一種短小芽孢桿菌活菌制劑及其固體發(fā)酵方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種短小芽孢桿菌活菌制劑及其固體發(fā)酵方法和應(yīng)用，屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，所選用的短小芽孢桿菌保藏號為CGMCCNo.9161。本發(fā)明提供的短小芽孢桿菌高密度發(fā)酵方法包括以下步驟：菌種選擇、種子培養(yǎng)、固體發(fā)酵、發(fā)酵產(chǎn)物烘干、包裝成品。本發(fā)明具體采用甘蔗渣、粗麩皮為培養(yǎng)基主要成分，成本低廉，菌量高，有效活菌數(shù)達1×1011CFU/g以上；添加檸檬酸鈉可顯著縮短成孢時間，提高芽孢成熟率，延長產(chǎn)品貨架期。
CGMCC No 9161
20140513
【專利說明】一種短小芽孢桿菌活菌制劑及其固體發(fā)酵方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種短小芽孢桿菌活菌制劑及其固體發(fā)酵方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]短小芽孢桿菌pumiIus )呈桿狀，圓末端,單個或呈短鏈排列,革蘭氏陽性，橢圓形，中生或次端生；屬于飼用微生物菌種，適用于豬、禽類、反芻動物，也適用于魚、蝦等水產(chǎn)動物。
[0003]本發(fā)明中涉及的一株短小芽孢桿菌可產(chǎn)生多種外源性消化酶，如木聚糖酶、纖維素酶等，還可分泌抑菌物質(zhì)，對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌等多種病原菌具有抑制作用?，F(xiàn)已對其采用液體發(fā)酵，發(fā)酵菌量偏低，且芽孢耐熱性較差，后期噴霧干燥處理收率低。本發(fā)明采用固體發(fā)酵方法制備短小芽孢桿菌菌劑，發(fā)酵工藝簡單，菌體大量生長，菌量高；培養(yǎng)基中添加檸檬酸鈉，可顯著縮短成孢時間，提高芽孢成熟率；發(fā)酵產(chǎn)物低溫干燥芽孢存活率高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種短小芽孢桿菌活菌制劑及其固體發(fā)酵方法和應(yīng)用，制得的短小芽孢桿菌活菌制劑菌量高，操作簡單，生產(chǎn)成本低廉。
[0005]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn):
一種短小芽孢桿菌活菌制劑的固體發(fā)酵方法，它包括以下步驟:
(1)選用短小芽孢桿菌，將其活化；
(2)將短小芽孢桿菌接種于種子液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12?14h，待短小芽孢桿菌還未形成芽孢狀態(tài)，得固體發(fā)酵種子液；
(3)將步驟(2)的固體發(fā)酵種子液接種于滅菌的固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻；將發(fā)酵物料平攤于37°C下發(fā)酵培養(yǎng)2(T24h，鏡檢芽孢率>90% ；
(4)將步驟(3)得到的發(fā)酵產(chǎn)物直接90°C以下干燥，粉碎過80目篩，包裝成品。
[0006]所述短小芽孢桿菌選用短小芽孢桿菌S3，其保藏號為CGMCC N0.9161。
[0007]所述種子液體培養(yǎng)基為酶解的豆柏30g/L、玉米面10g/L、葡萄糖50g/L、NaCl 5g/L、余量為水，種子液體培養(yǎng)基的pH為7.0?7.2 ;所述酶解的豆柏是將豆柏采用中性蛋白酶40°C酶解Ih制得，中性蛋白酶的添加量為1000U/g。
[0008]所述固體培養(yǎng)基以質(zhì)量比為2:2:1的甘蔗渣、粗麩皮、酶解的豆柏為基礎(chǔ)料，并添加占總固體培養(yǎng)基的重量比為2%wt的檸檬酸鈉，料水比為1:1，攪拌均勻，調(diào)pH 6.5 ;所述酶解的豆柏是將豆柏采用中性蛋白酶40°C酶解Ih制得，中性蛋白酶的添加量為1000U/g。
