專利名稱：與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的特征序列擴增標記及其獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的特征序列擴增(SequenceCharacterized Amplified Region，SCAR)標記及其獲得方法。
背景技術(shù)：
大白菜原產(chǎn)于我國，是深受我國人民喜愛的蔬菜之一。中國大白菜的特點是種質(zhì)資源豐富，生態(tài)類型多樣，分布面積廣，產(chǎn)量高，耐貯運，供應(yīng)期長，食用方法多樣，種植簡易、省工、成本低、價格低廉，在我國菜籃子中占重要地位，大白菜生產(chǎn)的好壞直接影響蔬菜市場供應(yīng)和人民生活，是名副其實的大眾化蔬菜。隨著生產(chǎn)力的發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，大白菜品質(zhì)育種日益受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。白菜品質(zhì)包括商品品質(zhì)、風(fēng)味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)。商品品質(zhì)指外觀形態(tài)、色澤、包球方式、個體大小、整齊度與結(jié)球緊實度等。隨著商品經(jīng)濟的發(fā)展、商品品質(zhì)的重要性將與日俱增。風(fēng)味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)對消費者食用更具實際意義。風(fēng)味品質(zhì)包括生食脆嫩、味甜、熟食味鮮，易煮爛；營養(yǎng)品質(zhì)則主要是指白菜內(nèi)含營養(yǎng)成份的多少，如蛋白質(zhì)、糖、氨基酸、維生素、纖維素(膳食纖維)、礦物元素等。隨著人民生活水平的提高，人們對風(fēng)味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)的要求也會愈來愈高。大白菜球色育種(黃心和桔紅心品種的選育)是品質(zhì)育種的研究內(nèi)容之一。北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心1990年開始進行桔紅心類型白菜品種的選育工作，結(jié)合游離小孢子培養(yǎng)和人工接種抗病性鑒定篩選技術(shù)，1996年“北京桔紅心”品種選育成功，“一種桔紅心白菜的選育方法”2002年獲國家發(fā)明專利(專利號為ZL 99 1 03404.X)。
在大白菜球色育種過程中我們發(fā)現(xiàn)，大白菜桔紅心球色為單隱性基因控制的簡單遺傳。以往，球色的鑒定必須要在收獲期剖球進行。為提高選擇效率和加快選育進程，研發(fā)與桔紅心性狀連鎖的分子標記，建立桔紅心性狀分子標記輔助育種系統(tǒng)非常必要。利用與育種目標性狀緊密連鎖的分子標記，對目標性狀進行跟蹤選擇，稱為分子標記輔助育種。目前，用于輔助育種的分子標記主要有限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、微衛(wèi)星DNA或簡單重復(fù)序列(SSR)等。在以上幾種標記中，RAPD標記是通過任意引物產(chǎn)生的基于PCR的分子標記，由于其具有簡單易行，需要模板DNA量少(一般15-25ng)，引物是隨機設(shè)計的具有通用性的優(yōu)點，受到廣大研究者的歡迎，并且在種質(zhì)資源的鑒定與分類、目標性狀基因的標記、遺傳圖譜的構(gòu)建等方面得到廣泛應(yīng)用。但RAPD標記有以下缺點1)標記是顯性標記，不能區(qū)分雜合型和純合型；2)由于它使用短引物(9-10個堿基)和低退火溫度(36-42℃)并允許堿基誤配，RAPD檢測易受環(huán)境條件的影響，重現(xiàn)性差。為了解決這些問題，Paran和Michelmore建立了SCAR(Sequence Characterized Amplified region，特異序列擴增)標記方法。SCAR標記引物通常是20個堿基左右的寡聚核苷酸，一般由RAPD標記的擴增產(chǎn)物克隆和測序后獲得，SCAR標記現(xiàn)已成為將RAPD標記轉(zhuǎn)化為可以實際應(yīng)用的穩(wěn)定的標記工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與白菜桔紅心性狀緊密連鎖的SCAR標記，該SCAR標記可用于桔紅心分子標記輔助育種中。
本發(fā)明的另一個目的是提供這種SCAR標記的獲得方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下設(shè)計方案一種與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的特征序列擴增(SCAR)標記，其具有序列表中SEQ ID NO1所述DNA序列。
