專利名稱：水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是ー種生物工程技術領域中的水稻株系創(chuàng)制的方法，具體是ー種水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法及其用途、恢復不育性狀的方法。
背景技術：
水稻是世界上主要的糧食作物之一，更是我國最重要的糧食作物。中國是世界上最大的稻米生產國和消費國，約有60%以上的國人以稻米為主食。我國水稻年播種面積超過3000萬公頃，占世界的20%，占全國糧食作物播種面積的30%;2011年，水稻總產量I. 987億噸，占糧食總產量的42%，単位面積產量比所有糧食作物平均單產高出45%以上；單位面積產量6. 35噸/公頃，比全球平均產量3. 85噸/公頃高65%。其中ー個重要因素就是雜交水稻的廣泛種植。
雄性不育系是指ー種雄性退化(主要是花粉退化)但雌蕊正常的母水稻，由于花粉無カ生活，不能自花授粉結實，只有依靠外來花粉才能受精結實，因此借助這種母水稻作為遺傳工具，通過人工輔助授粉的方法，就能產生大量雜交種子。從育種戰(zhàn)略上看，雜交水稻的發(fā)展可以分為三系法、兩系法和一系法三個發(fā)展階段。每進入一個新階段，都是育種上的一次突破，從而會把水稻的產量提高到ー個新臺階。現(xiàn)在生產上用的雜交水稻屬于三系法品種間雜交優(yōu)勢利用的范疇，這種三系雜交稻一般要比常規(guī)水稻增產20%左右，當前仍處于方興未艾時期。但是，三系法雜交水稻種子優(yōu)勢表現(xiàn)復雜，受恢復系和保持系關系限制，使優(yōu)良組合的篩選比較困難。因此，科學家一直在篩選和培育新的不育系，以期擴展細胞質背景，為遠緣雜交和雜種優(yōu)勢的利用奠定基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，提供一種水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法及其用途、恢復雄性不育性狀的方法，利用EATl基因及其蛋白參與調控水稻雄性生殖的特點，及其利用轉基因技術控制水稻雄性生殖發(fā)育，通過突變該蛋白序列或抑制該蛋白的表達產生新的水稻雄性不育株系，在農業(yè)生產上具有十分重要的應用。第一方面，本發(fā)明涉及一種水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，包括如下步驟選擇常規(guī)水稻品種，處理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述處理為，(a)采用常規(guī)基因工程方法，敲除或者改變編碼如SEQ ID NO. 3所示氨基酸的核苷酸序列，使所示氨基酸序列發(fā)生缺失或變異，進而使得所述氨基酸序列對應多肽的活性水平下降或喪失；或者(b)采用常規(guī)基因工程方法，抑制或者降低編碼如SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列的核苷酸序列的表達，降低所述氨基酸序列對應多肽的表達水平。優(yōu)選地，所述水稻品種為粳稻品種9522、秈稻品種廣陸矮4號、龍?zhí)馗蚨i稻品種9311。優(yōu)選地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
優(yōu)選地，所述水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法包括如下步驟采用常規(guī)基因工程方法，使常規(guī)水稻品種中如SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列突變?yōu)镾EQ ID NO. 4，培育，進而獲得所述水稻雄性不育株系，即eat I突變體。優(yōu)選地，所述水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法包括如下步驟構建所述基因的RNA干擾植物表達載體，轉化水稻植株，進而獲得所述水稻雄性不育株系。第二方面，本發(fā)明還涉及前述方法獲得的水稻雄性不育株系在水稻制種中的用途，其特征是，所述用途為(a)以所述水稻雄性不育株系做為常規(guī)育種的雄性不育材料，進行育種；或者(b)以所述水稻雄性不育株系作為母本，進行雜交育種。第三方面，本發(fā)明還涉及恢復前述方法獲得的水稻雄性不育株系的雄性不育性狀的方法，將EATl互補根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens )EHA105轉入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中EATl互補構建含有編碼如SEQ ID NO. I所示核苷酸；具體包括如下步驟(a)提供攜帶表達載體的EATl互補根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105 ；(b)將水稻細胞或組織或器官與步驟(a)中的農桿菌接觸，從而使編碼如SEQ IDNO. I所示的核苷酸轉入水稻細胞，并且整合到水稻細胞的染色體上；(c)選擇轉入所述核苷酸的水稻細胞或組織，再生，獲得水稻植株。優(yōu)選地，所述編碼如SEQ ID NO. 3所示氨基酸的核苷酸如SEQ ID NO. 2所示。本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明通過控制水稻HLH結構域的轉錄因子EATl基因及其編碼蛋白獲得水稻雄性生殖發(fā)育的變異株，實現(xiàn)控制水稻生殖過程；本發(fā)明獲得的水稻突變體在營養(yǎng)期與來源親本無明顯差異，進入生殖生長階段后雄性生殖發(fā)育異常，花粉敗育，得到完全不育的植株，在雜交水稻構建和農業(yè)生產上具有十分重要的應用。


