專利名稱：一種野生百合的組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物栽培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種野生百合的組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
植物組織培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域，滲透到育種學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科中，成為生命科學(xué)中重要的研究技術(shù)和手段。組培狹義指用植物各部分組織，如形成層、薄壁組織、葉肉組織、胚乳等進(jìn)行培養(yǎng)獲得再生植株，也指在培養(yǎng)過(guò)程中從各器官上產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經(jīng)過(guò)再分化形成再生植物。百合(Lily)是百合科百合(Lilium L.)屬多年生球根花卉，在世界觀賞花卉生產(chǎn) 中占有重要地位，隨著市場(chǎng)需求量的不斷增加，人們對(duì)百合花的品種質(zhì)量要求也越來(lái)越高，為進(jìn)一步豐富和改善百合品種及觀賞價(jià)值，開發(fā)野生百合資源，提高百合的組培價(jià)值及商品價(jià)值，人們對(duì)百合野生品種資源、野生百合的組培繁殖以及試管苗生長(zhǎng)發(fā)育做了大量研究，從依靠鱗片扦插由子球培育成母球的傳統(tǒng)的百合種球生產(chǎn)到百合組培快繁。由于百合地下鱗莖數(shù)量多，易于獲得，取材不受季節(jié)限制而成為目前百合組培最主要的外植體材料，但鱗莖生長(zhǎng)于地下，帶菌多，使得組培消毒過(guò)程中難度加大。目前百合組培苗的獲得均采用常規(guī)的組織培養(yǎng)方法，即將野生百合鱗片用肥皂水刷洗干凈，70%酒精消毒30min，然后在飽合漂白水溶液中表面消毒20min，用無(wú)菌水沖洗干凈，無(wú)菌濾紙吸去鱗片表面水分，將外植體切成O. 5cm邊長(zhǎng)的正方形小塊，分別接種到附加不同濃度激素的培養(yǎng)基上，先誘導(dǎo)出愈傷組織，轉(zhuǎn)接后使愈傷組織分化出根和芽，進(jìn)而培養(yǎng)成瓶苗。但是，在組織培養(yǎng)早期常出現(xiàn)大面積的真菌污染，繼代過(guò)程中還會(huì)出現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌的再次污染，造成了材料的損失，同時(shí)浪費(fèi)了大量的人力物力。野生百合由于生長(zhǎng)在野外，無(wú)性繁殖的特性使其在生長(zhǎng)過(guò)程中易不斷積累病毒，故長(zhǎng)期以來(lái)高污染率是困擾野生百合組織培養(yǎng)的難題。目前，對(duì)如何降低野生百合組培過(guò)程中的污染率已有相關(guān)研究報(bào)道，一方面是對(duì)組培過(guò)程各環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格控制，另一方面是使用表面消毒劑對(duì)材料進(jìn)行消毒如抗生素、次氯酸鈉、氯化汞等。但這些消毒劑或達(dá)不到很好的污染防控作用，或?qū)Σ牧嫌袀Σ?duì)操作人員及環(huán)境有危害。因此，如何尋找一種高效易于操作且環(huán)境友好型的外植體處理方法，是野生百合組培過(guò)程中亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種野生百合的組織培養(yǎng)方法，該方法解決了傳統(tǒng)野生百合組織培養(yǎng)方法早期易出現(xiàn)的真菌、細(xì)菌污染、繼代過(guò)程中易出現(xiàn)內(nèi)生菌污染的問(wèn)題。一種野百合組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟(I)取野生百合蒴果，消毒；(2)將消毒后的野生百合蒴果切開，選取生長(zhǎng)飽滿，胚明顯的種子，刮掉種子的種皮，接種于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)；(3)選取萌發(fā)形成的芽，接種于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行光照培養(yǎng)，得到鱗莖植株；(4)以鱗莖植株的組織為外植體，誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗。消毒材料直接選用百合蒴果，種子由于蒴果果皮包被，本身帶菌少，所得材料經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后亦不易出現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌的再生，一般飽滿蒴果內(nèi)含種子80 150粒，數(shù)量多，一次性可獲得豐富實(shí)驗(yàn)材料。所述的消毒方法可以具體為
