野生百合快速繁殖的組織培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及野生百合快速繁殖的組織培養(yǎng)方法，屬于花卉培養(yǎng)【技術領域】。本發(fā)明方法采用百合的蕾期花梗作為百合組培的外植體，同時在培養(yǎng)前，對花梗作了徹底的消毒，在培養(yǎng)基中除采用6-BA、NAA、IBA作為生長素或激素外，還添加MES作為緩沖劑，有效地控制了組織培養(yǎng)過程中的酸堿度，使pH值長期維持在百合外植體分化、增殖和生長的最適的范圍內，提高了誘導效率和增殖系數(shù)，誘導率為98～100%，每個外植體誘導的不定芽數(shù)不低于15個，增殖系數(shù)為5～7，生根率為100%且根系健壯，適用于雜交后代優(yōu)良單株的安全繁殖，為百合野生資源的保護提供了有效的手段。
【專利說明】野生百合快速繁殖的組織培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及適用于野生百合資源保護性和優(yōu)良雜交后代快速繁殖的組織培養(yǎng)方法，屬于花卉培養(yǎng)【技術領域】。
【背景技術】
[0002]百合是百合科（Liliaceae)百合屬（Lilium)植物的總稱，其花朵碩大，色彩艷麗，具有很高的觀賞、食用及藥用價值。全世界百合野生資源約有100種和變種，其中中國原產約55種和變種，品種近萬個。百合野生資源的收集與保護是百合育種工作的重要基礎，由于人為和自然的影響，一方面自然資源原生境遭破壞嚴重，許多種類面臨滅絕的危險，野生百合種質資源的繁殖保護迫在眉睫。另一方面，現(xiàn)代社會對百合新品種需求旺盛，需要不斷快速推出新品種。而傳統(tǒng)的百合資源收集、繁殖，均是依靠采挖野生百合種球異地種植或使用種球進行組織培養(yǎng)，由于氣候環(huán)境條件差異，使得大量野生種球不能在移植圃中存活保存下來，而廣泛應用的基于種球鱗片的組織培養(yǎng)也常常因為其攜帶的各類共生或非共生真菌、細菌而出現(xiàn)大量初代污染，導致材料廢棄。如此一來，導致重復野外采集，極易對一些重要稀有資源造成毀滅性破壞。同樣情況，也發(fā)生在雜交育種優(yōu)良后代選擇繁育環(huán)節(jié)中。
[0003]已有許多通過組織培養(yǎng)的方法對百合野生資源進行收集和保護的研究，主要都是以種球鱗片為外植體。熊丹等(熊丹，陳發(fā)菊，梁宏偉，等.宜昌百合的組織培養(yǎng)研究福建林業(yè)科技，2007，34 (4) :91-94)以鱗片為外植體對宜昌百合進行了組織培養(yǎng)研究。邱寧宏等(邱寧宏，羅林會，王勤，等.淡黃花百合的組織培養(yǎng)與快速繁殖中國野生植物資源，2004，23(2) :64-65)選取鱗片為外植體，篩選出了適合淡黃花百合的組織培養(yǎng)條件。趙強等(趙強，李慶典，趙玉嶺.青島百合的組織培養(yǎng)技術研究北方園藝，2007,6:213-214)以青島百合的鱗片為外植體，研究了青島百合的組織培養(yǎng)體系。Bakhshaie等（Bakhshaie M, BabalarM, Mirmasoumi M, et al. Somatic embryogenesis and plant regeneration of Liliumledebourii (Baker) Boiss. , an endangered species. Plant Cell, Tissue and OrganCulture (PCTOC), 2010,102 (2) : 229-235.)利用鱗片為外植體，通過誘導出胚型愈傷途徑，建立了莉黛柏蕊百合（Li`lium ledebourii (Baker)Boiss.)的再生體系。陳麗靜等（陳麗靜，葛菱，張麗朝.鮮百合鱗莖誘導及再生體系建立中國農學通報，2011,27 (19) : 121-124)以朝鮮百合的鱗莖為外植體，建立了朝鮮百合的再生體系建立。馬素嫻等(馬素嫻，田志強，亢秀萍.山西野生卷丹百合鱗莖組織培養(yǎng)山西農業(yè)科學，2012,40(4) :319-321)以卷丹百合鱗莖鱗片為外植體，探討影響其分化的主要因素。Burun等（Burun B, Sahin
