專利名稱：短小芽孢桿菌LD-b1的發(fā)酵工藝及其在防治植物病害中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株防治植物病害的生防菌株，包括其發(fā)酵生產(chǎn)工藝及其在植物病害生物防治中的應(yīng)用，屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自1898年Vogl從黑麥草種子中分離出第一株內(nèi)生菌至今，內(nèi)生菌的研究已經(jīng)有100多年的歷史。近年來的研究表明，幾乎所有植物都存在內(nèi)生菌，它們生長在植物表皮下的組織中，主要包括細菌、真菌和放線菌等。據(jù)Dreyfuss和Chapela估計,至少有數(shù)十萬種內(nèi)生菌存活于維管植物細胞內(nèi)或細胞間隙的特殊環(huán)境中。我國的植物資源極其豐富，但由于近年來開荒、放牧、造林、采挖等諸多原因，很多野生植物資源遭受嚴重破壞。云霧龍膽是 龍膽科龍膽屬多年生宿根草木植物，主治胃炎、氣管炎、尿道炎、天花及痘疹，是龍膽屬植物中少數(shù)未被系統(tǒng)研究過的珍貴藥材，被國家列為重點保護品種。對云霧龍膽內(nèi)生菌的分離和研發(fā)有利于保護瀕危植物內(nèi)生菌，并開發(fā)植物病害生物防治新的菌種資源。植物病害是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素之一，目前的防治以使用化學農(nóng)藥為主，容易誘導病菌產(chǎn)生抗藥性；而且化學殺菌劑污染環(huán)境，破壞農(nóng)田中微生物菌群的生態(tài)平衡，殘留的農(nóng)藥不僅影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，而且危害人類健康。植物病害的生物防治方法安全有效，越來越引起人們的關(guān)注。但從土壤和植物根際分離篩選到的植物病害生防菌在植物體內(nèi)定植困難，在與病害菌的競爭中難以占據(jù)優(yōu)勢。植物內(nèi)生細菌占據(jù)有利生態(tài)位、不易受環(huán)境條件影響、容易定植于植物體中，能抗病原菌入侵，在植物病害生物防治中具有顯著的優(yōu)勢。芽孢桿菌是常見的內(nèi)生細菌種類，可以產(chǎn)生桿菌肽、環(huán)脂、氨基酸類、核酸類、類噬菌體顆粒等多種抗菌物質(zhì)，能抑制多種植物病原菌；而且芽孢桿菌具有生長快、營養(yǎng)簡單、抗逆性強等優(yōu)點，非常適合開發(fā)成生防菌劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供具有防治植物病害作用的一株短小芽孢桿菌菌株，發(fā)酵制備出高效的生防菌劑，能更好地防治農(nóng)田植物病害，減少化學農(nóng)藥對環(huán)境的污染。本發(fā)明是從云霧龍膽的莖中分離篩選到一株具有廣譜抗植物病害真菌活性的細菌，經(jīng)鑒定為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，菌株代號為LD-bl。其生物學特征為革蘭氏陽性，菌體細胞大小O. 5μπι O. 6μπιΧ1. 5μπι 2. Ιμπι ;接觸酶、檸檬酸鹽利用、酪蛋白水解、七葉苷水解、V. P為陽性；氧化酶、脲酶、H2S產(chǎn)生、吲哚產(chǎn)生、硝酸鹽還原、明膠液化、精氨酸雙水解酶、淀粉水解、Μ. R.為陰性；能夠利用的碳源有葡萄糖、蔗糖、乳糖、樹膠醛糖、木糖、半乳糖、甘露醇、N-乙酰-葡糖胺、葡糖酸鹽；不能利用淀粉、糊精、蜜二糖、鼠李糖和山梨醇。菌株LD-bl現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年5月14日，保藏號為CGMCC No. 6112。本發(fā)明所述生防菌株LD-bl的發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程為斜面菌種一搖瓶菌種一種子罐一生產(chǎn)罐一產(chǎn)品。本發(fā)明中生防菌株LD-bl發(fā)酵生產(chǎn)的詳細步驟為將保藏菌種劃線接種于固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方(g/L)為蔗糖10，蛋白胨2，牛肉膏3，酵母膏O. 5，瓊脂15，pH7. 5 ;30°C培養(yǎng)36 48h，形成菌苔。