專利名稱：一種建立植物雄性不育系的方法及其專用表達(dá)盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種建立植物雄性不育系的方法及其專 用表達(dá)盒。
背景技術(shù)：
雜交育種和雜種優(yōu)勢(shì)的利用是農(nóng)業(yè)增產(chǎn)的關(guān)鍵。而雄性不育系是雜交育種和雜種 制作的關(guān)鍵材料。傳統(tǒng)的雄性不育系要從大田中或野生的種質(zhì)資源中隨機(jī)篩選得到。至今 還有很多重要農(nóng)業(yè)和蔬菜作物因缺乏良好的雄性不育系而不能充分利用雜交優(yōu)勢(shì)。此外要 把自然選育得到的雄性不育系用于育種還有多種障隘需要大量的工作。首先，把一個(gè)雄性 不育系轉(zhuǎn)到其他優(yōu)良品系的母本時(shí)需通過(guò)多代的回交，這樣不僅育種周期長(zhǎng)而且經(jīng)常會(huì)遇 到優(yōu)良品系某些品質(zhì)丟失等問(wèn)題。更關(guān)鍵的問(wèn)題是與不育系相匹配的恢復(fù)系不易獲得，不 能得到可育的雜種。一個(gè)創(chuàng)造雄性不育和恢復(fù)系的方法在雜交育種和雜種生產(chǎn)上有巨大的 應(yīng)用價(jià)值。利用分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因手段來(lái)構(gòu)建雄性不育系及其配套的恢復(fù)系，可以在任 何植物中建立不育系和恢復(fù)系，為雜交育種和雜交種制備提供父母本材料。油菜素內(nèi)酯 (brassinosteroids,BRs)作為一種新型的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素，在花的發(fā)育過(guò)程中起著重要 的作用。在擬南芥和水稻中，油菜素的缺失都造成雄性不育或不同程度的育性下降。但這 些油菜素突變體都是全身性激素缺失，同時(shí)伴隨著很多生長(zhǎng)發(fā)育缺陷，比如極度矮化，從而 不能直接用于雜交育種。此外這些突變體的雄性不育是因?yàn)樾廴镏杏筒怂毓δ軉适г斐傻?還是整體植物生長(zhǎng)缺陷間接造成的一直不清楚。是否可以通過(guò)局部地在花藥或雄蕊中特異 關(guān)閉油菜素響應(yīng)來(lái)得到雄性不育而又不影響植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和授粉后的結(jié)實(shí)一直還沒(méi)有 報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種培育植物雄性不育系的方法。本發(fā)明提供的培育植物雄性不育系的方法是通過(guò)降低雄蕊或雄蕊器官原基中的 油菜素內(nèi)酯的作用，從而得到植物雄性不育系。上述降低雄蕊或雄蕊器官原基中的油菜素內(nèi)酯作用是通過(guò)抑制油菜素內(nèi)酯合成、 加速降解油菜素內(nèi)酯或阻斷油菜素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。具體地講，上述阻斷油菜素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是將一表達(dá)盒導(dǎo)入目的植物中的實(shí)現(xiàn)的；所 述表達(dá)盒，從上游至下游依次包括花藥或雄蕊器官原基特異啟動(dòng)子、油菜素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào) 控因子的編碼序列和終止子。進(jìn)一步，上述油菜素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子的編碼序列是序列表中序列1。上述花藥特異啟動(dòng)子可以是核苷酸序列如序列表中序列2所示的AP3啟動(dòng)子。上述表達(dá)盒是通過(guò)含有所述表達(dá)盒的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中的。進(jìn)一步，上述重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括如下步驟利用TOPO重組將序列表中