0.Micropropagation of Lilium candidum L. :a rare and native bulbous flower ofTurkey. Bangladesh Journal of Botany, 2013,42 (I) : 185-187.)以圣母百合（Liliumcandidum L.)的鱗片為外植體，建立了圣母百合的組織擴繁體系。
[0004]百合的鱗莖在離體的條件下，在合適濃度的合適激素的誘導下，會誘導產生不定芽或產生愈傷組織。誘導出的愈傷組織經過分化培養(yǎng)可以分化出不定芽，不定芽進過增殖培養(yǎng)之后，再進行生根誘導，可獲得完整植株，從而達到組織快速繁殖的目的。[0005]百合資源調查、收集工作通常在花期進行，因為花期百合花容易在繁雜的植被叢中被發(fā)現(xiàn)。而果期很難找到百合植株，一般在野外采收種子的難度很大。所以，通常是在花期采挖種球(鱗莖）進行移植或組織培養(yǎng)。但是，花期百合移植成活率極低。
[0006]通常對百合野生資源的組織培養(yǎng)過程中，均選擇百合的鱗片做外植體。這樣就要將百合球挖出帶走，破壞了野生資源。此外，百合鱗莖生長在土壤中，土壤中的微生物種類豐富，鱗片上帶有很多種類真菌或細菌，在進行初代培養(yǎng)時污染率極高。
[0007]如果以地上部分組織如花器官作為外植體，那顯然可以減少在花期資源調查時以采挖種球收集資源材料對資源的破壞，同時，還可能減少外植體帶菌的量，從而減少初代培養(yǎng)的污染損失。同樣也適宜于優(yōu)良雜交后代植株繁殖。
[0008]已報道的以花器官為外植體的試驗均集中在現(xiàn)代栽培品種(如：‘索邦’、‘西伯利亞’)和磨香(鐵炮）百合（lilium Iongiflorum),而且分化率均在90%以下,僅有鐘海豐等(鐘海豐，黃宇翔，鐘淮欽，葉秀仙，黃敏玲.新鐵炮百合花器官組織培養(yǎng)研究.福建農業(yè)學報，2010，25 (2) :207~21，·）的分化率達到90. 8%，但不定芽的增殖率最高只有4. 8%，且生長勢較弱。如果用在野生百合資源培養(yǎng)還涉及到初代污染問題，但均未見報導。劉雅莉，張劍俠，潘學軍(劉雅莉，張劍俠，潘學軍.東方百合’索邦’的花器官培養(yǎng)與快速繁殖.西北植物學報，2004，24 (12) ：2350~2354.)以東方百合‘索邦’的花梗、花托、花瓣和花絲為外植體進行了離體培養(yǎng)與快速繁殖研究。結果表明：4種花器官均可直接誘導產生不定芽，其中花梗在N6基本培養(yǎng)基上誘導率為75. 8%，MS上為72. 2%。賴鐘雄等(賴鐘雄，鄭香洪，張春鎮(zhèn)，陳發(fā)興，林慶良，吳金壽.麝香百合花梗離體培養(yǎng)再生植株.福建農林大學學報(自然科學版）.2004，33 (2):186~188.)以麝香百合的花梗為外植體進行了離體培養(yǎng)再生植株的研究.結果表明在附加2mg. L-1ΒΑ+Ο. lmg. T1NAA的MS培養(yǎng)基花梗培養(yǎng)產生小鱗莖的誘導率可高達86. 67%。在附加O. Smg^1BA的MS培養(yǎng)基上繼代，增殖系數(shù)最高達5.1在附加O. 5mg. T1NAA的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，生根率90%以上。林斯專等(林斯專，鄭香洪，陳發(fā)興.麝香百合花梗組培快繁.福建果樹，2004. 128 (1):8~10.)認為花梗是麝香百合地上都誘導愈傷組織的最適器官，其不定芽分化的最佳培養(yǎng)基配方為MS+BA 2mg.I/1+NAA O. lmg. L-1 ;以花梗為外植體的不定芽的分化率達到86. 67%，增殖培養(yǎng)基以MS+BA