用5mL無菌水將活化菌種從試管斜面上洗下，接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方(g/L)為蔗糖15，蛋白胨5，酵母粉O. 2，磷酸氫二鉀O. 5，硫酸鎂O. 05，氯化鈉O. 1，pH7. 5 ；250mL三角瓶裝IOOmL的液體種子培養(yǎng)基，接種后的三角瓶置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，150r/min、30°C培養(yǎng)24 30h制成搖瓶種子液。種子罐的培養(yǎng)基與搖瓶種子的培養(yǎng)基相同，發(fā)酵條件為裝 液量70%，接種量5%，發(fā)酵溫度30°C，通氣量I : 1，罐壓O. 2kg/cm2，攪拌轉(zhuǎn)速200 600r/min，溶氧10%以上，發(fā)酵時間24小時,菌量可達108cfu/mL。生產(chǎn)罐的培養(yǎng)基配方(g/L)為蔗糖25，豆餅粉3，硫酸銨2. 5，酵母粉O. 2，磷酸氫二銨O. 8，硫酸鎂O. 05，硫酸亞鐵O. 02，氯化鈉O. 1，pH7. 5 ;發(fā)酵條件為裝液量70%，接種量5%，發(fā)酵溫度30°C，通氣量I : 1，罐壓O. 2kg/cm2，攪拌轉(zhuǎn)速100 300r/min，溶氧5%以上，發(fā)酵30小時和45小時分別補加10g/L蔗糖兩次，發(fā)酵時間68小時，菌量可達IOltlCfu/
mLo本發(fā)明中菌株LD-bl對植物病害真菌的生物防治效果混菌瓊脂平板打孔法的試驗表明，菌株LD-bl對黃瓜褐斑病菌、黃瓜灰霉病菌、黃瓜菌核病菌、蘋果腐爛病菌、茄子枯萎病菌、小麥赤霉病菌、白菜黑斑病菌和番茄灰霉病菌等植物病害真菌的生長均有顯著的抑制效果，其中對黃瓜褐斑病菌和蘋果腐爛病菌的拮抗作用最強。菌株LD-bl在蘋果果實上能夠顯著地抑制蘋果腐爛病菌對果實的侵蝕；溫室盆栽試驗中，LD-bl對黃瓜褐斑病菌的防治效果達到81. 2%。


圖I菌株LD-bl對蘋果腐爛病菌生長的拮抗作用。圖2菌株LD-bl對黃瓜褐斑病菌生長的拮抗作用。圖3菌株LD-bl在蘋果果實上對蘋果腐爛病菌的抑制作用。圖4菌株LD-bl防治黃瓜褐斑病害的盆栽試驗。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步描述，以下實施例旨在說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的進一步限定。實施例I短小芽孢桿菌LD-bl的分離取新鮮云霧龍膽的一段莖，無菌水沖洗2次，用無菌濾紙吸干水分；在70%乙醇溶液中浸泡2分鐘，再用O. I %升汞浸泡30秒，無菌水沖洗3次。在無菌條件下用刀片將外皮削去，并截成I厘米左右的小段，置于篩選培養(yǎng)基表面，30°C培養(yǎng)4 8天。待平板有菌長出后，平板劃線純化，得到分離細菌菌株的純培養(yǎng)物。實施例2
菌株LD-bl的形態(tài)學特征LD-bl在固體培養(yǎng)基平板上30°C培養(yǎng)I天，形成乳白色不透明菌落，菌落近似圓形，邊緣不整齊，中間有小突起，直徑O. 6 I. 1cm，不分泌色素；菌株LD-bl的菌體細胞為短桿狀，大小O. 5 μ . m O. 6 μ mX I. 5 μ m 2. I μ m,革蘭氏陽性，有芽孢。菌株LD-bl的生理生化特征菌株LD-bl的生長溫度范圍為8 50°C，pH范圍5. 5 8. 5，NaCl濃度范圍O 7% ;能夠利用的碳源有葡萄糖、蔗糖、乳糖、樹膠醛糖、木糖、半乳糖、甘露醇、N-乙酰-葡糖胺、葡糖酸鹽；不能利用淀粉、糊精、蜜二糖、鼠李糖和山梨醇；菌株LD-bl的接觸酶、檸檬 酸鹽利用、酪蛋白水解、七葉苷水解、V. P為陽性，氧化酶、脲酶、H2S產(chǎn)生、吲哚產(chǎn)生、硝酸鹽還原、明膠液化、精氨酸雙水解酶、淀粉水解、M. R.為陰性。菌株LD-bl的16S rDNA基因的PCR擴增和序列測定將菌株LD-bl接種于種子培養(yǎng)基，150r/min、30°C搖床培養(yǎng)24小時，離心收集菌體，用O. 5mol/LNaCl洗I次，重新懸浮，加溶菌酶和SDS破壁，用酚-氯仿法提取基因組DNA，用UNIQ-10試劑盒提取細菌基因組DNA。用細菌16S rDNA通用引物27F(5' -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1541R(5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')擴增得到目的基因片段。