Snp檢測篩選雞的絲羽性狀的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，包括如下步驟：1）提取待測雞DNA樣品，用DNA特異性引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；2）對PCR擴增產(chǎn)物中的雞第3號染色體70486623bp位點進行單核苷酸多態(tài)性檢測。本發(fā)明提供了一個高效準確、簡便快速的雞育種輔助選擇分子遺傳標記，為雞的絲羽性狀的選種和保種提供了一種有效的分子標記育種手段。本發(fā)明的檢測方法操作簡單，費用低廉，準確度高，可實現(xiàn)自動化檢測。
【專利說明】SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及SNP檢測篩選雞的方法，具體涉及SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法。【背景技術(shù)】
[0002]單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP),是指在基因組上單個核苷酸的變異，在遺傳物質(zhì)傳遞過程中可以穩(wěn)定遺傳給后代，因此可以作為分子標記進行育種和保種。
[0003]外貌是雞(Gallus gallus domesticus)重要的品種特征之一，在育種和保種中占據(jù)了重要地位，目前，對于控制雞外貌特征的分子標記研究仍然較少，僅有少量的外貌特征能夠通過分子標記進行輔助選擇育種。
[0004]羽毛是動物最復雜的外皮附屬物之一，具有不同的形狀、大小、花紋、色素沉積等各種方面的表型變異，而且變異可以發(fā)生在羽毛發(fā)育和分化的每個階段，因此可以作為研究進化和發(fā)育的一種理想的模型。羽毛發(fā)育的過程中可以形成部分或全部的羽枝結(jié)構(gòu)，構(gòu)成了不同的羽毛類型。家禽遺傳學家、動物學家和胚胎學家等多個領域的研究者都對決定羽毛形態(tài)的影響因素進行了很多研究，但是迄今為止，對于羽毛形態(tài)發(fā)生相關性狀的突變?nèi)匀恢跎?Lucas, A.M.and P.R.Stettenheim.Avian anatomy:1ntegument.1972:U.S.Government Printing Office; 1st edition)。絲羽，就是絲狀的羽毛結(jié)構(gòu)，是絲羽烏骨雞等的特征性狀之一。達爾文最早發(fā)現(xiàn)絲羽表型相對于正常羽毛來講是隱性遺傳的性狀，后來被證實是單基因遺傳的孟德爾性狀(Dunn, L.C.and M.A.Jul1.0n the Inheritance ofsome characters of the Silky fowl.J Genet, 1927, 19:27-63)。絲羽在身體部分的廓羽羽枝中缺少了羽小鉤的結(jié)構(gòu)，因而羽小枝之間不能連接在一起，所以羽毛比較蓬松，不能緊密覆蓋在皮膚上。絲羽的羽小枝結(jié)構(gòu)相對于片羽來講，變得更加細長。
[0005]目前，Shh (Sonic hedgehog)和 Bmp2 (Bone morphogenetic protein2)信號通路之間的互作已被證實和羽枝的形成等有關(Harris, Μ.P., S.Williamson, J.F.Fallon, etal.Molecular evidence for an activator—inhibitor mechanism in development ofembryonic feather branching.Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(33):11734-11739),其中，但是關于羽小鉤的發(fā)育和分化，在分子水平的研究還很少，更缺少檢測雞的絲羽性狀分子標記方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對目前缺少檢測雞的絲羽性狀分子標記方法的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法。
[0007]CAU資源家系是由中國農(nóng)業(yè)大學李寧教授課題組1998年建立的用于定位影響雞重要經(jīng)濟性狀作用基因的實驗群體， 親本為法國明星肉雞和泰和絲羽烏骨雞(Deng，X.Μ., Li, J.Y., Li, N., and ffu, C.X.(2001).Genetic analysis of important growth traitbased on F_2 resource population in chicken.Yi Chuan Xue Bao 28,801-807)。在CAU資源家系中記錄了 Fc^F1和F2代個體的絲羽性狀，通過連鎖分析定位了影響雞絲羽性狀的基因位點在雞3號染色體上，通過分析該區(qū)域的基因序列，分離得到了影響雞絲羽性狀的基因和序列變異。本發(fā)明的檢測雞絲羽性狀的分子標記方法，是利用雞3號染色體的十聚異戍二烯焦憐酸合成酶 2 亞基(Decaprenyl-diphosphate synthase subunit 2, PDSS2)基因和正弦復眼結(jié)合蛋白(Sine oculis-binding protein homolog, S0BP)基因之間,位于第3號染色體70486623bp位點的一個核苷酸進行單核苷酸多態(tài)性檢測，根據(jù)檢測結(jié)果判定雞的絲羽基因為純合或雜合。
[0008]本發(fā)明提供SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，包括如下步驟:
