專利名稱：一種防治植物真菌病害的枯草芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物和生物肥料領域，特別是涉及枯草芽孢桿菌，具體而言，本發(fā)明涉及一種防治植物真菌病害的枯草芽孢桿菌及其應用。
背景技術：
植物病害是影響農業(yè)生產的主要因素之一，一直以來化學農藥防治病蟲害對農業(yè)生產起了十分重要的作用。但由于化學農藥的大量使用，帶來很多負面作用，如污染生態(tài)環(huán)境、危害人畜、產生抗藥性，傷害非靶標生物，農藥殘留等問題，嚴重影響了人類健康和生態(tài)平衡等一系列問題，這促使人們探尋對人類和環(huán)境無害并具良好防治效果的新型植物病蟲害防治策略。隨著全球范圍內研制開發(fā)高效低毒生防制劑的興起，開發(fā)微生物制劑來控制有害生物，已經成為替代或減少化學農藥使用的新型防治措施之一，受到世界各國學者、 企業(yè)和消費者的重視。利用有益微生物防治植物病害始于1921年的Hartely利用真菌防治猝倒病(王曉宇，中國農業(yè)科學，2011)。到目前植物病害生防微生物已涉及真菌、放線菌、細菌乃至病毒(噬菌體)等種群，而利用拮抗微生物來防治植物病害成為生物防治的一個主策略，并已顯示出良好的應用前景。目前，應用較多的生防細菌是促進植物生長的根際細菌(plantgrowthpromoting rhizobacteria, PGPR),其對植物的有益作用主要表現(xiàn)在防病和刺激生長兩個方面。對病害的防治機制包括拮抗、寄生、競爭、捕食等多種方式，產生的抗生素是拮抗作用的重要作用方式之一。植物促生細菌通過植于根系和優(yōu)先占領根系或抑制根上有害細菌或真菌的生長從而達到防控作用。其中枯草芽孢桿菌是一種嗜溫性的好氧產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，能夠產生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑的內生孢子，其抑制植物病原菌的范圍很廣，包括根部病害、枝干病害、葉、花部病害和收獲后果品病害，在土壤和植物的表面普遍存在，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境，是一種理想的生防微生物?？莶菅挎邨U菌通過成功定殖至植物根際、體表或體內，與病原菌競爭植物周圍的營養(yǎng)，分泌抗菌物質以抑制病原菌生長，同時誘導植物防御系統(tǒng)抵御病原菌入侵，從而達到生防的目的。由于它生長速度快、營養(yǎng)需求簡單，在植物的表面易于存活、定殖與繁殖，而且生產枯草芽孢桿菌制劑的工藝簡單，制劑穩(wěn)定，施用方便，儲存期長，因此是一種理想的生防微生物。據報道，枯草芽孢桿菌對多種由絲狀植物病原真菌所引起的植物病害具有良好的防治作用，在糧食作物中，由立枯絲核菌solani )引起的紋枯病、由稻梨孢(.Magnaporthe grisea)引起的稻痕病、由禾白粉菌iErysiphe raminis)弓丨起的禾谷類白粉病等；蔬菜中由灰葡萄孢cinerea)引起的爺科和葫蘆科灰霉病、由尖鐮孢菌(.Fusarium引起的黃瓜枯萎病、由瓜果腐霉aphanidermatum^Y^M]根腐病以及由疫霉屬{Phytophthora')引起的疫病和核盤菌{Sclerotinia sclerotiorum)等引起的蔬菜病害；枯草芽孢桿菌還可以控制采后水果的多種疫病如草莓灰霉病iBotrytis cinerea)和白粉病 iErysiphe raminis),香蕉枯萎病 iFusarium oxysporum)等；此外，枯草芽孢桿菌防治林果病害也有較好的效果，如由聚生小穴殼菌iDothiorellagrearia)弓丨起的楊樹潰瘍病，以及由膠孢炭疽gloespor ioofes)引起的炭疽病、由蘋果柱盤孢霉(^Wi/ <*-o577oriw 引起的黑點病等?？芍?枯草芽孢桿菌
現(xiàn)已成為一種理想的生防細菌，篩選對病原真菌有高效抑制作用的菌株是防治植物病害的有效方法之一。但是，目前已知對植物真菌病害具有防治作用的枯草芽孢桿菌大多效果不佳、作用對象比較單一、易受自然環(huán)境影響、競爭存活能力有限等弊端(程愛麗，唐文華，王益民.植物病理學報，1996)。出乎意外地，本申請發(fā)明人經過多年悉心研究，從植物根際土壤中分離到一株新的枯草芽孢桿菌菌株，該菌株對多種植物真菌病害具有良好的防治效果，遺傳穩(wěn)定，且不容易產生抗性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的枯草芽孢桿菌的菌株，所述菌株對多種植物病害 的防治有明顯效果，且具有較高的遺傳穩(wěn)定性。本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)已經于2012年11月7日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6788。進一步地，本發(fā)明提供上述枯草芽孢桿菌防治植物真菌病害的用途。優(yōu)選地，導致所述植物真菌病害的植物真菌病原體為腐霉病菌O0FMiyW、鐮刀菌(Fusarium)、核盤菌iSclerotinia)和灰霉病菌iBotrytis、。更優(yōu)選地，所述植物真菌病害為黃瓜腐霉病菌{Pythium aphanidermatum)、熱瓜鍵刀菌(Fusariutn roseum )、油菜核盤菌{Sclerotinia ScJerofior應)、番爺灰霉病菌(Botrytis cinerea)。