一種與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的特征序列擴增(SCAR)標記的獲得方法，所述方法包括如下步驟1)與桔紅心連鎖的特異隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)標記的篩選提取基因組DNA，使用RAPD隨機引物對基因組DNA進行PCR反應(yīng)，對PCR產(chǎn)物進行電泳分析；通過BSA法，尋找與桔紅心性狀連鎖的RAPD標記，測定連鎖距離并驗證連鎖關(guān)系；2)與桔紅心連鎖的特異SCAR標記的獲得對RAPD產(chǎn)物進行回收、克隆和測序，根據(jù)測序結(jié)果的兩端序列設(shè)計引物對，長度20個堿基，用SCAR引物進行PCR擴增反應(yīng)，對反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳分析，測定連鎖距離并驗證連鎖關(guān)系。
所述步驟1)中的提取基因組DNA是指將1.5克去掉葉柄的葉片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2％CTAB提取液，混勻65℃水浴1小時；從水浴中取出離心管，加1/3體積5M醋酸鉀，混勻冰浴20分鐘；加入等體積氯仿/異戊醇抽提兩次；取上清加入2/3體積異丙醇沉淀DNA；洗滌緩沖液洗滌一次，吹干，加TE緩沖液溶解；加入RNase A使其終濃度達100μg/ml，混勻37℃水浴1小時；用等體積氯仿/異戊醇抽提；取上清，加入1/2體積7.5M醋酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀DNA；70％乙醇洗滌沉淀，吹干，加適量ddH2O溶解DNA。
所述步驟1)中的PCR反應(yīng)條件是25μl的反應(yīng)體系中含有2.5μl10×buffer，2.0μl 25mM MgCl2，2.0μl 2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，30ngRAPD隨機引物，50ng模板DNA；反應(yīng)程序為，94℃預(yù)變性4min，然后94℃15S，37℃30S，72℃75S下循環(huán)45次，72℃延伸7min后保存在4℃條件下。
所述步驟2)中RAPD產(chǎn)物的回收、克隆和測序是指用Gene-Clean試劑盒純化回收已證明是連鎖的RAPD標記，然后連接到pGEM@-T Vector Easy載體上，將重組質(zhì)粒DNA用EcoRI進行酶切處理，用RAPD-PCR驗證擴增產(chǎn)物，觀察擴增出的片段是否與原來的目的片段和酶切片段一致，并測序。
所述步驟2)中的PCR擴增反應(yīng)的條件是25μl的反應(yīng)體系包括2.5μl 10×buffer，3.3μl 15mM MgCl2，2.0μl 2.5mM dNTP，1.0μl Primer 1，1.0μlPrimer 2，2.0μl模板DNA和0.2μl TaqE；SCAR-PCR的反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min 然后94℃變性1min 37℃退火1min 72℃延伸2min 35個循環(huán)；再在72℃延伸7min，4℃保存。
所述步驟2)中的測定連鎖距離并驗證連鎖關(guān)系是指對DH株系DNA用SCAR引物進行PCR擴增，根據(jù)擴增結(jié)果和植株的表型性狀測定連鎖關(guān)系，應(yīng)用Mapmaker Ver.3.0計算遺傳距離。
所述SCAR引物為5’-GTTTCGCTCCCTTCTTCAAA-3’和5’-GTTTCGCTCCTCCATGACAT-3’。
本發(fā)明應(yīng)用隨機擴增多態(tài)性DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)，在以小孢子培養(yǎng)建立的大白菜雙單倍體(Doubled Haploid，DH)群體中采用混合分組分析法(Bulked Segregating Analysis，BSA)篩選了與桔紅心基因連鎖的RAPD標記，并將RAPD標記轉(zhuǎn)為穩(wěn)定的SCAR標記。
本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明獲得的SCAR標記具有分析程序簡單、反應(yīng)周期短、所需DNA量極少(一般為5-25ng)且質(zhì)量要求不苛刻；設(shè)備簡單，只需1臺PCR儀就可進行；與其他標記類型相比，成本低，重復(fù)性好，標記穩(wěn)定可靠，便于統(tǒng)計等優(yōu)點。
