專利名稱：一種可有效抑制褐變產(chǎn)生的蕎麥愈傷組織的增殖培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蕎麥愈傷組織的增殖培養(yǎng)方法，特別是涉及一種有效抑制褐變產(chǎn)生的蕎麥愈傷組織的增殖培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
養(yǎng)麥(Fagopyrumesculentum)是寥科(Polygonaceae)養(yǎng)麥屬(FagopyrumMill.)的雙子葉作物，是一種重要的藥食同源作物。蕎麥中蘆丁含量較高，蘆丁作為黃酮的主要成分，不僅可以作為抗氧化劑和功能性食品的原料，而且具有降低毛細(xì)血管脆性，改善微循環(huán)的作用，在臨床上主要用于糖尿病、高血壓等的輔助治療。目前國內(nèi)提取蘆丁的原料主要為槐花；但由于槐花產(chǎn)量少，資源稀少，不能充分滿足市場需求。因此通過組織培養(yǎng)生產(chǎn)蘆丁含量高的蕎麥愈傷組織是獲得蘆丁的有效途徑。
目前我國的金紅、郝建平、侯建華、劉擁海和王愛國等人分別采用蕎麥植物的不同部位器官均成功地誘導(dǎo)出了愈傷組織；并且于寒松等人還對蕎麥植物器官中總黃酮含量最高的葉柄以及由葉柄誘導(dǎo)形成的愈傷組織中的總黃酮含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蕎麥植物葉柄中的總黃酮含量為18. 97mg/g，而蕎麥葉柄誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織中的總黃酮含量為58. 80mg/g ;可見由葉柄經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織中總黃酮含量增加了 2. I倍。由于蕎麥愈傷組織中含有大量的黃酮類化合物，在愈傷組織培養(yǎng)過程中極易產(chǎn)生氧化；因而在蕎麥愈傷組織增殖培養(yǎng)過程中，常出現(xiàn)培養(yǎng)材料的嚴(yán)重褐變，從而使得蕎麥愈傷組織在大量增殖過程中由于產(chǎn)生嚴(yán)重褐變而造成培養(yǎng)材料的死亡。目前還未見有關(guān)解決方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能有效抑制褐變產(chǎn)生的蕎麥愈傷組織的增殖培養(yǎng)方法，為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的解決方案包括如下步驟(I)蕎麥愈傷組織的獲得選取春季播種、生長健康的蕎麥的葉柄，將其消毒后切成I 2cm的長度，然后接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA O. I 2. Omg/L+2，4-D I 6mg/L+IAA O lmg/L中，在20 27°C、每天光照8 16小時(shí)、光照強(qiáng)度為1500 2500 Ix的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基的PH值為6. O、蔗糖30g/L、瓊脂6. 8 g/L ；(2)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)選取無褐變的蕎麥愈傷組織，放入培養(yǎng)箱中在溫度6 12°C、無光照的條件下預(yù)培養(yǎng)7 14天，所述預(yù)培養(yǎng)是在原培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，不需轉(zhuǎn)接；(3)愈傷組織的增殖培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)后的愈傷組織切割后，迅速把切口端插入增殖培養(yǎng)基中，先在溫度4 8 °C、無光照的條件下培養(yǎng)3 5天，再在22 28°C、每天光照6
12h、光照強(qiáng)度為1200 2000 Ix的條件下進(jìn)行快速增殖培養(yǎng)，所述增殖培養(yǎng)基采用改良的MS為基本培養(yǎng)基，并添加6-BA O. 5 2. Omg/L、IAA O. 5 4mg/L、檸檬酸6. O 12 mg/L和L-半胱氨酸50 150mg/L,培養(yǎng)基的pH值為6. O、蔗糖30g/L、瓊脂6. 8 g/L。
上述步驟(I)中所述消毒是指用濃度為O. 1%的升汞消毒2 6分鐘，再用無菌水清洗3 4次。上述步驟(2)中所述無褐變蕎麥愈傷組織是誘導(dǎo)培養(yǎng)18-30天的無褐變愈傷組織。上述步驟(3)中所采用的改良MS基本培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基。本發(fā)明通過在愈傷組織增殖培養(yǎng)前對其進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)、以及在增殖培養(yǎng)基中加入檸檬酸和L-半胱氨酸，有效降低了蕎麥愈傷組織在增殖培養(yǎng)中的褐變率，提高了愈傷組織的增殖倍數(shù)，實(shí)現(xiàn)了利用生物工程技術(shù)大規(guī)模生 產(chǎn)黃酮類物質(zhì)含量高的蕎麥愈傷組織。