3序列1所示基因連到pENTRY-SD/D/TOPO載體，得到載體pT0P0-bin2，然后用MluI酶切所述 載體pT0P0-bin2回收2. 4kb的DNA片段，再將所述2. 4kb的DNA片段與中間載體進(jìn)行LR Gateway重組反應(yīng)，得到所述重組表達(dá)載體；所述中間載體是將所述AP3啟動(dòng)子插入pGWB20 載體的HidIII和XbaII酶切位點(diǎn)間得到的載體。上述目的植物是雙子葉植物或單子葉植物，優(yōu)選十字花科植物，更優(yōu)選是擬南芥。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于培育植物雄性不育系的表達(dá)盒。本發(fā)明提供的表達(dá)盒，從上游至下游依次包括花藥或雄蕊器官原基特異啟動(dòng)子、 油菜素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子的編碼序列和終止子。上述油菜素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子的編碼序列是序列表中序列1 ；所述花藥特異啟 動(dòng)子是核苷酸序列如序列表中序列2所示的AP3啟動(dòng)子。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明構(gòu)建的AP3_bin2的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系中的完全不育的占20. 7%, 并且與另一發(fā)明構(gòu)建的AP3-bzrl-lD的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行雜交后，完全不育的AP3-bin2的轉(zhuǎn) 基因株系結(jié)實(shí)，雜交Fl代植物的育性恢復(fù)正常，顯示AP3-bzrl-lD可恢復(fù)AP3-bin2-l的育性。BIN2是BR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中一個(gè)關(guān)鍵的激酶，它的顯性純合突變體bin2表現(xiàn)為極度 矮化并100%雄性不育；而BZRl是一個(gè)BIN2的激酶底物，其活性被BIN2抑制，它的顯性突 變體bzrl-lD可完全恢復(fù)bin2的矮化的表型。因此本發(fā)明利用BIN2和BZRl在優(yōu)良品系 中直接構(gòu)建顯性雄性不育系，保持系和恢復(fù)系，這樣作成的三系可直接在雜交育種和雜種 制作中應(yīng)用，節(jié)約育種成本并使雜交種子規(guī)?；a(chǎn)成為可能。如果用只在花藥中特異表 達(dá)的啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)bin2-l和BZRl的表達(dá)，可達(dá)到雄性不育系和恢復(fù)系而不影響其它性狀 特征。本發(fā)明建立一套通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段制造抑制雄蕊中油菜素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)得到雄性不育 植物的方法。這一方法得到的雄性不育可以通過(guò)啟動(dòng)油菜素下游信號(hào)因子BZRl恢復(fù)育性。 因此通過(guò)本發(fā)明得到的雄性不育系可以被恢復(fù)育性，從而可以廣泛用于多種作物的雜種制備。


圖1為AP3啟動(dòng)突變的bin2在花藥中特異表達(dá)引起不育，A是AP3-bin2轉(zhuǎn)基因 的整體形態(tài)圖，圖中植物在16h光照、8h黑暗的溫室中生長(zhǎng)5周；B是AP3-bin2轉(zhuǎn)基因植 物的花序組織表型；C和D是AP3-bin2轉(zhuǎn)基因植物的花序在顯微鏡下的表型；圖中所有植 物從左往右依次是野生型WT、AP3-bin2育性降低轉(zhuǎn)基因系1#、完全不育系7#，bin2+/_是 bin2-l顯性突變體，具有育性降低的表型。圖2 :AP3-bin2雌性可育，Α.不育的AP3_bin2植物不能自花授粉結(jié)實(shí) (BeforeCross)，但被野生型花粉授粉后(After Cross)果夾長(zhǎng)大并結(jié)實(shí)；B.由圖2A所示 植物得到和后代分離可育和不育植株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
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實(shí)施例1、建立雄性不育系和恢復(fù)系一、建立雄性不育系1、重組表達(dá)載體AP3_bin2的構(gòu)建1)中間載體(AP3-GWB20)的構(gòu)建合成下述的引物對(duì)AP3PF-H GCGAAGCTTGAGTGCGTGTTGTTTGTGTAG(下劃線標(biāo)出為 HindIII 酶切位