圖I為pHB載體及EATl干擾構建示意圖。圖2為eatl突變體植株的形態(tài)學觀察示意圖。圖3為互補突變體得到野生型表型示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進ー步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆實驗室手冊'(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。所述EATl基因為編碼如SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列的核苷酸序列。實施例I、水稻雄件不育株系創(chuàng)制的方法I. I通過基因工程或其他手段創(chuàng)制eatl水稻雄性不育株系本實施例中EATl基因的編碼區(qū)序列如SEQ ID NO. 3所示。本實施例的eatl突變材料是由常規(guī)粳稻品種武育粳7號(又名9522)經過對EATl基因的RNA干擾或者序列變異獲得。I. 2水稻育性控制蛋白基因的克隆利用發(fā)明人構建的包含育性控制蛋白基因EATl及其突變基因eatl組成的、本領域內技術人員清楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或position cloning)群體，按分子標記定位于I個小的基因組片段內，例如IOOKb內。在此基礎上，用常規(guī)方法分離包含該片段的基因組DNA克隆。經測序和進ー步的雜交鑒定確定其中一個含完整水稻雄性生殖發(fā)育控制蛋白EATI。經全核苷酸序列分析結果表明水稻雄性育性EATl基因全長為3433bp (SEQ IDNO. 6，包含調控區(qū)和內含子)。經軟件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID NO. 2所示，編碼全長為464個氨基酸的水稻雄性生殖發(fā)育控制蛋白，其序列如SEQ ID NO. 3所示。I. 3水稻育性控制蛋白基因的點突變本實施例的eatl突變材料是由常規(guī)粳稻品種武育粳7號(又名9522)經過對EATl基因的序列變異獲得，經過對EATl突變基因eatl的序列比較，水稻雄性生殖發(fā)育控制蛋白的移碼和提前終止會使得水稻雄性生殖器官不能正常發(fā)育，造成植株不育；本實施例EATl突變基因是在編碼區(qū)的2個堿基對缺失(其序列如SEQ ID NO. 4所示)引起水稻雄性生殖發(fā)育控制蛋白翻譯得提前終止和功能喪失。I. 4通過RNAi手段降低水稻品種中的EATl的表達水平為了對EATl蛋白進行應用，構建了 EATl基因RNAi的載體，并轉化野生型9522植株，以期降低EATl的表達，從而達到改變水稻育性的目的。從水稻cDNA克隆(EAT1_EST clone)中用引物EAT I-R i_F:5，AAGAGCTCGAATTCCCACCTTCAACATCAACTAGA 3，和EAT I-R i_R:5’AAACTAGTCTGCAGCAATAATCACATCTCGTTCGT 3’擴增出EATl基因編碼區(qū)序列的第197位至第688位共491bp的特異性片段；將這個片段分別通過EcoRI/PstI和Sacl/Spel正反向插入連入加入含有水稻Intron序列的pBluescript SK載體；測序驗證正確，再用EcoRI和SpeI酶切切下含有EATl正反向特異性片段和Intron和片段，連入經同樣酶切的pHB載體中(圖I)。再次測序檢驗核苷酸序列是否正確，成功構建pHB-EATl-RNAi質粒。將含有EATl基因RNA干擾構建的農桿菌在含有Kan (50 μ g/ μ I)的YEB平板上劃線，獲的單菌落。挑單菌落接種到3ml含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中于28°C振蕩培養(yǎng)過夜，第2天按1%接種量轉接入50ml含抗生素的AB液體培養(yǎng)基中，200rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600為0. 6至0. 8左右吋，將新鮮的農桿菌菌液于5000rpm、4離心5分鐘，收集并重懸于1/3體積的AAM液體培養(yǎng)基中，此時即可用于轉化水稻各種受體材料。本實施例采用常規(guī)的農桿菌轉化方法轉化水稻9522的幼胚愈傷。