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例I(I)蕎麥愈傷組織的獲得選取春季播種、生長健康的蕎麥葉柄，先用濃度為O. 1%的升汞消毒4分鐘，再用無菌水清洗3次，然后切成I. 5cm的長度，接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA O. 5mg/L+2,4-D 4mg/L+IAA O. lmg/L 中，在 25°C、每天光照 10 小時(shí)、光照強(qiáng)度為2000 Ix的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基的pH值為6. O、蔗糖30g/L、瓊脂6. 8 g/L ；(2)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)選取誘導(dǎo)培養(yǎng)20天、無褐變和生長速度快的蕎麥愈傷組織，放入培養(yǎng)箱中在溫度8°C、無光照的條件下預(yù)培養(yǎng)10天；(3)愈傷組織的增殖培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)后的愈傷組織沿橫向切割(以減少愈傷組織的傷口面積)，然后迅速把切口端插入增殖培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 2 mg/L +檸檬酸10 mg/L+ L-半胱氨酸100 mg/L中，先在溫度6°C、無光照的條件下培養(yǎng)4天,再在24°C、每天光照8 h、光照強(qiáng)度為15001x的條件下進(jìn)行快速增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)基的pH值為6. O、蔗糖30g/L、瓊脂6. 8 g/L，培養(yǎng)30天后愈傷組織增殖了 2. 15倍，褐變率僅為21. 5%。實(shí)施例2(I)蕎麥愈傷組織的獲得選取春季播種、生長健康的蕎麥葉柄，先用濃度為O. 1%的升汞消毒5分鐘，再用無菌水清洗4次，然后切成I. 5cm的長度，接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA I. 5mg/L+2,4-D 2mg/L+IAA O. 5mg/L 中，在 25°C、每天光照 14 小時(shí)、光照強(qiáng)度為2000 Ix的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基的pH值為6. O、蔗糖30g/L、瓊脂6. 8 g/L ；(2)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)選取誘導(dǎo)培養(yǎng)25天、無褐變和生長速度快的蕎麥愈傷組織，放入培養(yǎng)箱中在溫度12°C、無光照的條件下預(yù)培養(yǎng)8天；(3)愈傷組織的增殖培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)后的愈傷組織切割后，迅速把切口端插入增殖培養(yǎng)基 1/2 MS+6-BA I. 5 mg/L+IAA I mg/L + 梓檬酸 7 mg/L+ L-半胱氨酸 140 mg/L 中，先在溫度8°C、無光照的條件下培養(yǎng)3天，再在22°C、每天光照10 h、光照強(qiáng)度為15001x的條件下進(jìn)行快速增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)基的PH值為6. O、蔗糖30g/L、瓊脂6. 8 g/L,培養(yǎng)30天后愈傷組織增殖了 I. 75倍，褐變率為35. 5%。實(shí)施例3(I)蕎麥愈傷組織的獲得選取春季播種、生長健康的蕎麥葉柄，先用濃度為O. 1%的升汞消毒4分鐘，再用無菌水清洗4次，然后切成2cm的長度，接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA I. Omg/L+2,4-D 5mg/L中，在25°C、每天光照12小時(shí)、光照強(qiáng)度為2000 Ix的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基的PH值為6. O、蔗糖30g/L、瓊脂6. 8 g/L ；(2)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)選取誘導(dǎo)培養(yǎng)20天、無褐變的蕎麥愈傷組織，放入培養(yǎng)箱中在溫度6°C、無光照的條件下預(yù)培養(yǎng)12天；(3)愈傷組織的增殖培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)后的愈傷組織切割后，迅速把切口端插入增殖培養(yǎng)基 1/2 MS+6-BA O. 6mg/L+IAA 3mg/L + 梓檬酸 12 mg/L+ L-半胱氨酸 60 mg/L 中，先在溫度6°C、無光照的條件下培養(yǎng)5天，再在27°C、每天光照7 h、光照強(qiáng)度為1800 Ix的條件下進(jìn)行快速增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)基的pH值為6. O、蔗糖30g/L、瓊脂6. 