占). /、、、 / AP3PR-X GCGTCTAGAGTTGAAGAGATTTGGTGGAGAG (下劃線標(biāo)出為 XbaI 酶切位點(diǎn))。用AP3PF-H和AP3PR-X從野生型Co 1擬南芥(購(gòu)自美國(guó)擬南芥生物資源中心 (Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC))的基因組中擴(kuò)出 1. 2K 的 AP3 啟動(dòng) 子(ΑΡ3啟動(dòng)子是一個(gè)在花藥特異啟動(dòng)子)，將擴(kuò)增得到的ΑΡ3啟動(dòng)子與經(jīng)HidIII和XbaII 酶切過(guò)的PGWB20載體(記載過(guò)該材料的文獻(xiàn)是Nakagawa et al.，J BiosciBioeng. 2007 Jul ；104(1) :34-41，公眾可從王志勇處獲得)連接，得到中間載體AP3-GWB20。測(cè)序表明 中間載體是將序列表中序列2所示的DNA片段(AP3啟動(dòng)子)插入pGWB20載體的HidIII 和XbaII酶切位點(diǎn)間的。2)AP3_bin2 的構(gòu)建合成下述的引物對(duì)BIN2GWF CACCATGGCTGATGATAAGGAGATGBIN2GWR :AGTTCCAGATTGATTCAAGAAGCTTAGACCC提取純合bin2突變體(記載過(guò)該材料的文獻(xiàn)是He，J-X et al.，Proc Nat. Acad. Sci. 99，10185-10990 ；公眾可從王志勇處獲得)的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用BIN2GWF和 BIN2GW引物從bin2突變體的cDNA中擴(kuò)出bin2基因，測(cè)序表明bin2基因的編碼序列如序 列表中序列1所示。利用TOPO 重組將 bin2 基因連到 pENTRY-SD/D/TOPO 載體(Invitrogen 公司)，得 到載體命名為pT0P0-bin2，將pT0P0-bin2用MluI進(jìn)行酶切，跑膠回收大約2. 4kb的DNA 片段，然后將該2. 4kb的DNA片段與上述的中間載體AP3-GWB20進(jìn)行LR Gateway重組反 應(yīng)(Invitrogen公司)，將bin2插入到AP3下游的，得到AP3_bin2。經(jīng)測(cè)序重組表達(dá)載體 AP3-bin2構(gòu)建正確。其中重組表達(dá)載體AP3-bin2中含有核苷酸序列如序列表中序列3所 示的表達(dá)盒，序列表中序列3的第1-1184位與序列2 —致，為AP3啟動(dòng)子；序列表中序列3 的第1221-2360位與序列1 一致，為bin2基因；序列表中序列3的第2414-2804為myc標(biāo) 簽，2821-3073Nos終止子序列。由此我們得到載有AP3_bin2表達(dá)盒的pGWB20載體，這樣的 載體可將AP3bin2表達(dá)盒通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入植物。2、雄性不育系的獲得利用花序浸泡法，將步驟1獲得的重組表達(dá)載體AP3_bin2轉(zhuǎn)到擬南芥野生型 Col (公眾可網(wǎng)上購(gòu)自www. arabidopsis. org)中，得到AP3_bin2的轉(zhuǎn)基因植株。其中，花序 浸泡法的步驟如下1)在LB平板上挑取AP3_bin2的農(nóng)桿菌單克隆，接種于5ml含卡那霉素的YEB液 體培養(yǎng)基中，280C，200rpm,振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期；2)按1 100的比例轉(zhuǎn)接到500ml LB培養(yǎng)基中，28°C，200rpm，振蕩培養(yǎng)至0D_為0. 6左右；3) 5，OOOrpm，離心15分鐘，收集菌體，重懸于滲透緩沖液(5%蔗糖，0.02% silwetL-77)，調(diào) OD600 至 0. 6 左右；4)取正在開花的擬南芥，剪去轉(zhuǎn)化前形成的果莢，然后將整個(gè)花序浸泡在上述準(zhǔn) 備的菌懸液中15秒，使得農(nóng)桿菌很好的粘附在花序中進(jìn)行轉(zhuǎn)化；5)農(nóng)桿菌侵染后的擬南芥放于陰暗處保濕培養(yǎng)24小時(shí)，然后將擬南芥移到培養(yǎng) 室中繼續(xù)正常培養(yǎng)，7-10天后再浸泡轉(zhuǎn)化一次。