下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為引物OPB01對兩親本、兩池及池中各DH單株DNA擴增結(jié)果2為引物SCB01對DH群體的SCAR標記擴增結(jié)果圖
具體實施例方式
實施例1、與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的SCAR標記的獲得一.材料和方法1.1材料供試材料為大白菜普通白心株系91-112和桔紅心株系T12-19。兩材料均由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供。91-112為連續(xù)自交篩選9代的高代自交系，球心色為白色，葉面較平，葉球疊抱。T12-19是通過對北京地方品種和日本引進品種的雜種F1進行小孢子培養(yǎng)得到的雙單倍體系，球心色桔紅色，葉面皺，葉色深綠，植株生長勢弱。對91-112和T12-19的F1進行小孢子培養(yǎng)，得到100個雙單倍體株系，用于分子標記研究。為進一步驗證獲得的標記，還采用了桔紅心99-63與白心99-2產(chǎn)生的78株F2單株，此78個單株已經(jīng)F3代驗證球色不發(fā)生分離，其中42株為桔紅心，36株為白心。
1.2研究方法1.2.1與桔紅心連鎖的特異RAPD標記的篩選1.2.1.1基因組DNA的提取參照Murry等(1980)的方法(Murray M，Thompson W F.Rapid isolation ofhigh molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res，1980，8668-673.)加以改進后進行DNA提取。
將1.5克去掉葉柄的葉片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2％CTAB提取液(2％CTAB，1.4mM NaCl，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1％PVP-40，0.2％β-巰基乙醇)，混勻65℃水浴1小時；從水浴中取出離心管，加1/3體積5M醋酸鉀，混勻，冰浴20分鐘；加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)抽提兩次；取上清加入2/3體積異丙醇沉淀DNA；洗滌緩沖液(76％乙醇，10mM乙酸銨)洗滌一次，吹干，加TE緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.4)溶解；加入RNase A使其終濃度達100μg/ml，混勻37℃水浴1小時；用等體積氯仿/異戊醇(24∶1)抽提；取上清，加入1/2體積7.5M醋酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀DNA；70％乙醇洗滌沉淀，吹干，加適量ddH2O溶解DNA。
DNA濃度用紫外分光光度計(Shimadzu UV-1201，日本)以O(shè)D260值測定，并用0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。
1.2.1.2 PCR擴增與產(chǎn)物的檢測25μl的反應(yīng)體系中含有2.5μl 10×buffer，2.0μl 25mM MgCl2，2.0μl2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，30ng引物，50ng模板DNA。RAPD隨機引物、dNTP與100bp Marker購自Sangon公司，為便于國際交流，把Sangon系列引物編號轉(zhuǎn)換為Operon系列引物編號。Taq DNA聚合酶及反應(yīng)緩沖液購自TaKaRa公司。
反應(yīng)程序為，94℃預(yù)變性4min，然后94℃15S，37℃30S，72℃75S下循環(huán)45次，72℃延伸7min后保存在4℃條件下。PCR儀為日本大和公司制造的Life express TC-48/H/(t)Thermal Cycler。
取10μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物與2μl上樣緩沖液(0.09％溴酚蘭，60％甘油，60mM EDTA)混勻，點入含0.5mg/L EB的1.4％瓊脂糖凝膠中，在120V下進樣15分鐘，然后在80V下電泳2小時，取出凝膠，采用Kodak EDAS-120凝膠分析系統(tǒng)進行照相分析。
1.2.2與桔紅心連鎖的特異SCAR標記的獲得1.2.2.1 RAPD產(chǎn)物的回收、克隆和測序用Gene-Clean試劑盒(Bio-Lab公司)純化回收已證明是連鎖的RAPD標記，然后連接到pGEM@-T Vector Easy(Promega公司)載體上，將重組質(zhì)粒DNA用EcoRI進行酶切處理，用RAPD-PCR驗證擴增產(chǎn)物，觀察擴增出的片段是否與原來的目的片段和酶切片段一致。驗證后由上海生工公司完成測序。經(jīng)電泳驗證，擴增片段與目標片段大小一致，片段長度約850bp，經(jīng)上海生工公司測序后，獲得了845bp的序列片段。