8 g/L，培養(yǎng)30天后愈傷組織增殖了 I. 6倍，褐變率為45. 2%。比較實(shí)施例I將實(shí)施例I步驟(I)中的蕎麥葉柄改為秋季播種的蕎麥的葉柄，其它步驟同實(shí)施例1，經(jīng)30天增殖培養(yǎng)后，愈傷組織增殖了 O. 79倍，褐變率為87. 5%。說明蕎麥葉柄選擇很 重要。比較實(shí)施例2將實(shí)施例I步驟(3)中的增殖培養(yǎng)基中的基本培養(yǎng)基由1/2 MS改為MS，其它步驟同實(shí)施例I ;培養(yǎng)30天后愈傷組織增殖了 I. 25倍，褐變率為43. 8%。說明基本培養(yǎng)基采用1/2 MS，其效果明顯優(yōu)于MS。比較實(shí)施例3將實(shí)施例I中的步驟(2)取消，其它步驟同實(shí)施例1，培養(yǎng)30天后愈傷組織增殖了
I.45倍，褐變率為83. 6%，說明愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)對抑制褐變產(chǎn)生有明顯效果。
權(quán)利要求
1.一種可有效抑制褐變產(chǎn)生的蕎麥愈傷組織的增殖培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟 (1)蕎麥愈傷組織的獲得選取春季播種、生長健康的蕎麥的葉柄，將其消毒后切成I 2cm的長度，然后接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA O. I 2. 0mg/L+2，4_D I 6mg/L+IAA O lmg/L中，在20 27°C、每天光照8 16小時(shí)、光照強(qiáng)度為1500 2500 Ix的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基的PH值為6. O、蔗糖30g/L、瓊脂6. 8 g/L ； (2)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)選取無褐變的蕎麥愈傷組織，放入培養(yǎng)箱中在溫度6 12°C、無光照的條件下預(yù)培養(yǎng)7 14天； (3)愈傷組織的增殖培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)后的愈傷組織切割后，迅速把切口端插入增殖培養(yǎng)基中，先在溫度4 8°C、無光照的條件下培養(yǎng)3 5天，再在22 28°C、每天光照6 12h、光照強(qiáng)度為1200 2000 Ix的條件下進(jìn)行快速增殖培養(yǎng)，所述增殖培養(yǎng)基采用改良的MS為基本培養(yǎng)基,并添加6-BA O. 5 2. Omg/L、IAA O. 5 4mg/L、梓樣酸6. O 12 mg/L和L-半胱氨酸50 150mg/L,培養(yǎng)基的pH值為6. O、蔗糖30g/L、瓊脂6. 8 g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種可有效抑制褐變產(chǎn)生的蕎麥愈傷組織的增殖培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(I)中所述消毒是指用濃度為O. 1%的升汞消毒2 6分鐘，再用無菌水清洗3 4次。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種可有效抑制褐變產(chǎn)生的蕎麥愈傷組織的增殖培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)中所述無褐變蕎麥愈傷組織是誘導(dǎo)培養(yǎng)18-30天的無褐變愈傷組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種可有效抑制褐變產(chǎn)生的蕎麥愈傷組織的增殖培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(3)中所采用的改良MS基本培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可有效抑制褐變產(chǎn)生的蕎麥愈傷組織的增殖培養(yǎng)方法，該方法通過在蕎麥愈傷組織增殖培養(yǎng)前對其進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)、以及在增殖培養(yǎng)基中加入檸檬酸和L-半胱氨酸，有效抑制了蕎麥愈傷組織在增殖培養(yǎng)中的褐變率，提高了愈傷組織的增殖倍數(shù)，為大量、快速生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)(蘆丁)提供了一種新途徑。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102823490SQ20121027715
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月6日
發(fā)明者王躍華, 趙鋼, 孫雁霞, 宋超, 陳麗, 段有麗, 鄔曉勇, 鄒亮, 彭鐮心 申請人:成都大學(xué)