收獲成熟的擬南芥種子，充分晾干后用10%次氯酸鈉消毒后，鋪在含有潮酶素的 1/2MS培養(yǎng)基上，篩選得到的抗性苗(Tl代)移入土中繼續(xù)培養(yǎng)。將AP3-bin2的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子檢測(cè)，所用引物為BIN2GWF和GWB20R(GWB20R 序列為TTGTTCACCGTTAATTAACCCG)，共得到58個(gè)陽(yáng)性株系。3、陽(yáng)性株系的表型分析將58個(gè)AP3_bin2轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系、野生型Col擬南芥、純合bin2突變體和雜 合bin2突變體(記載該雜合突變體的文獻(xiàn)是He，J-X et al.，Proc Nat. Acad. Sci. 99， 10185-10990 ；公眾可從王志勇處獲得)在16h光照、8h暗，22度溫室中培養(yǎng)，觀察整個(gè)生長(zhǎng) 發(fā)育期的表型。AP3-bin2的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段與野生型類似，無(wú)任何顯著性差異， (如圖IA所示)。在抽薹開花后，AP3-bin2的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系的花藥出現(xiàn)不同程度的敗育 (圖1B)，具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示，AP3-bin2的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系按照植物形成正常果夾的 比率可以分為3類育性正常90%果夾飽滿的無(wú)發(fā)育異常的轉(zhuǎn)基因植物(30棵約51. 8% )；育性降低果夾生成率在30% -50%的弱表型轉(zhuǎn)基因植物，其結(jié)實(shí)率明顯低于野 生型對(duì)照，果夾不飽滿或部分果夾空癟(16棵約27. 5% )；完全不育不產(chǎn)生任何種子的強(qiáng)表型轉(zhuǎn)基因植物(12棵20. 7% )。雄蕊分析顯示育性正常的轉(zhuǎn)基因株系具有和野生型一樣的長(zhǎng)雄蕊可達(dá)到柱頭從 而可順利完成授粉；在弱表型育性降低轉(zhuǎn)基因植株中，花絲變短，雄蕊不能有效的接觸柱頭 導(dǎo)致育性降低；在強(qiáng)表型完全不育轉(zhuǎn)基因植株中，雄蕊發(fā)育異常，不能形成花藥，只有絲狀 物產(chǎn)生，從而導(dǎo)致不育(如圖IC和ID所示)。表1. AP3-bin2的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系的育性分析 4、AP3_bin2不育系的保持選取5個(gè)完全不育的AP3_bin2轉(zhuǎn)基因植物與野生型Col雜交。其中雜交的步驟 如下1)選取生長(zhǎng)健壯的完全不育的AP3_bin2轉(zhuǎn)基因植物(AP3_bin2不育系)的花序， 用鑷子將多余的花蕾去除，保留最佳時(shí)期的花蕾5-6個(gè)，然后用鑷子輕輕摘掉一片花萼和花瓣，要小心不要碰傷柱頭；2)從野生型Col上選取正在開放的花朵，用鑷子摘取花藥然后涂抹在AP3_bin2的 柱頭上；3)進(jìn)行標(biāo)記。雜交結(jié)果顯示野生型的花粉與AP3_bin2不育系雜交可形成正常的果夾(圖2A)， 表明AP3-bin2轉(zhuǎn)基因只影響了雄蕊的發(fā)育，而雌蕊發(fā)育正?？烧＝Y(jié)實(shí)。對(duì)Fl的雜交后 代分析顯示，這些不育系還會(huì)分離出育性正常的植株和不育的植株(圖2B)，PCR分析顯示 育性正常的植株為野生型，而不育的植株為AP3-bin2轉(zhuǎn)基因植物，說(shuō)明由AP3-bin2轉(zhuǎn)基因 造成的不育可以遺傳。其中有三個(gè)不育系的雜交后代可育與不育的分離比值為1 1，說(shuō)明 這些不育系只有一個(gè)T-DNA插入。而另外兩個(gè)不育系的雜交后代可育與不育的分離比值為 1 3，說(shuō)明這兩個(gè)不育系有兩個(gè)T-DNA插入。我們對(duì)只有一個(gè)T-DNA插入的不育系，再次 用野生型的花粉進(jìn)行雜交。F2依然保留著50%的不育植株，說(shuō)明野生型是AP3-bin2轉(zhuǎn)基 因不育系的保持系，我們可用野生型來(lái)保留轉(zhuǎn)基因植物不育的表型。