將野生百合蒴果洗凈后置于含洗潔精的水中浸洗20 40min，然后在自來(lái)水流下沖洗O. 5 lh，再用75%酒精浸泡O. 5 I. 5min。此消毒方法避免使用氯化汞、次氯酸鈉等對(duì)環(huán)境有害的化合物，去除了消毒劑及無(wú)菌水沖洗時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，節(jié)約人力物力，提高了操作人員的安全性，減少了環(huán)境污染。75%的酒精使菌體蛋白質(zhì)脫水、變性、沉淀的過(guò)程緩慢進(jìn)行，因而滲透性較強(qiáng)，酒精能不斷滲入菌體內(nèi)部，作用于菌體內(nèi)所有的蛋白質(zhì)，最后殺死細(xì)菌，且殺菌作用比較徹底。將經(jīng)酒精浸泡的野生百合蒴果置于火焰上灼燒，直至表面酒精完全揮干，灼燒能使表面酒精加速揮發(fā)，減少殘留酒精對(duì)百合蒴果內(nèi)種子的毒害作用，灼燒本身也能殺死表面的一部分有害菌，利于徹底消毒。所用的野生百合蒴果優(yōu)選為黃綠色或褐色，果實(shí)飽滿且未開裂。因蒴果為綠色時(shí)，種子過(guò)嫩，進(jìn)行無(wú)菌播種不易存活；待蒴果為黃綠色時(shí)，內(nèi)部種子90%以上達(dá)到成熟，褐色蒴果內(nèi)部種子的成熟度更高。蒴果未開裂保證了內(nèi)部種子始終處于無(wú)菌條件，果實(shí)飽滿保證了內(nèi)部種子胚的飽滿，在無(wú)菌播種條件下，種子存活率更高。所述固體培養(yǎng)基的配方為瓊脂8 10g/L，MS粉4 5g/L，蔗糖20 30g/L，pH
5.8 6. O。制備方法為將各原料按配比溶于水，在于100 120°C高溫滅菌15 20min，冷卻凝固即可。胚的發(fā)育傾向于黑暗條件，因此暗培養(yǎng)有助于種子的萌發(fā)，百合種子的最適合萌發(fā)溫度為20 25°C。所述光照培養(yǎng)的條件為光照強(qiáng)度1500 20001UX，溫度25±2°C。光照和溫度影響百合生長(zhǎng)的兩個(gè)重要環(huán)境因子，溫度過(guò)高和過(guò)低均不利于百合的生長(zhǎng)。所述鱗莖植株的組織為它的鱗片、莖段或葉片。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為MS粉I 2g/L、6-BA I. O 2. Omg/L、NAA0. I O. 5mg/L、鹿糖 25 30g/L、瓊脂 8 10g/L。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1500 20001ux，溫度25±2°C。本發(fā)明將無(wú)菌播種后形成的鱗莖植株組織作為野生百合組織培養(yǎng)的外植體，可以控制污染率在5%以下，有效解決了野生百合初代培養(yǎng)中易出現(xiàn)真菌、細(xì)菌污染、繼代培養(yǎng)中易出現(xiàn)內(nèi)生菌污染的問(wèn)題。


圖I為實(shí)施例中藥百合蒴果外觀圖像；圖2為藥百合種子外觀圖像；圖3為藥百合種子無(wú)菌播種30d后的圖像；
圖4為藥百合芽轉(zhuǎn)接40d后的圖像。
具體實(shí)施例方式(I)于10月中下旬采收呈黃綠色或褐色，飽滿，且未開裂的藥百合蒴果。(2)采回的藥百合蒴果及時(shí)攤開并放置于干凈報(bào)紙上2 5d后先用軟毛刷輕輕刷洗干凈，于含I 2滴洗潔精的自來(lái)水中浸洗30min左右，再于流水下沖洗lh。(3)在超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡蒴果45s，用鑷子取出置于酒精燈外焰上灼燒至表面酒精揮發(fā)干凈，無(wú)菌水清洗I遍。(4)用手術(shù)刀輕輕將藥百合蒴果切開，選取胚明顯，胚長(zhǎng)> 1/2種長(zhǎng)的種子(圖I)，輕輕刮掉種皮，后播種于含4. 43g/L MS粉，8g/L瓊脂，蔗糖20g/L，pH 5. 8 6. O的培養(yǎng)基上進(jìn)行黑暗培養(yǎng)(溫度25±2°C)，每皿9粒種子。8d后種子開始萌發(fā)(圖3)，14d后50%以上種子萌發(fā)，30d后種子萌發(fā)率達(dá)90%，形成平均長(zhǎng)Icm左右的芽。(5)將生長(zhǎng)健壯的芽轉(zhuǎn)入相同培養(yǎng)基的柱形瓶中光照培養(yǎng)(光照強(qiáng)度1500 20001UX，溫度25±2°C )，每瓶轉(zhuǎn)接4粒，轉(zhuǎn)后40d瓶?jī)?nèi)形成直徑約為O. 5cm的藥百合帶鱗莖植株，苗高約3 4cm (圖4)。(6)將所得藥百合鱗莖作為二次外植體，使用23號(hào)刀片小心切割成O. 3cmX0. 3cm左右小塊，直接接種于藥百合誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS粉lg/L、6-BA 2mg/L、NAA O. 5mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂8g/L)中誘導(dǎo)培養(yǎng)(培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度1500 20001uX，溫度25±2°C )，每瓶接種3塊，45d左右可形成葉色翠綠、生長(zhǎng)健壯的組培植株，整個(gè)過(guò)程中平均污染率僅為2 %左右(見表I)，且繼代中未再次出現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌。表I 二次外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)中污染情況
