDS 200μ 1,65水浴2h(期間每20min輕輕顛倒混勻)，8000rpm離心15min,收集上清；上清液加O. 5倍體積的聚己二醇6000(50%PEG, I. 5mol NaCl)混勻，沉淀過夜；6000rpm離心30min,棄上清，沉淀加入O. 5mll XTE溶解；用等體積的氯仿異戊醇(24 I)抽提，12000rpm離心20min收集上清，重復一次；用O. I倍體積NaAc (3mol/L)和O. 6倍體積異丙醇(-20°C預冷)室溫沉淀4h，12000rpm離心20min棄上清；沉淀用70%乙醇洗漆，12000rpm離心20min棄上清，晾干；沉淀加50 μ I超純水溶解。(4) 16S rDNA 序列分析采用通用引物擴增16S rDAN序列。上游引物F27 :5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，下游引物 Rl522 :5 ' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 '。反應體系如下
IOxPCRBuflFer2.5μ1
(Mg2+) (20mM)2.0μ1
dNIPmixture (IOmM)0.5μ1
Primer-F27 (20μΜ)0.5μ1Primer-Rl522 (20μΜ)0.5μ1
DNA 模板Ι.ΟμΙ
Taq Polymerse(3U^l)0.5μ1
ddH2017.5μ1
Total Volume25 μ 反應條件94°C預變性5min，94°C變性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 90s，30 個循環(huán)，最后72°C延伸8min。PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑取1500bp左右的條帶進行凝膠回收。將回收的DNA連接載體上并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞；篩選陽性克隆子送上海生工測序。將測得的序列提交的美國GenBank，并獲得登錄號。將此序列在GenBank中進行序列比對，并選取同源性較高的菌株的序列用MEGA4. I軟件構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹。(5) 16S-23S轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列ITS分析上游引物從SJK18菌株的16S rDNA末端設計。下游引物設計從GenBank中下載弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae) 23S rDNA的序列，用CLUSTALXl. 8軟件進行多序列比對，尋找高同源性的保守序列，從中設計引物。引物通過01igo6.5軟件進行分析評價。反應條件根據(jù)設計的引物進行確定。其它步驟同16S rDNA—樣。2、弗氏鏈霉菌SJK18拮抗魔芋軟腐病原菌采用打孔法考察弗氏鏈霉菌SJK18發(fā)酵液抑制魔芋軟腐病病原菌。3、弗氏鏈霉菌SJK18拮抗水稻白葉枯病原采用打孔法考察弗氏鏈霉菌SJK18發(fā)酵液抑制水稻白葉枯病原菌。
4、弗氏鏈霉菌SJK18拮抗水稻稻瘟病原菌
采用平板對峙培養(yǎng)法考察弗氏鏈霉菌SJK18抑制水稻稻瘟病原菌。


圖I為本發(fā)明的弗氏鏈霉菌SJK18的孢子鏈。圖2為本發(fā)明的弗氏鏈霉菌SJK18的基內(nèi)菌絲。圖3為本發(fā)明的弗氏鏈霉菌SJK18菌株的16S rDAN系統(tǒng)發(fā)育樹，括號內(nèi)為GenBank登錄號。圖4為本發(fā)明的弗氏鏈霉菌SJK18菌株的ITS系統(tǒng)發(fā)育樹，括號內(nèi)為GenBank登錄號。圖5為本發(fā)明的弗氏鏈霉菌SJK18發(fā)酵抑制魔芋軟腐病病原菌效果，四個重復。圖6為本發(fā)明的弗氏鏈霉菌SJK18發(fā)酵抑制水稻白葉枯病原菌和稻瘟病原菌效果，其中，a SJK18高氏一號發(fā)酵液，b SJK18LB發(fā)酵液，c SJK18LB發(fā)酵液乙醇沉淀物；1 水稻白葉枯病0249，2 :水稻白葉枯病05105，3 :水稻白葉枯病11201，4 :水稻白葉枯病134，5 :水稻稻痕病IK81_3,6 :水稻稻痕病χ，7 :水稻稻痕病1366,8 :水稻稻痕病65Α,9 :水稻稻痕病 1073-2。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明做進一步描述。以下實施例將有助于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。通過下述實例對本發(fā)明的技術(shù)特征作詳細描述。實施例I、弗氏鏈霉菌SJK18的鑒定(I)形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察分別用普通光學顯微鏡100Χ油鏡觀察孢子絲和基內(nèi)菌絲。SJK18孢子絲鏈狀，彎曲(圖I)，基內(nèi)菌絲發(fā)達，多分枝、無橫隔無斷裂(圖2)。SJK18在高氏一號、燕麥粉瓊脂、淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基中氣生菌絲為淡紫色，基內(nèi)菌絲橙色；在察氏培養(yǎng)基中氣生菌絲茶色，基內(nèi)菌絲無色；在葡萄糖天冬素培養(yǎng)基中無氣生菌絲，基內(nèi)菌絲乳白色；在克氏一號培養(yǎng)基中氣生菌絲灰白色，基內(nèi)菌絲白色；在甘油天冬素培養(yǎng)基中，氣生菌絲灰白色，基內(nèi)菌絲橙色。SJK18在以上培養(yǎng)基中均不產(chǎn)可溶性色素(表I)。表I本發(fā)明的鏈霉菌SJK18培養(yǎng)特征
權(quán)利要求
1.弗氏鏈霉菌SJK18，于2011年12月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC M 2011457。
2.一種用于生物防治植物病害的菌劑，其活性成分為權(quán)利要求I的弗氏鏈霉菌SJK18或其發(fā)酵液。
3.權(quán)利要求2所述的菌劑，其中所述植物病害為魔芋軟腐病菌、水稻白葉枯病菌或水稻稻痕病菌。
4.一種生物農(nóng)藥，其含有權(quán)利要求I的弗氏鏈霉菌SJK18或其發(fā)酵液。
5.權(quán)利要求4所述的生物農(nóng)藥，其中該生物農(nóng)藥可拮抗魔芋軟腐病、水稻白葉枯病或水稻稻瘟病的病原菌。
6.權(quán)利要求I所述的弗氏鏈霉菌SJK18、權(quán)利要求2所述的菌劑或權(quán)利要求4所述的生物農(nóng)藥在植物病害生物防治中的應用。
7.權(quán)利要求6所述的應用，其中所述的植物病害是魔芋軟腐病、水稻白葉枯病或水稻稻痕病。
8.權(quán)利要求I所述的弗氏鏈霉菌SJK18或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備生物農(nóng)藥中的應用。
9.權(quán)利要求8所述的應用，其中所述的生物農(nóng)藥抑制魔芋軟腐病、水稻白葉枯病或水稻稻瘟病的病原菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株弗氏鏈霉菌SJK18及其在植物病害的生物防治中的應用，所述弗氏鏈霉菌SJK18于2011年12月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCM2011457，該鏈霉菌及其發(fā)酵液對魔芋軟腐病、水稻白葉枯病或水稻稻瘟病的病原菌有較好的拮抗作用，效果穩(wěn)定且持續(xù)，不產(chǎn)生公害，為開發(fā)新的生物農(nóng)藥品種、植物生物防治菌劑提供了新選擇，具有一定的經(jīng)濟和社會效益。
文檔編號A01P3/00GK102618455SQ20121004466
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月26日
發(fā)明者樂超銀, 葉晶龍, 廖甜甜, 望慧星, 潘虹, 王鈞, 程海麗, 許克靜, 陳云, 雷珍珍 申請人:三峽大學