0.Smg.!/1為宜，繁殖系數(shù)達5. I。芽苗生長勢強。王惠和賈桂霞(王惠，賈桂霞.‘西伯利亞’百合多種外植體的組織培養(yǎng)研究.中國觀賞園藝研究進展2007. 185~190.)以‘西伯利亞’的花梗、花絲、子房作為外植體，子房分化能力最強，其中花梗最高分化率50%，子房 58. 3%。誘導其分化的最佳培養(yǎng)基為 MS+6-BA lmg. L-1+NAA O. lmg. L_1+2,4-D O. lmg. L'許潔婷等(許潔婷，王月，唐克軒，唐東芹.麝香百合花部組織離體培養(yǎng)與植株再生.上海交通大學學報（農業(yè)科學版），2008，26 (1) :13~16.)以麝香百合幼嫩花部組織為外植體進行離體培養(yǎng)。研究了不同部位外植體和植物生長調節(jié)物質時其愈傷組織的誘導及植株再生的影響。結果表明。不同外植體誘導愈傷組織的能力不同。由強到弱依次為花絲>花托 > 花梗 > 花柱 > 花瓣。在愈傷組織誘導過程中?；ńz、花托及花梗在培養(yǎng)基MS+NAA
1.Omg. L-1+BA O. 5mg. L-1 上的誘導率都高達 80%。交替在 MS+NAA 1.0mg. L_1+BA O. 5mg. L-1和MS+NAA O. 5mg. L-1+ΒΑ 0. 25mg. L-1兩種培養(yǎng)上培養(yǎng)最有利于愈傷組織的增殖。不定芽的分化以MS+KT 1.0mg. r+NAA O. 5mg. L-1最佳。生根培養(yǎng)基以MS+NAA O. 2mg. L-1效果為好。其中花梗誘導率84. 17%。鐘海豐等(鐘海豐，黃宇翔，鐘淮欽，葉秀仙，黃敏玲.新鐵炮百合花器官組織培養(yǎng)研究.福建農業(yè)學報，2010，25 (2) :207~21，.）以新鐵炮百合的花梗、花托、花瓣、花絲和花柱（去除柱頭）為外植體，進行離體培養(yǎng)及快速繁殖研究。結果表明5種花器官均能直接誘導產生不定芽，其誘導能力大小為花托 > 花梗 > 花絲 > 花瓣、花柱。其中花梗誘導率為90.8%。誘導不定芽的適宜培養(yǎng)基為：MS+2. Omg. L_1 6-BA+O. 2mg. T1NAA。但不定芽的增殖率最高只有4. 8%，且生長勢較弱。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術問題是針對上述現(xiàn)有技術現(xiàn)狀而提供百合花梗組織培養(yǎng)方法，以達到在不破壞百合野生資源的情況下，保證安全、可靠地獲得野生百合種質資源組培苗，從而實現(xiàn)對野生百合資源進行有效保護。
[0010]野生百合快速繁殖的組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0011](1)取蕾期幼嫩花梗，消毒除雜菌，
[0012](2)將幼嫩花?？v切成兩半，再切成段，將縱切面放置于誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)出不定芽，
[0013](3)將誘導出的不定芽接到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，獲得叢生芽，
[0014](4)將叢生芽接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，獲得根系健壯的無菌組培苗。
[0015]所述誘導培養(yǎng)基為:MS+6_BAO. 5mg. L :+NAA I. 5mg. L k 鹿糖 30. 0 g. L ^MES2g. L—1+瓊脂 6. Og. L^pH=S. 8 ~6· O ;增殖培養(yǎng)基為 MS+IBA O. lmg. L—1+蔗糖 60. 0 g. L_1+MES2g. L-1+ 瓊脂 6. Og. ΙΛ ρΗ=5· 8 ~6· O ;生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA O. lmg. L-1+NAA O. lmg.L-1+MES 2g. L-1+ 蔗糖 60.0g. L-1+ 瓊脂 6. Og. ?Λ ρΗ=5. 8 ~6· O。