1.2.2.2 SCAR引物的設(shè)計和PCR反應(yīng)根據(jù)測序結(jié)果的兩端序列設(shè)計引物對，長度16-20個堿基。用SCAR引物進行擴增的反應(yīng)條件如下25μl的反應(yīng)體系包括2.5μl 10×buffer，3.3μl 15mM MgCl2，2.0μl 2.5mM dNTP，1.0μl Primer 1(15ng/μl)，1.0μl Primer 2(15ng/μl)，2.0μl模板DNA(5ng/μl)和0.2μl TaqE(5U/μl)。SCAR-PCR的反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性1min，37℃退火1min，72℃延伸2min，35個循環(huán)；再在72℃延伸7min，4℃保存。取10μl反應(yīng)產(chǎn)物，與2μl溴酚蘭(0.25％溴酚蘭，40％蔗糖水溶液)混勻，點入含0.5μg/ml EB的1.0％瓊脂糖凝膠中，在5V/cm電場強度下穩(wěn)壓電泳約1-2小時，經(jīng)EB染色后用Kodak EDAS-120凝膠分析儀進行分析照相。
二、結(jié)果與分析2.1 DH系群體的球色鑒定收獲期對100個雙單倍體株系進行了球色鑒定，其中桔紅心株系59個，白心株系41個，經(jīng)卡方測驗，x2＝3.24＜x20.05＝3.841，符合1∶1的理論分離，說明桔紅心為單基因控制的簡單遺傳。現(xiàn)暫將桔紅心基因定名為Or基因。
2.2隨機引物篩選首先對兩親本篩選能產(chǎn)生多態(tài)性的RAPD引物，篩選了25套500個Operon系列的10堿基引物(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、S、T、U、V、W、X、Y、Z)，其中462個引物可擴增到清晰的條帶，有效引物的比例為92.4％，譜帶總數(shù)為2032條，平均每個引物擴增的譜帶數(shù)為4.1條。雙親間有多態(tài)性差異的引物124個，經(jīng)過2次重復(fù)，去掉重復(fù)性差的引物，得到雙親間穩(wěn)定表現(xiàn)多態(tài)的引物97個。
在59個桔紅心DH株系和41個白心DH株系中隨機各選8株，分別混合形成桔紅心池與白心池，利用有差異的97個引物對兩個池的DNA進行擴增，發(fā)現(xiàn)13個引物在兩池間有差異譜帶，但在打開池進行單株確證時，其中12個引物擴增的標記并不與桔紅心球色基因連鎖或連鎖不緊密，見表1。而引物OPB01(5′-GTTTCGCTCC-3′)產(chǎn)生的分子量為845bp的條帶OPB01-845在桔紅心池的各單株中存在，而在白心池的單株中不存在，重復(fù)3次，結(jié)果一致(見圖1)，初步確定OPB01-845與桔紅心球色基因存在連鎖關(guān)系。
表1 13個引物擴增到的標記在兩池中的統(tǒng)計結(jié)果

圖1 引物OPB01對兩親本、兩池及池中各DH單株DNA擴增結(jié)果C陰性對照；M分子量標準(100bp DNA ladder)；1P1，91-112；2P2，T12-19；3白心池；4桔紅心池；5～12白心池中各單株；13～20桔紅心池中各單株2.3連鎖距離的測定及連鎖關(guān)系的進一步驗證對100個DH株系DNA用引物OPB01進行PCR擴增，有60株擴增到OPB01-845，40株沒有擴增到此帶，經(jīng)卡方檢驗符合1∶1分離，這一結(jié)果與表型檢測結(jié)果是一致的。59株桔紅心單株中僅3株經(jīng)OPB01擴增未出現(xiàn)OPB01-845，41株白心單株中僅有4株擴增到OPB01-845，即100個DH株系中有7個交換株系，重組率為7％。重復(fù)一次，結(jié)果一致。根據(jù)擴增結(jié)果和植株的表型性狀測定連鎖距離，結(jié)果見表2。應(yīng)用Mapmaker Ver.3.0(Lander ES，Green P，Abrahamson J.MAPMARKERan interactive computer package forconstructing primary genetic linkage maps of experimental and naturalpopulations.Genomics，1987，1174～181.)計算遺傳距離為3.8cM(centimorgan)，LOD值為19.05，表明OPB01-845與桔紅心基因呈緊密連鎖。
表2 OPB01-845標記與桔紅心基因(Or)的遺傳距離測定結(jié)果