對菌株LD-bl的16S rDNA序列擴增，測序后獲得1444bp的序列，具體如SEQ ID No I所示。該序列在GenBank/EMBL/DDBJ中的序列登記號為JF932295,序列分析表明菌株LD-bl 與 Bacillus pumilus KNUC389 和 Bacillus pumilusKNUC235 的同源性最高，分別為達到99. 8%和99. 7%，結(jié)合形態(tài)學和生理生化特征指標，確定菌株LD-bl為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。菌株LD_bl現(xiàn)保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京)，保藏日期為2012年5月14日，保藏登記號為CGMCC No. 6112。實施例3菌株LD-bl的發(fā)酵生產(chǎn)工藝斜面培養(yǎng)基(g/L):蔗糖10，蛋白胨2，牛肉膏3，酵母膏O. 5，瓊脂15，pH7. 5，121°C滅菌30min。種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖15，蛋白胨5，酵母粉0.2，磷酸氫二鉀0.5，硫酸鎂0.05，氯化鈉 O. 1，ρΗ7· 5，121°C 滅菌 30min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖25，豆餅粉3，硫酸銨2. 5，酵母粉O. 2，磷酸氫二銨O. 8，硫酸鎂O. 05，硫酸亞鐵O. 02，氯化鈉O. I, ρΗ7· 5，121°C滅菌30min。將保臧菌種劃線接種于固體斜面培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)36 48h，用5mL無菌水將活化菌種從試管斜面上洗下，接入種子培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝IOOmL的液體種子培養(yǎng)基，接種后的三角瓶置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，150r/min、30°C培養(yǎng)24 30h制成搖瓶種子液。種子罐培養(yǎng)條件裝液量70%，接種量5%，發(fā)酵溫度30°C，通氣量I : 1，罐壓
O.2kg/cm2,攪拌轉(zhuǎn)速200 600r/min,溶氧10%以上,發(fā)酵時間24小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)條件裝液量70%，接種量5%，發(fā)酵溫度30°C，通氣量I : 1，罐壓
O.2kg/cm2,攪拌轉(zhuǎn)速100 300r/min,溶氧5%以上,發(fā)酵30小時和45小時分別補加IOg/L蔗糖兩次，發(fā)酵時間68小時。實施例4短小芽孢桿菌LD-bl對病原真菌生長的拮抗效果
將黃瓜褐斑病菌、黃瓜灰霉病菌、黃瓜菌核病菌、蘋果腐爛病菌、茄子枯萎病菌、小麥赤霉病菌、白菜黑斑病菌、番茄灰霉病菌活化和擴大培養(yǎng)，稀釋制成IO6孢子/mL的懸液，取O. 2mL孢子懸液與滅菌改良馬丁培養(yǎng)基15mL混合制成平板,凝固后,用滅過菌的6_直徑打孔器在每個平板上打孔，除去孔內(nèi)瓊脂并向孔中加入O. ImL短小芽孢桿菌LD-bl發(fā)酵上清液，28°C培養(yǎng)4d后，測量抑菌圈直徑。結(jié)果表明菌株LD-bl對黃瓜褐斑病菌、黃瓜灰霉病菌、黃瓜菌核病菌、蘋果腐爛病菌、茄子枯萎病菌、小麥赤霉病菌、白菜黑斑病菌和番茄灰霉病菌等植物病害真菌的生長均有顯著的抑制效果，其中對黃瓜褐斑病菌和蘋果腐爛病菌的拮抗作用最強。實施例5短小芽孢桿菌LD-bl在蘋果果實上對蘋果腐爛病菌的拮抗效果將紅富士蘋果用70 %酒精消毒，晾干后，用接種針在蘋果上刺一個6mm (深)X 4mm (直徑)的傷口，分別加入200 μ L的LD_bl發(fā)酵上清液和無菌水，2小時后分別接種IO5孢子/mL的蘋果腐爛病菌200 μ L，將果實放于果盤中，果盤用保鮮膜包裹，25°C放置6天，對照果實的病斑直徑為17. 5mm, LD-bl樣品處理后果實的病斑直徑為2. 4mm,僅為對照的13. 7%，結(jié)果表明內(nèi)生菌LD-bl產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)能夠顯著地抑制蘋果腐爛病菌對果實的侵蝕。