專利名稱：一種研究黃芩組織培養(yǎng)快速繁殖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種研究黃芩組織培養(yǎng)快速繁殖的方法。
背景技術(shù)：
黃芩具有清熱瀉火、消炎鎮(zhèn)痛等藥理作用，在臨床上療效確切，作為常用的藥材品種，應(yīng)用歷史悠久，需求數(shù)量較大。目前，黃芩產(chǎn)業(yè)已經(jīng)形成具有一定規(guī)模、結(jié)構(gòu)較為完整的產(chǎn)業(yè)體系，特別是近年來呈現(xiàn)出快速增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，成為醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)中重要的組成部分。近幾年來，市場(chǎng)上對(duì)黃芩供不應(yīng)求的矛盾日益突出，這是由于臨床上對(duì)黃芩藥材的需求量逐年上升，而現(xiàn)實(shí)是有限的黃芩野生資源遭到掠奪性挖掘后的日益匱乏，同時(shí)該植物繁殖速度慢，加之少有栽培，并且缺乏可行的組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)黃芩進(jìn)行繁殖，尚未獲得黃芩愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體及培養(yǎng)基配方。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種研究黃芩組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，旨在解決目前黃芩的野生資源日益匱乏，繁殖速度慢，加之少有栽培，市場(chǎng)上供不應(yīng)求的矛盾日益突出，并且缺乏可行的組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)黃芩進(jìn)行繁殖，尚未獲得黃芩愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體及培養(yǎng)基配方的問題。本發(fā)明的目的在于提供一種研究黃芩組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，所述方法包括以下步驟對(duì)黃芩的種子進(jìn)行處理，獲得接種外植體；對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理；對(duì)培養(yǎng)基配方進(jìn)行篩選；對(duì)黃芩的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)；篩選出最佳外植體和最佳激素組合。本發(fā)明提供的研究黃芩組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，首先對(duì)黃芩的種子進(jìn)行處理， 獲得接種外植體，其次對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理，同時(shí)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方，在無菌條件下對(duì)黃芩的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，篩選出最佳外植體和最佳激素組合，為利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)黃芩進(jìn)行快速、大規(guī)模繁殖提供了可能，有效地解決了目前黃芩的野生資源日益匱乏，繁殖速度慢，市場(chǎng)供不應(yīng)求等日益突出的矛盾，同時(shí)也解決尚未獲得黃芩愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體及培養(yǎng)基配方等問題，方法簡(jiǎn)單可行，操作性強(qiáng)，為建立黃芩組培再生體系奠定了基礎(chǔ)。


圖1示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的研究黃芩組織培養(yǎng)快速繁殖的方法的實(shí)現(xiàn)流程圖；圖2示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理的實(shí)現(xiàn)方法的流程圖3示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的對(duì)培養(yǎng)基配方進(jìn)行篩選實(shí)現(xiàn)方法的流程圖；圖4示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的對(duì)黃芩的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)的實(shí)現(xiàn)方法的流程圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明， 并不用于限定發(fā)明。圖1示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的研究黃芩組織培養(yǎng)快速繁殖的方法的實(shí)現(xiàn)流程。該方法包括以下步驟在步驟SlOl中，對(duì)黃芩的種子進(jìn)行處理，獲得接種外植體；在步驟S102中，對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理；在步驟S103中，對(duì)培養(yǎng)基配方進(jìn)行篩選；在步驟S104中，對(duì)黃芩的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)；在步驟S105中，篩選出最佳外植體和最佳激素組合。在本發(fā)明實(shí)施例中，對(duì)黃芩的種子進(jìn)行處理，獲得接種外植體的實(shí)現(xiàn)方法為將種子在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，白天溫度為25°C左右，光強(qiáng)2000 25001x光照12 小時(shí)，晚上為20°C左右，每天澆水一次，保持相對(duì)濕度70% 80%左右。