為進一步確認OPB01-845與桔紅心基因的連鎖關(guān)系，選取另一群體——桔紅心自交系99-63與白心自交系99-2雜交獲得的78個F2單株(F3代球色不發(fā)生分離)，用引物OPB01進行PCR擴增，其中，42個桔紅心植株全部擴增到OPB01-845；36個白心植株中有28株未擴增到OPB01-845，有8株擴增到此條帶，此8株為交換株，與田間球色鑒定吻合率為89.7％。這與在DH群體中93％的吻合率基本一致。這一結(jié)果進一步證實了OPB01-845與大白菜桔紅心基因的緊密連鎖關(guān)系。
2.4特異片段的測序結(jié)果及SCAR引物對設(shè)計特異片段OPB01-845的測序結(jié)果如下。序列全長為845bp，兩端各包含一個OPB01序列(5’-GTTTCGCTCC-3’)。
根據(jù)測序結(jié)果，兩端各延長10個堿基，設(shè)計一對20堿基引物SCB01L(5’-GTTTCGCTCCCTTCTTCAAA-3’)、SCB01R(5’-GTTTCGCTCCTCCATGACAT-3’)。引物由上海生工公司合成。
GTTTCGCTCCCTTCTTCAAATCTTCCGCAATTGACGGCGAATCTGATCTGGGTTCGTCGGAAAAAGCTTCCGCCTTTGGCGAATCGGCGTCTTGGGTTTTCGCGATTTTTCTTTTGTTCGGGGAGGGAGATGAATTGGAAGCTTGGGGGGTCGTTTTCTTCTTGGCGGATGCGCGAGCGTTGGACATGAGAGCGTCGAATGCAGAGGGGCGAGAAGAAGACATTGCTCTGTGGTGGAGGCGCGAGGTGAAGGGAAAGGGGGAAACCAATGCGGAGGAGAATCGAGTTTTAGTGCAGAGAGAAGAAATGCATCGGAAGTGATTCGATGATCGAATCGCTAACATCAGTTTGACTCAGAGAGAGAGAAAGGTAGAGTTTTTTTGAAATTAGGGTTTATGAATTTACGGAGAGGACACGTGTTGCAATCTTGAAGAAAGAAAAATATGGCGGCAGAGTTTCTCCTCTGCTTTGGACGTAGATGATGAGTATATATA
TACAAATTAATTTGAATATTTTGACTTATTAACTCTTTTTATTAACAATTATATATACTAGATCCTCTGTCCGCGCTACGCGCGGATTATAAATTTTAAATATATTATTCATAATTATTATTAATATGTGAATATTTTTACTTTGTATTTAATTTAATTTTAATGTTTAATAGTATCTTTAGCAGTTTTCTATTATTTTTTTTTACGTTTTTGTTTTCTATAAATTTAGAAATTTTGTAAAATTTGGTATATGCACCACTTAGCTTTGGTCTTATGATATGTCTACATTTTATGAACACACTGAAAATGGTGTTGAAATCACGTTATCTTTTATGTCATGGAGGAGCGAAAC實施例2、SCAR引物對在DH群體及F2單株中的PCR分析利用合成的SCAR引物，在58℃的退火溫度和35個循環(huán)的條件下獲得了較好的SCAR擴增結(jié)果。這是目前大白菜與桔紅心性狀連鎖的第一個SCAR標記，將其命名為SCB01-845標記。
對DH群體100個株系DNA用SCAR引物對SCB01進行PCR擴增，可以看到擴增到一條長845bp左右的單一條帶，在100個DH株系中有60株擴增到OPB01-845，40株沒有擴增到此帶，這一擴增結(jié)果與RAPD標記OPB01-845在DH群體中的分離結(jié)果相一致。
結(jié)果見圖2所示，其中M分子量標準(100bp DNA ladder)；CK陰性對照；W白心池；Or桔紅心池；1-32DH株系。
對78個F2單株用SCB01引物對進行PCR擴增，42個桔紅心單株全部擴增到SCB01-845，36個白心單株中有29株未擴增到SCB01-845，有8株擴增到此條帶，這一PCR擴增結(jié)果與RAPD標記OPB01-845在78個F2單株中的分離結(jié)果相一致。
用設(shè)計合成的SCAR引物對在100個DH株系和78個F2單株進行PCR擴增，擴增結(jié)果都表明，SCAR標記SCB01-845與RAPD標記OPB01-845的分離結(jié)果相一致，呈共線性分離。這說明RAPD標記OPB01-845已成功的轉(zhuǎn)化為SCAR標記SCB01-845。
在DH群體中SCAR標記SCB01-845與田間球色鑒定的吻合率為93％，在78個F2單株中SCAR標記SCB01-845與田間球色鑒定的吻合率為89.7％，90％的檢測準確率說明該SCAR標記可以應(yīng)用到育種輔助選擇中，從而提高球色育種中的選擇效率，加快育種進程。