[0016]所述誘導培養(yǎng)條件為培養(yǎng)條件是溫度（25±2) °C ,遮光,增殖培養(yǎng)條件為培養(yǎng)條件是溫度（25±2) °C，遮光，生根培養(yǎng)條件為培養(yǎng)條件是溫度（25±2) °C，光照（光照強度20001x，光 / 暗周期 16h/8h)。
[0017]所述消毒采取如下順序步驟：先將幼嫩花梗置于含有50%多菌靈500倍液、50mg.L-1鏈霉素和50mg. L-1青霉素的水溶液中，150rpm振蕩3~5h進行前消毒處理；然后將花梗置于75%酒精中浸泡震蕩20~30s，最后放入10%次氯酸鈉溶液中浸泡震蕩13min，用無菌水沖洗3次，每次沖洗I~2min。
[0018]所述切段的長度為1cm。
[0019]本方法選用百合的蕾期花梗作為百合組培的外植體，避免了對百合野生資源的破壞，而且花梗為地上組織，帶菌少，以花梗作為外植體時的初代培養(yǎng)污染率較低，分化率高。在培養(yǎng)基中添加MES緩沖劑，有利于高誘導率和增殖系數(shù)的獲得，為百合野生資源的保護提供了有效的手段。
[0020]本發(fā)明所選用的花梗是蕾期幼嫩的材料，幼嫩的組織材料再生能力較老化組織強。
[0021]外植體的徹底消毒是保證得到無菌苗的關鍵。前消毒條件是將花梗置于含有50%多菌靈500倍液、50mg. L_1農用鏈霉素和50mg. L_1農用青霉素的水溶液中，150rpm振蕩3~5h。多菌靈是一種廣譜性殺真菌劑，其作用原理為干擾病原菌有絲分裂中紡錘體的形成，影響細胞分裂，從而起到殺真菌的作用。青霉素是一種主要對革蘭氏陽性菌有強大抗菌作用，對一些革蘭氏陰性菌也有較強作用的β_內酰胺類抗生素，農用鏈霉素是一種主要對一些革蘭氏陰性菌有較強抗菌作用氨基糖苷類抗生素。將三種不同類型的殺菌劑混合使用可以針對不同類型的細菌和真菌同時進行全面滅菌從而降低外植體在初代培養(yǎng)中的污染率；外植體后消毒條件是75%酒精中浸泡震蕩20~30s，10%次氯酸鈉溶液，浸泡震蕩13min。次氯酸納是一種氧化性殺菌劑，但是在殺滅細菌和真菌的同時也會對植物細胞造成傷害，用次氯酸鈉消毒的時間過短，則達不到徹底滅菌的效果；滅菌時間過長則會對外植體造成傷害。優(yōu)選的百合花梗進行次氯酸鈉消毒的時間是13min，次氯酸鈉濃度時10%。花梗滅完菌之后，要清洗干凈殘留的次氯酸鈉，以免對外植體造成傷害。優(yōu)選的洗滌方式是無菌水沖洗3次，沖洗時間I~2min。
[0022]以花梗作為外植體進行初代培養(yǎng)時，要將花?？v切成兩半，縱切面接觸培養(yǎng)基。這樣有利于不定芽的產生。優(yōu)選的花梗長度是Icm左右。
[0023]pH值是影響外植體分化生長的關鍵因素，大量研究表明pH在5. 8~6. O時有利于百合花梗外植體的分化及生長。外植體在培養(yǎng)的過程中，會分泌許多代謝產物與培養(yǎng)基中，從而改變培養(yǎng)基的pH，不利于外植體的分化及生長，MES的名稱為2-(N-嗎啡啉）乙磺酸，是一種酸性緩沖液，當培養(yǎng)基加入一定濃度MES時，可以使培養(yǎng)基的pH值維持在一定范圍之內。優(yōu)選的MES濃度為2g. L-I。
[0024]本發(fā)明方法采用百合的蕾期花梗作為百合組培的外植體，同時在培養(yǎng)前，對花梗作了徹底的消毒，在培養(yǎng)基中除采用6-BA、NAA、IBA作為生長素或激素外，還添加MES作為緩沖劑，有效地控制了組織培養(yǎng)過程中的酸堿度，使PH值長期維持在百合外植體分化、增殖和生長的最適的范圍內，提高了誘導效率和增殖系數(shù)，誘導率為98~100%，每個外植體誘導的不定芽數(shù)不低于15個，增殖系數(shù)為5~7，生根率為100%且根系健壯，適用于雜交后代優(yōu)良單株的安全繁殖，為百合野生資源的保護提供了有效的手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖I為實施例I中淡`黃花百合（Lilium sulphureum Baker)花梗外植體誘導培養(yǎng)20d時情況。
[0026]圖2為實施例I中淡黃花百合（Lilium sulphureum Baker)花梗外植體誘導培養(yǎng)35d時情況。