[0009]本發(fā)明還提供了利用所述固體發(fā)酵方法制得的短小芽孢桿菌活菌制劑。其中，所述短小芽孢桿菌活菌制劑中的活菌含量為IX 10nCFU/g?1.5 X 111 CFU/g。
[0010]本發(fā)明還提供了所述的短小芽孢桿菌活菌制劑在制備抑制副溶血弧菌的抑菌劑中的應(yīng)用。短小芽孢桿菌固體發(fā)酵液用來抑制副溶血弧菌時的短小芽孢桿菌活菌含量不低于 lX109CFU/g。
[0011]本發(fā)明從對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中分離、篩選得到所述的短小芽孢桿菌，經(jīng)中國微生物菌種保藏管理中心鑒定，并于2014年5月13日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(簡稱 CGMCC)，保藏號為 CGMCC N0.9161。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和技術(shù)效果:
(1)無需發(fā)酵罐即可進行生產(chǎn)，操作簡單，發(fā)酵時間短，易于產(chǎn)業(yè)化；
(2)采用粗麩皮、甘蔗渣為固體發(fā)酵的原料，質(zhì)粒松大，滅菌及發(fā)酵過程中不結(jié)塊，利于菌體的好氧生長；甘蔗渣富含豐富的纖維素，經(jīng)微生物發(fā)酵后可轉(zhuǎn)變?yōu)橐妆粍游锵玫臓I養(yǎng)物質(zhì)，實現(xiàn)了甘蔗渣的綜合利用；與液體發(fā)酵相比，成本低廉，工藝簡單，無污染；
(3)固體發(fā)酵菌量高，活菌濃度在lX10nCFU/g以上，芽孢成熟率>90%；
(4)豆柏粗蛋白含量高，酶解后可降解為可溶性蛋白及小肽的混合物，有利于菌體的快速吸收利用，縮短延滯期；
(5)麩皮、甘鹿洛、S.柏等成分營養(yǎng)豐富,接種后菌體大量生長，成孢時間長，發(fā)酵24h后才開始逐漸成孢；但發(fā)酵時間過長，發(fā)酵料水分增多、產(chǎn)熱，易染雜菌。在培養(yǎng)基中添加檸檬酸鈉可顯著促進菌體產(chǎn)孢，發(fā)酵20h時芽孢成熟率>90% ；
(6)該發(fā)酵配方一方面可以獲得高菌量的短小芽孢桿菌；另一方面通過菌株發(fā)酵可獲得多種代謝產(chǎn)物，如酶、抑菌物質(zhì)；同時可分解原料轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿游镔|(zhì)；對增強動物抵抗力、促進動物生長具有顯著效用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是本發(fā)明實施例1中短小芽孢桿菌S3的種子生長曲線圖。
[0014]圖2是本發(fā)明所述短小芽孢桿菌S3不同發(fā)酵方式對副溶血弧菌的抑制作用結(jié)果，其中1:S3液體發(fā)酵液；2: S3固體發(fā)酵液。

【具體實施方式】
[0015]下面具體結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步詳細的說明。
[0016]實施例1頡頏菌的篩選一、短小芽孢桿菌S3的分離篩選
2013年5月至2013年9月，從膠州沿海多處采集蝦養(yǎng)殖區(qū)域的水樣、底泥、對蝦腸道糞便。底泥、對蝦腸道糞便樣品分別于無菌生理鹽水中10倍稀釋，充分研磨，取上清為樣品液；水樣直接作為樣品液；樣品液分別接種于2216E液體培養(yǎng)基中30°C富集培養(yǎng)48 h后稀釋，涂布于2216E平板中進行菌株的分離、純化，共篩選出26株純菌。
[0017]已純化單菌株采用平板點種法篩選頡頏菌。以副溶血弧菌為指示菌，將副溶血弧菌接種于2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，稀釋制備成15?16 CFU/mL的菌懸液，取0.1mL涂布2216E平板，備用。用無菌牙簽挑取待篩選的菌株，點接于含菌平板中，25°C恒溫培養(yǎng)24 h，觀察點接菌落周圍是否出現(xiàn)明顯的抑菌圈或覆蓋區(qū)。