序列表<110>北京市農(nóng)林科學(xué)院<120>與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的特征序列擴增標記及其獲得方法<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>845<212>DNA<213>蕓薹種蕓薹屬大白菜亞種(Brassica campestris L.ssp.pekinensis)<400>1gtttcgctcc cttcttcaaa tcttccgcaa ttgacggcga atctgatctg ggttcgtcgg60aaaaagcttc cgcctttggc gaatcggcgt cttgggtttt cgcgattttt cttttgttcg120gggagggaga tgaattggaa gcttgggggg tcgttttctt cttggcggat gcgcgagcgt180tggacatgag agcgtcgaat gcagaggggc gagaagaaga cattgctctg tggtggaggc240gcgaggtgaa gggaaagggg gaaaccaatg cggaggagaa tcgagtttta gtgcagagag300aagaaatgca tcggaagtga ttcgatgatc gaatcgctaa catcagtttg actcagagag360agagaaaggt agagtttttt tgaaattagg gtttatgaat ttacggagag gacacgtgtt420gcaatcttga agaaagaaaa atatggcggc agagtttctc ctctgctttg gacgtagatg480atgagtatat atatacaaat taatttgaat attttgactt attaactctt tttattaaca540attatatata ctagatcctc tgtccgcgct acgcgcggat tataaatttt aaatatatta600ttcataatta ttattaatat gtgaatattt ttactttgta tttaatttaa ttttaatgtt660taatagtatc tttagcagtt ttctattatt tttttttacg tttttgtttt ctataaattt720agaaattttg taaaatttgg tatatgcacc acttagcttt ggtcttatga tatgtctaca780ttttatgaac acactgaaaa tggtgttgaa atcacgttat cttttatgtc atggaggagc840gaaac 845<210>2
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的SCAR基因上游引物<400>2gtttcgctcc cttcttcaaa20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的SCAR基因下游引物<400>3gtttcgctcc tccatgacat20
權(quán)利要求
1.一種與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的特征序列擴增(SCAR)標記，其具有序列表中SEQ ID NO1所述的DNA序列。
2.一種與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的特征序列擴增標記的獲得方法，其特征在于所述方法包括如下步驟1)與桔紅心連鎖的特異隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)標記的篩選提取基因組DNA，使用隨機擴增多態(tài)性DNA標記隨機引物對基因組DNA進行PCR反應(yīng)，對PCR產(chǎn)物進行電泳分析；通過混合分組分析法(Bulked SegregatingAnalysis)，尋找與桔紅心性狀連鎖的隨機擴增多態(tài)性DNA標記標記，測定連鎖距離并驗證連鎖關(guān)系；2)與桔紅心連鎖的特征序列擴增標記的獲得對隨機擴增多態(tài)性DNA標記產(chǎn)物進行回收、克隆和測序，根據(jù)測序結(jié)果的兩端序列設(shè)計引物對，長度20個堿基，用特征序列擴增標記引物進行PCR擴增反應(yīng)，對反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳分析，測定連鎖距離并驗證連鎖關(guān)系。