[0027]圖3為實施例I中淡黃花百合（Lilium sulphureum Baker)不定芽增殖培養(yǎng)23d情況。
[0028]圖4為實施例I中淡黃花百合（Lilium sulphureum Baker)叢生芽誘導生根培養(yǎng)30d情況。
[0029]圖5為實施例2中宜昌百合（Lilium leucanthum (Baker) Baker)花梗外植體誘導培養(yǎng)34d時情況。圖6為實施例2中宜昌百合（Lilium leucanthum (Baker) Baker)不定芽增殖培養(yǎng)20d情況。
[0030]圖I為實施例2中宜昌百合（Lilium leucanthum (Baker) Baker)叢生芽誘導生根培養(yǎng)32d情況。
【具體實施方式】
[0031]下面結合實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步詳細描述。[0032]野生百合快速繁殖的組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0033]I)取蕾期幼嫩花梗置于含有50%多菌靈500倍液、50mg. l1農用鏈霉素和50mg.L-1農用青霉素的水溶液中，150rpm振蕩3~5h進行前消毒處理；
[0034]2)將前處理過的花梗置于75%酒精中浸泡震蕩20~30s，再放入10%次氯酸鈉溶液中浸泡震蕩13min，用無菌水沖洗3次，每次沖洗I~2min ；
[0035]3)切取幼嫩花梗，縱切成兩半，切成一厘米左右，將花梗的縱切面放置于誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是溫度（25±2) °C，遮光； [0036]4)誘導出的不定芽轉接到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，獲得叢生芽，培養(yǎng)條件是溫度（25±2) °C，遮光；
[0037]5)將叢生芽移接到生根培養(yǎng)基上進行生根，獲得無菌苗。培養(yǎng)條件是溫度(25±2) °C，光照(光照強度20001x，光/暗周期16h/8h)。
[0038]其中，所述花梗的誘導培養(yǎng)基為：MS+6-BA O. 5mg. 1'+ΝΑΑ I. 5mg. L—1+蔗糖30.0g.L^+MES 2g. L—1+瓊脂 6. Og. L—1，pH=5. 8 ~6. 0 ;不定芽的增殖培養(yǎng)基為 MS+IBA O. lmg. L—1+蔗糖 60. 0g. L_1+MES 2g. l1+ 瓊脂 6. 0g. L_1,pH=5. 8 ~6· 0 ;生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA O. lmg.L-1+NAA O. lmg. L_1+MES 2g. L-1+ 蔗糖 60.0g. L-1+ 瓊脂 6. Og. ?Λ ρΗ=5. 8 ~6· O。
[0039]實施例I
[0040]I)將從云南采集的淡黃花百合（Lilium sulphureum Baker)的幼嫩花梗置于含有50%多菌靈500倍液、50mg. l1農用鏈霉素和50mg. l1農用青霉素的水溶液中，150rpm振蕩3h進行前消毒處理；
[0041]2)將前處理過的花梗置于75%酒精中浸泡震蕩20s，再放入10%次氯酸鈉溶液中浸泡震蕩13min，用無菌水沖洗3次，每次沖洗Imin ；
[0042]3)切取幼嫩花梗，縱切成兩半，切成一厘米左右，將花梗的縱切面放置于誘導培養(yǎng)基（MS+6-BA O. 5mg. L_1+NAA I. 5mg. L-1+蔗糖 30. 0g. L-1+MES 2g. L-1+瓊脂 6. 0g. l1，ρΗ=5. 8~6. O)上進行誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是溫度（25±2) °C，遮光；如圖I、圖2所示