[0009]I)提取待測雞DNA樣品，用DNA特異性引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；
[0010]2)對PCR擴增產(chǎn)物中的雞第3號染色體70486623bp位點進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測。
[0011]如果SNP檢測結(jié)果為GG，待測雞的基因型為CC ;如果SNP檢測結(jié)果為CC，待測雞的基因型為GG ;如果SNP檢測結(jié)果為CG，待測雞的基因型為CG ;所述CC基因型雞為片羽純合個體，GG基因型雞為絲羽純合個體，CG基因型雞為雜合個體(G為鳥嘌呤核苷酸，C為腺嘌呤核苷酸)。
[0012]其中，步驟I)所述的DNA特異性引物對的脫氧核糖核苷酸序列為:
[0013]上游引物:5’-Biotin-CGACTCTCAACGCGGGAAC-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)
[0014]下游引物:5’-CTGGGGGCAGCCATCTTG-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)
[0015]其中，步驟I)所述的擴增產(chǎn)物長度為123bp，且含雞第3條染色體的70486623bp位。
[0016]其中，步驟I)所述的PCR擴增，其反應體系終濃度(25 μ I)為:
[0017]
【權(quán)利要求】
1.SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)提取待測雞DNA樣品，用DNA特異性引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物； 2)對PCR擴增產(chǎn)物中的雞第3號染色體70486623bp位點進行單核苷酸多態(tài)性檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，其特征在于，步驟I)所述的DNA特異性引物對的脫氧核糖核苷酸序列為: 上游引物:5’ -Biotin-CGACTCTCAACGCGGGAAC-3’ 下游引物:5’ -CTGGGGGCAGCCATCTTG-3’
3.如權(quán)利要求1所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，其特征在于，步驟1)所述的PCR擴增，其25 μl反應體系終濃度為:
4.如權(quán)利要求1所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，其特征在于，步驟I)所述的PCR擴增的反應條件為:94°C變性5min ;94°C變性30sec，63°C退火30sec，65°C延伸lmin，其中每擴增I個循環(huán)退火溫度降低1°C，共10循環(huán)；94°C變性30sec，53°C退火30sec，65°C延伸lmin，共30循環(huán)；65°C延伸7min ;20°C保存;取2μl用于瓊脂糖檢測，擴增得到單一的目的條帶后用于進一步檢測。
5.如權(quán)利要求1所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，其特征在于，步驟2)所述的單核苷酸多態(tài)性檢測采用焦磷酸鹽測序方法，為在PCR擴增產(chǎn)物中加入測序引物，放入PyroMarkID焦磷酸測序儀進行SNP檢測。
6.如權(quán)利要求5所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，其特征在于，所述的測序引物的脫氧核糖核苷酸序列為:
5， -GCGTCGCACACGGGC-3，
7.如權(quán)利要求5所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，其特征在于，所述的焦磷酸鹽測序方法具體為: 在步驟2) PCR擴增產(chǎn)物中加入Binding Buffer 38 μl > Sepharoe Beads 2μ1和滅菌水20μ 1，充分混勻10分鐘，轉(zhuǎn)移到反應板中，加入Annealing Buff er 12 μ 1，10 μ M測序引物1 μ 1，放入PyroMarkID焦磷酸測序儀進行SNP檢測,讀取結(jié)果。
8.用于權(quán)利要求1所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法的試劑盒，包含脫氧核糖核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物。
9.權(quán)利要求1-7任一項所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法在雞的育種中的應用。
10.權(quán)利要求9所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法在雞的育種中的應用，為在雞分子標記輔助選擇中的應用。`
【文檔編號】A01K67/02GK103667429SQ201210348358
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月18日
【發(fā)明者】胡曉湘, 馮春剛, 宋遲, 顧曉榮, 王彥強, 李寧 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學