[0018]對分離到的26株細菌采用點種法篩選到3株對副溶血弧菌具有頡頏作用的菌株，其中S3對副溶血弧菌具有較強的頡頏作用，能明顯抑制病原菌的生長，在病原菌周圍產(chǎn)生明顯清晰的抑菌圈。
[0019]經(jīng)細菌生理生化方法初步鑒定，菌株S3為芽孢桿菌屬，其生物學(xué)特性:革蘭氏染色陽性，在營養(yǎng)瓊脂平板上形成的菌落直徑約2 mm，邊緣整齊光滑，中間褶皺，乳白色。菌體形態(tài)呈桿狀，芽孢橢圓形，中生。
[0020]二、短小芽孢桿菌的分子遺傳學(xué)分類鑒定
首先提取菌株S3的DNA，以該DNA為模板，16S rRNA通用引物為引物，對16S rRNA片段進行擴增，擴增片段進行序列測定。測序結(jié)果用Blast軟件與GenBank中相關(guān)屬種的16S rRNA序列進行比對，結(jié)果顯示該菌株16S rRNA序列與GenBank基因庫中芽孢桿菌屬中飽Bacillus pumiIus飽rRNA序列同源度最高，同源率達到99%。通過DNAMAN6.0對Genbank中已有的芽孢桿菌屬的16S rRNA序列進行遺傳進化分析,結(jié)果顯示,菌株S3 16Sτ似k與Bacillus pumiIus同源性最高,判定該菌株為芽孢桿菌屬的短小芽孢桿菌。
[0021]將篩選到的菌株S3進行菌種保藏，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC);地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期:2014年5月13日；短小芽孢桿菌Bacillus pumiIus的保藏編號為CGMCCN0.9161。
[0022]實施例2
本發(fā)明所述短小芽孢桿菌活菌制劑的固體發(fā)酵方法具體包括以下步驟:
1、將選用的短小芽孢桿菌S3進行活化；
2、將菌種活化的所述短小芽孢桿菌S3置于種子培養(yǎng)液中進行復(fù)蘇傳代，制得種子菌液。按如下配方配制液體種子培養(yǎng)基:酶解的豆柏30g、玉米面10g、葡萄糖50g、NaCl 5g、水1L，調(diào)pH值7.0。所配上述液體種子培養(yǎng)基經(jīng)121°C、高壓蒸汽滅菌20min。取活化的菌種于150ml液體種子培養(yǎng)基中，接種量為體積比2% (V/V)，37°C，180rpm培養(yǎng)，定時取樣測定0D660nm，從圖1中可以看出，S3生長較快，12h時進入穩(wěn)定期，后期開始逐漸形成芽孢，取12?14h時菌液為固體發(fā)酵種子液。
[0023]3、將所述制得的種子菌液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，得固體發(fā)酵產(chǎn)物。按如下配方配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基:按甘蔗渣:粗麩皮:酶解的豆柏=2:2:1稱料，2%wt檸檬酸鈉，料水比1:1，料水混合后調(diào)pH約為6.5，121°C高壓蒸汽滅菌20min。將實施例1中制得的種子菌液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為按照體積比10%(V/V)，37°C培養(yǎng)20h，鏡檢芽孢成熟率>90%。本發(fā)明所述酶解的豆柏是將豆柏按1000U/g添加中性蛋白酶40°C酶解Ih0
[0024]4、將步驟3中的發(fā)酵產(chǎn)物直接85°C烘干，得短小芽孢桿菌發(fā)酵成品。倍數(shù)稀釋平板計數(shù)，所述短小芽孢桿菌制劑中的活菌含量為lX10nCFU/g?1.5X1011 CFU/g。
[0025]實施例3
取上述制得的短小芽孢桿菌制劑Ig于10ml水中浸泡6h，離心取上清液測定其對副溶血弧菌的抑制作用。將副溶血弧菌菌液稀釋成15-1O6 CFU/ml，取0.1 ml涂布2216E平板，平板等距離放置3個無菌牛津杯，分別加入200 ul短小芽孢桿菌S3液體發(fā)酵液、短小芽孢桿菌S3固體發(fā)酵浸泡液，25°C培養(yǎng)24 h后觀察測定抑菌圈直徑。如圖2所示，短小芽孢桿菌S3固體發(fā)酵具有明顯的抑菌效果(d=l.5cm),優(yōu)于液體發(fā)酵效果(d=l.1cm)。