待黃芩種子發(fā)芽長(zhǎng)出4 6片真葉時(shí)，取植株的根尖、莖及葉片作為接種的外植體。如圖2所示，在本發(fā)明實(shí)施例中，對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理的實(shí)現(xiàn)方法為在步驟S201中，將黃芩幼苗從培養(yǎng)箱中取出，放入盆中，用自來水沖洗；在步驟S202中，待泥沙沖洗干凈后取出，放入白瓷盤置于超凈工作臺(tái)上，取滅菌過的三角燒瓶將幼苗放入，用75%的酒精浸泡10s，棄酒精，用無菌水沖洗3次；在步驟S203中，緊接著用0. 升汞消毒10 12min ； 在步驟S204中，去升汞后再用無菌水沖洗5 6次，置于無菌的培養(yǎng)皿中，獲得無菌外植體進(jìn)行接種。如圖3所示，在本發(fā)明實(shí)施例中，對(duì)培養(yǎng)基配方進(jìn)行篩選實(shí)現(xiàn)方法為在步驟S301中，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后選6個(gè)不同激素組合配方進(jìn)行外植體接種；在步驟S302中，在比較了愈傷組織誘導(dǎo)效果后，從以上6個(gè)不同激素組合配方中選出一個(gè)配方；在步驟S303中，再進(jìn)行梯度試驗(yàn)確定適宜黃芩愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方。在本發(fā)明實(shí)施例中，6個(gè)不同激素組合配方如下配方1 :MS+NAA 0. 5mg/L+KT 0. 5mg/L ；配方2:MS+NAA 1. 0mg/L+2,4D 1· Omg/L+6-BA 1. Omg/L ；配方3 :MS+NAA 1. Omg/L+TDZ 1. Omgm ；配方4 :MS+NAA0. 5mg/L+6_BA 0. 5mg/L ；配方5 :MS+IBA0. 5mg/L+6_BA 0. 5mg/L ；配方6 :MS+IBA0. 5mg/L+KT 0. 5mg/L。
如圖4所示，在本發(fā)明實(shí)施例中，對(duì)黃芩的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)的實(shí)現(xiàn)方法為在步驟S401中，選取黃芩無菌外植體，即取根、莖、葉各部分，分別將莖和根切成 2cm左右長(zhǎng)的小段，葉片切成0. 5cmX0. 5cm小塊，并在上劃上創(chuàng)傷口 ；在步驟S402中，將處理好的材料分別接種在6個(gè)不同配方的培養(yǎng)基上，每個(gè)配方的培養(yǎng)基接種根、莖、葉各15瓶，每瓶接種外植體約6 8個(gè)；在步驟S403中，誘導(dǎo)愈傷組織的條件為25°C培養(yǎng)箱中采用暗培養(yǎng)；在步驟S404中，暗培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計(jì)各處理的愈傷組織誘導(dǎo)率。在本發(fā)明實(shí)施例中，誘導(dǎo)率的計(jì)算方法為誘導(dǎo)率％ =(形成愈傷組織外植體塊數(shù)/種外植體塊數(shù))X 100在本發(fā)明實(shí)施例中，篩選最佳激素組合的濃度的實(shí)現(xiàn)方法為
將最適激素組合設(shè)置4個(gè)不同的濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn)；采用根、莖、葉中誘導(dǎo)率較高者做外植體，在以上4個(gè)不同濃度激素組合的培養(yǎng)基上接種；暗培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算黃芩愈傷組織誘導(dǎo)率。在本發(fā)明實(shí)施例中，4個(gè)不同的濃度梯度如下1)MS+NAA 0. 25mg/L+X 0. 25mg/L ；2)MS+NAA 0. 25mg/L+X 0. 5mg/L ；3)MS+NAA0. 5mg/L+X lmg/L ；4)MS+NAA 0. 25mg/L+X lmg/L ；其中X為 6_BA、KT、TDZ 中的一者。下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。本發(fā)明實(shí)施例提供的研究黃芩組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，首先對(duì)黃芩的種子進(jìn)行處理，獲得接種外植體，其次對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理，同時(shí)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方，在無菌條件下對(duì)黃芩的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，篩選出最佳外植體和最佳激素組合，為利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)黃芩進(jìn)行快速、大規(guī)模繁殖提供了可能，有效地解決了目前黃芩的野生資源日益匱乏，繁殖速度慢，市場(chǎng)供不應(yīng)求等日益突出的矛盾，同時(shí)也解決尚未獲得黃芩愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體及培養(yǎng)基配方等問題，方法簡(jiǎn)單可行，操作性強(qiáng)，為建立黃芩組培再生體系奠定了基石出。以上僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種研究黃芩組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 對(duì)黃芩的種子進(jìn)行處理，獲得接種外植體；對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理； 對(duì)培養(yǎng)基配方進(jìn)行篩選； 對(duì)黃芩的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)； 篩選出最佳外植體和最佳激素組合。