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的特征序列擴增標記的獲得方法，其特征在于所述步驟1)中的提取基因組DNA是指將1.5克去掉葉柄的葉片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2％CTAB提取液，混勻65℃水浴1小時；從水浴中取出離心管，加1/3體積5M醋酸鉀，混勻冰浴20分鐘；加入等體積氯仿/異戊醇抽提兩次；取上清加入2/3體積異丙醇沉淀DNA；洗滌緩沖液洗滌一次，吹干，加TE緩沖液溶解；加入RNase A使其終濃度達100μg/ml，混勻37℃水浴1小時；用等體積氯仿/異戊醇抽提；取上清，加入1/2體積7.5M醋酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀DNA；70％乙醇洗滌沉淀，吹干，加適量ddH2O溶解DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的特征序列擴增標記的獲得方法，其特征在于所述步驟1)中的PCR反應(yīng)條件是25μl的反應(yīng)體系中含有2.5μl10×buffer，2.0μl25mM MgCl2，2.0μl2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，30ng RAPD隨機引物，50ng模板DNA；反應(yīng)程序為，94℃預(yù)變性4min，然后94℃15S，37℃30S，72℃75S下循環(huán)45次，72℃延伸7min后保存在4℃條件下。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的特征序列擴增標記的獲得方法，其特征在于所述步驟2)中隨機擴增多態(tài)性DNA標記產(chǎn)物的回收、克隆和測序是指用Gene-Clean試劑盒純化回收已證明是連鎖的隨機擴增多態(tài)性DNA標記，然后連接到pGEM@-TVector Easy載體上，將重組質(zhì)粒DNA用EcoRI進行酶切處理，用RAPD-PCR驗證擴增產(chǎn)物，觀察擴增出的片段是否與原來的目的片段和酶切片段一致，并測序。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的特征序列擴增標記的獲得方法，其特征在于所述步驟2)中的PCR擴增反應(yīng)的條件是25μl的反應(yīng)體系包括2.5μl 10×buffer，3.3μl 15mM MgCl2，2.0μl 2.5mMdNTP，1.0μl Primer 1，1.0μl Primer 2，2.0μl模板DNA和0.2μl TaqE；SCAR-PCR的反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min然后94℃變性1min 37℃退火1min 72℃延伸2min 35個循環(huán)；再在72℃延伸7min，4℃保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的特征序列擴增標記的獲得方法，其特征在于所述步驟2)中的測定連鎖距離并驗證連鎖關(guān)系是指對DH株系DNA用特征序列擴增標記引物進行PCR擴增，根據(jù)擴增結(jié)果和植株的表型性狀測定連鎖關(guān)系，應(yīng)用Mapmaker Ver.3.0計算遺傳距離。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的特征序列擴增標記的獲得方法，其特征在于所述特征序列擴增標記引物為5’-GTTTCGCTCCCTTCTTCAAA-3’和5’-GTTTCGCTCCTCCATGACAT-3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與大白菜桔紅心性狀緊密連鎖的特征序列擴增標記，其DNA序列見序列表中SEQ ID NO1序列。其獲得方法包括1)提取基因組DNA，使用RAPD隨機引物對基因組DNA進行PCR反應(yīng)，對PCR產(chǎn)物進行電泳分析；通過BSA法，尋找與桔紅心性狀連鎖的RAPD標記，測定連鎖距離并驗證連鎖關(guān)系。2)對與桔紅心性狀連鎖的RAPD產(chǎn)物進行回收、克隆和測序，根據(jù)測序結(jié)果的兩端序列設(shè)計引物對，長度20個堿基，用SCAR引物進行PCR擴增反應(yīng)，對反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳分析，測定連鎖距離并驗證連鎖關(guān)系。本發(fā)明的優(yōu)點是獲得的SCAR標記具有分析程序簡單、周期短、所需DNA量極少(一般為5－25ng)且質(zhì)量要求不苛刻；設(shè)備簡單；與其他標記類型相比，成本低，重復(fù)性好，標記穩(wěn)定可靠，便于統(tǒng)計。
文檔編號C12P19/34GK1594588SQ0315703
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月11日
發(fā)明者張鳳蘭, 張德雙, 徐家炳, 劉秀村, 王美, 余陽俊, 趙岫云 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院