取授粉后12-15天的9522未成熟種子經70%こ醇浸泡I分鐘后，于NaClO溶液中(與水1:3混合，加2_ 3滴吐溫20)消毒90分鐘以上，用無菌水沖洗4-5次，然后用解剖刀和鑷子挑出幼胚并接種月N6D2培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，在26± I°C、避光條件下培育，4天后可用于轉化。將幼胚愈傷浸泡入新鮮的AAM農桿菌菌液中并不時搖動，20分鐘后將水稻材料移出，在無菌濾紙上吸去過多的菌液，隨即轉移到N6D2C培養(yǎng)基上，于26°C共培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)時，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入こ酰丁香酮，使用濃度為ΙΟΟμΜ。3天后，從共培養(yǎng)培養(yǎng)基上取出愈傷組織，切去胚芽并轉入含有25mg/L Hyg的選擇培養(yǎng)基上進行選擇培養(yǎng)。7_12天后將抗性愈傷組織轉到含有50mg/L Hyg的選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選。10-12天后生長旺盛的抗性愈傷組織轉移到預分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周左右，再移至分化培養(yǎng)基上分化(12小時光照/天)。再生的小苗在1/2M4H培養(yǎng)基上生根壯苗，隨后移入人工氣候室營養(yǎng)液栽培。獲得的再生植株移栽成活后以除草劑再次篩選轉化植株；陽性植株提取葉片總DNA，經PCR進ー步鑒定轉化植株。RT-PCR分析陽性植株中EATl基因的表達水平，表達水平降低到野生型20%以下為有效RNA干擾植株。I. 5EAT1蛋白活性喪失或表達水平導致水稻雄性發(fā)育異常對eatl突變體植株的形態(tài)學觀察。如圖2，野生型和突變型eatl的表型對比顯示，野生型花藥發(fā)育成熟期花藥呈黃色(B)，其中含有豐富的淀粉?？杀籌2/KI染成藍色(Α，B,C)，而eatl突變型花藥較野生型略小，呈淡黃色；與野生型花藥成熟期相對應的時期已經幾乎觀察不到花粉粒，剖開藥室腔只能看到少數(shù)退化的小孢子殘留物，更無法被I2/KI著色。 I. 6EATl 表達特征利用eatl突變株的來源親本9522各個器官組織，提取RNA，進行反轉錄得到cDNA第一鏈，利用熒光定量PCR的方法確定EATl基因的表達模式(如圖3)，發(fā)現(xiàn)EATl基因在水稻雄性生殖發(fā)育時期有著廣泛且顯著的表達；除此之外，營養(yǎng)發(fā)育過程中的根、莖和葉中也有極微弱的表達。I. 7EAT1基因在創(chuàng)制其他水稻品系雄性不育株系中的應用將eatl突變體與秈稻品種9311、龍?zhí)馗驈V陸矮4號水稻品系雜交，在F2代中具有秈型特征的植株中均出現(xiàn)了雄性不育株系，符合3:1分離規(guī)律，進而證明EATl基因在其他水稻品種中發(fā)生核苷酸序列變化時，同樣可以產生雄性不育植株。實施例2eatl突變體在水稻制種中的用涂將eatl突變體作為父本與三系或兩系雜交組合中的不育親本雜交，得到Fl代。在F2代中篩選同時具有雄性不育及不育特征的植株，將該植株與原不育親本對應的保持系雜交。再次在F2代中篩選同時具有雄性不育及不育特征的植株與保持系雜交，經多代雜交篩選后獲得新的雄性不育不育系，適宜作為雜交組合中的母本。實施例3恢復eatl突變體雄件不育件狀的方法將編碼EATl基因的基因組核苷酸序列轉入突變體eatl植株，能夠使突變體恢復到野生型表型。從水稻日本睛BAC克隆(0SJNba0093F12)中用引物EAT 1-C0M-F:5，AAAAGTCGACCCGAACTGCCGTCTTAATGT 3，和EAT I-COM-R: 5，AAAAGGTGACCGCAGTGACCAGATTGAGATAAC3，擴增出EATl基因的5225bp的基因組序列片段。將該片段通過Sal I和BstEII插入到用于轉化水稻的雙元載體pCAMBIA1301載體中；測序驗證正確，該載體通過電擊導入根瘤農桿菌EHA105，得到EATl互補根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105,使用遺傳轉化手段轉化突變體eatl和野生型9522成熟胚愈傷，以觀察是否會使突變體恢復到野生型表型。Ttl代獲得互補植株，圖4顯示Ttl代互補植株可以產生花粉，并被I2/KI染色，即表現(xiàn)出的野生型表型。
綜上所述，本發(fā)明通過控制水稻HLH結構域的轉錄因子EATl基因及其編碼蛋白獲 得水稻雄性生殖發(fā)育異常的變異株，實現(xiàn)控制水稻雄性生殖發(fā)育和育性；本發(fā)明獲得的水稻突變體在營養(yǎng)生長時期與來源親本無明顯差異，進入生殖生長階段后，雄性生殖器官發(fā)育異常、花粉敗育引起植株不育，在農業(yè)生產上具有十分重要的應用。
權利要求
1.一種水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征在于，包括如下步驟選擇常規(guī)水稻品種，處理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述處理為， (a)采用常規(guī)基因工程方法，敲除或者改變編碼如SEQ ID NO. 3所示氨基酸的核苷酸序列，使所示氨基酸序列發(fā)生缺失或者變異，進而使得所述氨基酸序列對應多肽的活性喪失; 或者(b)采用常規(guī)基因工程方法，抑制或者降低編碼如SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列的核苷酸序列的表達，降低所述氨基酸序列對應多肽的表達水平。