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述對(duì)黃芩的種子進(jìn)行處理，獲得接種外植體的實(shí)現(xiàn)方法為將種子在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，白天溫度為25°C左右，光強(qiáng)2000 25001x光照12小時(shí)， 晚上為20°C左右，每天澆水一次，保持相對(duì)濕度70% 80%左右。待黃芩種子發(fā)芽長(zhǎng)出4 6片真葉時(shí)，取植株的根尖、莖及葉片作為接種的外植體。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理的實(shí)現(xiàn)方法為 將黃芩幼苗從培養(yǎng)箱中取出，放入盆中，用自來水沖洗；待泥沙沖洗干凈后取出，放入白瓷盤置于超凈工作臺(tái)上，取滅菌過的三角燒瓶將幼苗放入，用75%的酒精浸泡10s，棄酒精，用無菌水沖洗3次； 緊接著用0. 升汞消毒10 12min ；去升汞后再用無菌水沖洗5 6次，置于無菌的培養(yǎng)皿中，獲得無菌外植體進(jìn)行接種。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述對(duì)培養(yǎng)基配方進(jìn)行篩選實(shí)現(xiàn)方法為 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后選6個(gè)不同激素組合配方進(jìn)行外植體接種；在比較了愈傷組織誘導(dǎo)效果后，從以上6個(gè)不同激素組合配方中選出一個(gè)配方； 再進(jìn)行梯度試驗(yàn)確定出適宜黃芩愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方。
5.如權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述6個(gè)不同激素組合配方如下 配方 1 :MS+NAA 0. 5mg/L+KT 0. 5mg/L ；配方 2:MS+NAA 1. 0mg/L+2，4-D 1. Omg/L+6-BA 1. Omg/L ； 配方 3 :MS+NAA 1. Omg/L+TDZ 1. Omg/L ； 配方 4 :MS+NAA0. 5mg/L+6-BA 0. 5mg/L ； 配方 5 :MS+IBA0. 5mg/L+6-BA 0. 5mg/L ； 配方 6 :MS+IBA0. 5mg/L+KT 0. 5mg/L。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述對(duì)黃芩的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)的實(shí)現(xiàn)方法為選取黃芩無菌外植體，即取根、莖、葉各部分，分別將莖和根切成2cm左右長(zhǎng)的小段，葉片切成0. 5cmX0. 5cm小塊，并在上劃上創(chuàng)傷口 ；將處理好的材料分別接種在6個(gè)不同配方的培養(yǎng)基上，每個(gè)配方的培養(yǎng)基接種根、莖、 葉各15瓶，每瓶接種外植體約6 8個(gè)；誘導(dǎo)愈傷組織的條件為25°C培養(yǎng)箱中采用暗培養(yǎng)； 暗培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計(jì)各處理的愈傷組織誘導(dǎo)率。
7.如權(quán)利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)率的計(jì)算方法為 誘導(dǎo)率％ =(形成愈傷組織外植體塊數(shù)/接種外植體塊數(shù))X 100。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述篩選最佳激素組合的濃度的實(shí)現(xiàn)方法為將最適激素組合設(shè)置4個(gè)不同的濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn)；采用根、莖、葉中誘導(dǎo)率較高者做外植體，在以上4個(gè)不同濃度激素組合的培養(yǎng)基上接種；暗培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算黃芩愈傷組織誘導(dǎo)率。
9.如權(quán)利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述4個(gè)不同的濃度梯度如下 DMS+NAA 0. 25mg/L+X 0. 25mg/L ；2)MS+NAA0. 25mg/L+X 0. 5mg/L ；3)MS+NAA0.5mg/L+X lmg/L ；4)MS+NAA0. 25mg/L+X lmg/L ； 其中=X為6_BA、KT、TDZ中的一者。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，提供了一種研究黃芩組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，首先對(duì)黃芩的種子進(jìn)行處理，獲得接種外植體，其次對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理，同時(shí)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方，在無菌條件下對(duì)黃芩的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，篩選出最佳外植體和最佳激素組合，為利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)黃芩進(jìn)行快速、大規(guī)模繁殖提供了可能，有效地解決了目前黃芩的野生資源日益匱乏，繁殖速度慢，市場(chǎng)供不應(yīng)求等日益突出的矛盾，同時(shí)也解決尚未獲得黃芩愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體及培養(yǎng)基配方等問題，方法簡(jiǎn)單可行，操作性強(qiáng)，為建立黃芩組培再生體系奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102550422SQ201210057290
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月7日
發(fā)明者于浩, 吳俊燕, 徐根娣 申請(qǐng)人:浙江師范大學(xué)