權(quán)利要求
一種培育植物雄性不育系的方法，是通過(guò)降低雄蕊或雄蕊器官原基中的油菜素含量，從而得到植物雄性不育系。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述降低雄蕊或雄蕊器官原基中的油菜素 含量是通過(guò)抑制合成油菜素、加速降解油菜素或阻斷油菜素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述阻斷油菜素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是將一表達(dá)盒導(dǎo) 入目的植物中的實(shí)現(xiàn)的；所述表達(dá)盒，從上游至下游依次包括花藥或雄蕊器官原基特異啟 動(dòng)子、油菜素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子的編碼序列和終止子。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述油菜素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子的編碼序 列是序列表中序列1。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述花藥特異啟動(dòng)子是核苷酸序列如 序列表中序列2所示的AP3啟動(dòng)子。
6.如權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述表達(dá)盒是通過(guò)含有所述表達(dá) 盒的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中的。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括如下 步驟利用TOPO重組將序列表中序列1所示基因連到pENTRY-SD/D/TOPO載體，得到載體 pT0P0-bin2，然后用MluI酶切所述載體pT0P0-bin2回收2. 4kb的DNA片段，再將所述2. 4kb 的DNA片段與中間載體進(jìn)行LR Gateway重組反應(yīng)，得到所述重組表達(dá)載體；所述中間載體 是將所述AP3啟動(dòng)子插入pGWB20載體的HidIII和XbaII酶切位點(diǎn)間得到的載體。
8.如權(quán)利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物是雙子葉植物或單 子葉植物，優(yōu)選十字花科植物。
9.用于培育植物雄性不育系的表達(dá)盒，從上游至下游依次包括花藥或雄蕊器官原基特 異啟動(dòng)子、油菜素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子的編碼序列和終止子。
10.如權(quán)利要求9所述的表達(dá)盒，其特征在于所述油菜素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子的編碼 序列是序列表中序列1 ；所述花藥特異啟動(dòng)子是核苷酸序列如序列表中序列2所示的AP3 啟動(dòng)子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育植物雄性不育系的方法及其專用表達(dá)盒。本發(fā)明提供的培育植物雄性不育系的方法是通過(guò)降低雄蕊或雄蕊器官原基中的油菜素含量，從而得到植物雄性不育系。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明構(gòu)建的AP3-bin2的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系中的完全不育的占20.7％，并且與另一發(fā)明構(gòu)建的AP3-bzr1-1D的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行雜交后，完全不育的AP3-bin2的轉(zhuǎn)基因株系結(jié)實(shí)，雜交F1代植物的育性恢復(fù)正常，顯示AP3-bzr1-1D可恢復(fù)AP3-bin2-1的育性。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101921794SQ20101022608
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月6日
發(fā)明者王志勇 申請(qǐng)人:王志勇