2.如權利要求I所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征是，所述水稻品種為粳稻品種9522、秈稻品種廣陸矮4號、龍?zhí)馗蚨i稻品種9311。
3.如權利要求I所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征是，所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
4.如權利要求I所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征是，所述水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法包括如下步驟采用常規(guī)基因工程方法，使常規(guī)水稻品種中如SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列突變?yōu)镾EQ ID NO. 4，進而獲得所述水稻雄性不育株系，即eatl突變體。
5.如權利要求I所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征是，所述水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法包括如下步驟采用常規(guī)基因工程方法，使常規(guī)水稻品種中如SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列突變?yōu)镾EQ ID NO. 5，進而獲得所述水稻雄性不育株系，即eatl突變體。
6.如權利要求I所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征是，所述水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法包括如下步驟構建所述基因的RNA干擾植物表達載體，轉化水稻植株，進而獲得所述水稻雄性不育株系。
7.—種如權利要求I所述方法獲得的水稻不育株系在水稻制種中的用途，其特征是，所述用途為 (a)以所述水稻雄性不育株系作為常規(guī)育種的母本材料，進行育種； 或者(b)以所述水稻雄性不育株系作為母本，進行雜交育種。
8.一種恢復如權利要求I所述方法獲得的水稻雄性不育株系的雄性不育性狀的方法，將含EATl互補構建的根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105轉入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中EATl互補構建含有編碼如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；具體包括如下步驟 (a)提供攜帶表達EATl互補構建載體的根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105 ； (b)將水稻細胞或組織或器官與步驟(a)中的農桿菌接觸，從而使編碼如SEQID NO. 3所示氨基酸的核苷酸轉入水稻細胞，并且整合到水稻細胞的染色體上； (c)選擇轉入所述核苷酸的水稻細胞或組織，再生，獲得水稻植株。
9.如權利要求8所述的方法，其特征是，所述編碼如SEQID NO. 3所示氨基酸的核苷酸如 SEQ ID NO. 2 所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物工程技術領域中的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法及其用途；所述創(chuàng)制的方法(a)采用常規(guī)基因工程方法，敲除或者改變編碼如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸序列，使所示氨基酸序列發(fā)生缺失或變異，進而使得所述氨基酸序列對應多肽的活性水平下降或喪失；或者(b)采用常規(guī)基因工程方法，抑制或者降低編碼如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列的表達，降低所述氨基酸序列對應多肽的表達水平。本發(fā)明獲得的水稻突變體營養(yǎng)生長階段沒有任何異常,但純合體植株完全不育。如果應用于雜交育種中，可以免除母本去雄的工作，大大提高生產效率，降低人工成本，在農業(yè)生產上具有重要的應用。
文檔編號A01H5/00GK102732556SQ20121022365
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月29日 優(yōu)先權日2012年6月29日
發(fā)明者張大兵, 梁婉琪, 牛寧寧, 羅治靖, 袁政, 陳明姣 申請人:上海交通大學