[0026]以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種短小芽孢桿菌活菌制劑的固體發(fā)酵方法，其特征在于它包括以下步驟: (1)選用短小芽孢桿菌，將其活化； (2)將短小芽孢桿菌接種于種子液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12?14h，待短小芽孢桿菌還未形成芽孢狀態(tài)，得固體發(fā)酵種子液； (3)將步驟(2)的固體發(fā)酵種子液接種于滅菌的固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻；將發(fā)酵物料平攤于37°C下發(fā)酵培養(yǎng)2(T24h，鏡檢芽孢率>90% ； (4)將步驟(3)得到的發(fā)酵產(chǎn)物直接90°C以下干燥，粉碎過80目篩，包裝成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌的固體發(fā)酵方法，其特征在于:所述短小芽孢桿菌選用短小芽孢桿菌S3，其保藏號為CGMCC N0.9161。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的短小芽孢桿菌的固體發(fā)酵方法，其特征在于:所述種子液體培養(yǎng)基為酶解的豆柏30g/L、玉米面10g/L、葡萄糖50g/L、NaCl 5g/L、余量為水，種子液體培養(yǎng)基的pH為7.0?7.2 ;所述酶解的豆柏是將豆柏采用中性蛋白酶40°C酶解Ih制得，中性蛋白酶的添加量為1000U/g。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的短小芽孢桿菌的固體發(fā)酵方法，其特征在于:所述步驟(2)中接種量為占培養(yǎng)基體積比的2%，37 0C，180rpm培養(yǎng)14h。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的短小芽孢桿菌的固體發(fā)酵方法，其特征在于:所述固體培養(yǎng)基以質(zhì)量比為2:2:1的甘蔗渣、粗麩皮、酶解的豆柏為基礎(chǔ)料，并添加占總固體培養(yǎng)基的重量比為2%的檸檬酸鈉，料水比為1:1，攪拌均勻，調(diào)pH 6.5 ;所述酶解的豆柏是將豆柏采用中性蛋白酶40°C酶解Ih制得，中性蛋白酶的添加量為1000U/g。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的短小芽孢桿菌的固體發(fā)酵方法，其特征在于:所述步驟(3)中種子液接種于固體培養(yǎng)基的接種量為按照體積比10%，攪拌均勻，37°C培養(yǎng)2(T24h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述固體發(fā)酵方法制得的短小芽孢桿菌活菌制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的短小芽孢桿菌活菌制劑，其特征在于:所述短小芽孢桿菌活菌制劑中的活菌含量為lX10nCFU/g?1.5X1011 CFU/g。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的短小芽孢桿菌活菌制劑在制備抑制副溶血弧菌的抑菌劑中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的短小芽孢桿菌活菌制劑在制備抑制副溶血弧菌的抑菌劑中的應(yīng)用，其特征在于短小芽孢桿菌固體發(fā)酵液用來抑制溶血弧菌時的短小芽孢桿菌活菌含量不低于lX109CFU/g。
【文檔編號】A01N63/02GK104371957SQ201410652130
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】王嬌, 李慧芬, 梁晶晶 申請人:青島根源生物技術(shù)集團有限公司