實施例6短小芽孢桿菌LD-bl對黃瓜褐斑病菌的盆栽防治效果選取生長一致的黃瓜苗，先將LD-bl菌液2mL均勻噴施在黃瓜葉片上，8h后接種IO6孢子/mL的黃瓜褐斑病菌孢子懸浮液2mL，以僅噴水而不噴施病菌的處理為陰性對照，以僅噴施黃瓜褐斑病菌孢子液的處理為陽性對照，室溫保持25 28°C，濕度保持80% 90%，每處理3個重復，每個重復5株黃瓜苗，進行病級調(diào)查。黃瓜褐斑病嚴重度分級標準如下O級無病斑；1級病斑面積占整個葉面積的5%以下；3級病斑面積占整個葉面積的5% 25% ;5級病斑面積占整個葉面積的26% 50% ;7級病斑面積占整個葉面積的51% 75% ；9級病斑面積占整個葉面積的75%以上。病情指數(shù)和防效的計算方法如下
權(quán)利要求
1.一株防治植物病害的云霧龍膽內(nèi)生菌，為革蘭氏陽性的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus),菌株代號為LD-bl,該菌株于2012年5月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 6112。
2.防治植物病害的生防劑，包括短小芽孢桿菌LD-bl或從其來源的拮抗活性物質(zhì)作為有效成分。
3.權(quán)利要求2所述的生防劑，其中植物病害包括黃瓜褐斑病、黃瓜灰霉病、黃瓜菌核病、蘋果腐爛病、茄子枯萎病、小麥赤霉病、白菜黑斑病和番茄灰霉病。
4.短小芽孢桿菌LD-bl的培養(yǎng)基配方 種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖15，蛋白胨5，酵母粉O. 2，磷酸氫二鉀O. 5，硫酸鎂O. 05，氯化鈉 O. 1，ρΗ7· 5，121°C 滅菌 30min。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖25，豆餅粉3，硫酸銨2. 5，酵母粉O. 2，磷酸氫二銨O. 8，硫酸鎂O. 05，硫酸亞鐵 O. 02，氯化鈉 O. 1，ρΗ7· 5，121°C 滅菌 30min。
5.短小芽孢桿菌LD-bl的種子罐培養(yǎng)條件 裝液量70%，接種量5%，發(fā)酵溫度30°C，通氣量I : 1，罐壓O. 2kg/cm2，攪拌轉(zhuǎn)速200 600r/min，溶氧10%以上，發(fā)酵時間24小時。
6.短小芽孢桿菌LD-bl的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件 裝液量70%，接種量5%，發(fā)酵溫度30°C，通氣量I : 1，罐壓O. 2kg/cm2，攪拌轉(zhuǎn)速100 300r/min，溶氧5%以上，發(fā)酵30小時和45小時分別補加10g/L蔗糖兩次，發(fā)酵時間68小時。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可用于植物病害生物防治的云霧龍膽內(nèi)生菌及其發(fā)酵工藝，屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述菌株為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LD-b1，已于2012年5月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.6112?；炀傊桨宕蚩追ㄔ囼灡砻鳎闘D-b1可抑制多種植物病害真菌的生長。LD-b1能夠顯著抑制蘋果腐爛病菌對蘋果果實的侵蝕；溫室盆栽試驗中，LD-b1對黃瓜褐斑病菌的防治效果達到81.2％。將LD-b1在種子罐中培養(yǎng)24小時至對數(shù)生長期，按5％接種量接入生產(chǎn)罐，控制初始pH 7.5，發(fā)酵溫度30℃，溶氧5％以上，補料分批發(fā)酵68小時，菌量可達1010cfu/mL以上。菌株LD-b1生長快，抗菌譜廣，在植物病害生物防治方面具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號A01N63/02GK102965299SQ20121029037
公開日2013年3月13日 申請日期2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月16日
發(fā)明者黃海東, 楊紅澎, 李曉雁 申請人:天津農(nóng)學院