權(quán)利要求
1.一種野生百合的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟 (1)取野生百合蒴果，消毒； (2)將消毒后的野生百合蒴果切開，選取生長(zhǎng)飽滿、胚明顯的種子，刮掉種子的種皮，接種于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)； (3)選取萌發(fā)形成的芽，接種于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行光照培養(yǎng)，得到鱗莖植株； (4)以鱗莖植株的組織為外植體，誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的野生百合的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的消毒方法為 將野生百合蒴果洗凈后置于含洗潔精的水中浸洗20 40min，然后在自來(lái)水流下沖洗0.5 lh，再用75%酒精浸泡0. 5 I. 5min。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的野生百合的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，將經(jīng)酒精浸泡的野生百合蒴果置于火焰上灼燒，直至表面酒精完全揮干。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的野生百合的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所用的野生百合蒴果為黃綠色或褐色，果實(shí)飽滿且未開裂。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的野生百合的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的固體培養(yǎng)基的配方為瓊脂8 10g/L，蔗糖20 30g/L，MS粉4 5g/L，pH 5. 8 6. O。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的野生百合的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述暗培養(yǎng)的溫度為 25±2°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的野生百合的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述光照培養(yǎng)的條件為光照強(qiáng)度1500 20001ux，溫度25±2°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的野生百合的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述鱗莖植株的組織為鱗莖植株的鱗片、莖段或葉片。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的野生百合的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為MS 粉 I 2g/L、6-BA I. 0 2. Omg/L、NAA0. I 0. 5mg/L、蔗糖 25 30g/L、瓊脂8 10g/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的野生百合的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1500 20001UX，溫度25±2°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種野生百合的組織培養(yǎng)方法，包括取野生百合蒴果，消毒；將消毒后的野生百合蒴果切開，選取生長(zhǎng)飽滿，胚明顯的種子，刮掉種子的種皮，接種于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)；選取萌發(fā)形成的芽，接種于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行光照培養(yǎng)，得到鱗莖植株；以所述鱗莖植株的組織為外植體，誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗。本發(fā)明將種子無(wú)菌播種后形成的鱗莖植株作為間接外植體，有效降低了野生百合組織培養(yǎng)的污染率，且繼代過(guò)程中不易出現(xiàn)內(nèi)生菌污染。本方法對(duì)外植體材料毒害小，組培成功率較高。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102630567SQ20121011932
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月20日
發(fā)明者吳昀, 夏宜平, 常樂(lè), 張琳, 杜方, 鄭日如 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)