[0043]4)5d后，誘導出不定芽，將誘導出的不定芽轉接到增殖培養(yǎng)基（MS+IBA O. Img.l1+ 蔗糖 60. 0g. L^+MES 2g. L-1+ 瓊脂 6. Og. ?ΛρΗ=5· 8 ~6· O)上進行增殖培養(yǎng)，34 d 獲得叢生芽。培養(yǎng)條件是溫度（25±2)°C，遮光；如圖3所示，
[0044]5)將叢生芽移接到生根培養(yǎng)基(1/2MS+IBA O. lmg. L^+NAA O. lmg. L-1+蔗糖60. 0g. r1+MES2g. L-1+瓊脂6. 0g. L-1，pH=5. 8~6. O)上進行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件：溫度（25±2) °C，光照(光照強度20001x，光/暗周期16h/8h);如圖4所示。
[0045]本實驗污染率為0%，不定芽誘導率為100%，增值系數(shù)為5. 5，生根率為100%(表1)。Icm左右的花梗初代培養(yǎng)之后平均能獲得25個不定芽。
[0046]表1淡黃花百合花梗不定芽誘導分化增殖情況
[0047]
【權利要求】
1.野生百合快速繁殖的組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟： (1)取蕾期幼嫩花梗，消毒除雜菌， (2)將幼嫩花?？v切成兩半，再切成段，將縱切面放置于誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)出不定芽， (3)將誘導出的不定芽接到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，獲得叢生芽， (4)將叢生芽接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，獲得根系健壯的無菌組培苗。 所述誘導培養(yǎng)基為：MS+6-BA O. 5mg. L、NAA I. 5mg. L1+ 蔗糖 30.0 g. L_1+MES 2g. L1+瓊脂 6. Og. ΙΛ ρΗ=5· 8 ~6. O ;增殖培養(yǎng)基為 MS+IBA O. lmg. L1+ 蔗糖 60.0 g. L_1+MES2g. L-1+ 瓊脂 6. Og. ΙΛ ρΗ=5· 8 ~6· O ;生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA O. lmg. L-1+NAA O. lmg.L-1+MES 2g. L-1+ 蔗糖 60. 0g. L-1+ 瓊脂 6. O g. ?Λ ρΗ=5. 8 ~6· O。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，所述誘導培養(yǎng)條件為培養(yǎng)條件是溫度（25±2)°C，遮光，增殖培養(yǎng)條件為培養(yǎng)條件是溫度（25±2) °C ,遮光，生根培養(yǎng)條件為培養(yǎng)條件是溫度(25±2) °C，光照強度20001x，光/暗周期16h/8h。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，所述消毒采取如下順序步驟：先將幼嫩花梗置于含有50%多菌靈500倍液、50mg. L—1鏈霉素和50mg. L—1青霉素的水溶液中，150rpm振蕩3~5h進行前消毒處理；然后將花梗置于75%酒精中浸泡震蕩20~30s，最后放入10%次氯酸鈉溶液中浸泡震蕩13min，用無菌水沖洗3次，每次沖洗I~2min。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，所述切段的長度為1cm。
【文檔編號】A01H4/00GK103704136SQ201310722214
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權日:2013年12月24日
【發(fā)明者】明軍, 袁素霞, 劉春 , 徐雷鋒 申請人:中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所