進一步地，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌可以制成微生物菌劑，即將所述菌株在PDA培養(yǎng)液(培養(yǎng)液組成為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20 g/L，pH為8)中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27 °C，培養(yǎng)天數為5天，轉速為200 rpm，培養(yǎng)液過濾后，將菌液細胞數調節(jié)為IO9個/mL，即制得本發(fā)明的枯草芽孢桿菌微生物菌劑。進一步地，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌可以制成生物肥，即將枯草芽孢桿菌孢子液(孢子濃度為IxlO8CfuAiL)與無機肥料、有機肥料相混合制得，三者的重量比為I :6 13 ;所述無機肥料選自氮肥、磷肥和鉀肥，所述氮肥為尿素或硫酸銨，所述磷肥為磷酸銨或磷酸鈣，所述鉀肥為硫酸鉀或氯化鉀；所述有機肥料為堆肥或沼氣肥。進一步地，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌可以制成如下生物肥，即將枯草芽孢桿菌孢子液(孢子濃度為IxlO8CfuAiL)與微肥、有機肥料相混合制得，三者的重量比為I :3 6 ;所述微肥選自碳酸錳鋅、硼鎂肥、鑰酸鈉、螯合態(tài)銅或磷酸銨鐵中的一種或多種；所述有機肥料為堆肥或沼氣肥。上述生物肥的制備是將原料按比例充分攪拌，混合均勻，隨后用傳送帶經粉碎后送入滾筒造粒機，在滾筒內噴射蒸汽使物料加熱至20-40°C，通過滾筒不停轉動使物料成球狀顆粒。將成球顆粒送入烘干滾筒，輸入熱風烘干。將烘干的成球經冷卻、篩分、罐裝或袋裝成成品。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌是從植物根際土壤中分離得到的，其實驗室命名為菌株MSB1201，已經于2012年11月7日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6788。菌株MSB1201在LB固體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂15g/L)上菌落呈圓形，邊緣不整齊，乳白色，不透明，表面粗糙有褶皺，無光澤。培養(yǎng)至30h，菌體均以休眠體芽孢的形式存在。菌落呈淺黃色。顯微觀察菌體為單細胞，桿狀，單生或雙生，有時成鏈狀。革蘭氏染色陽性，芽孢橢圓形。利用生理生化指標對其進行鑒定后發(fā)現(xiàn)，其淀粉水解、明膠水解、檸檬酸鹽利用、6. 5% NaCl、V-P測定等呈陽性；接觸酶、卵黃反應、吲哚產生、丙酸鹽的利用等呈陰性。然后利用分子生物學手段對采用16S rDNA基因特異引物對16S rDNA進行擴增，將擴增產物回收并測序，將測序結果進行Blast分析，結果發(fā)現(xiàn)與菌株MSB1201高度同源的菌株均是芽孢桿菌，同源性98%以上，并結合生理生化特征，鑒定其為枯草芽孢桿菌。本發(fā)明的效果
1、在平板對峙法中，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌對腐霉病菌、鐮刀菌、核盤菌和灰霉病菌四 類植物病原真菌具有良好的抑制效果，說明本發(fā)明菌株具有較廣的抑菌譜；
2、本發(fā)明的枯草芽孢桿菌轉40代后對腐霉病菌、鐮刀菌、核盤菌和灰霉病菌效果未發(fā)生顯著變化，說明本發(fā)明所述菌株具有很好的遺傳穩(wěn)定性；
3、將本發(fā)明所述菌株制成微生物菌劑后，并以50%、25%、10%、5%和1%的濃度與腐霉病菌、鐮刀菌、核盤菌和灰霉病菌的分生孢子混合，將其置于96孔細胞培養(yǎng)板內，25°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后觀察抑菌效果，以10%的菌液處理平均抑菌率就達到60%以上。


圖I本發(fā)明的枯草芽孢桿菌菌株的稀釋分離過程示意圖 圖2本發(fā)明的枯草芽孢桿菌菌株的16S rDNA的聚類分析 圖3本發(fā)明的枯草芽孢桿菌菌株對植物病原真菌的抑菌效果圖。A 為番爺灰霉病菌ciflerea ), B 為甜瓜鐮刀菌 iFusarium roseum) ,C 為黃瓜腐霉病菌{Pythium aphanidermatum) 為施菜核盤蔑{Sclerotinia sclerotiorum)
具體實施例方式 本發(fā)明公開了一種高抗真菌活性的枯草芽孢桿菌，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數來實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，這些都被視為包括在被發(fā)明內。本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌已經通過較規(guī)范的實施例進行了描述，相關人員明顯能在不擺脫本發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動和適當的變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。 下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明。實施例I微生物從土樣中的分離
從河北衡水市溫室內采回健康黃瓜植株的根際土壤，稱取IOg土壤用90mL無菌水進行混勻，然后在從中取ImL樣用9mL無菌水進行稀釋，以此進行6次，稀釋成10_6、10_7、10_8 3個梯度(具體稀釋方法如圖I所示)，移取最后三個梯度的菌懸液100微升，涂布于LB固體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂，15g/L)平板上，以最后一次的稀釋液作為對照，于28°C下培養(yǎng)，并每24h觀察一次。選擇對照中無菌落，而此前的稀釋液中長出菌落的菌株，根據菌落形態(tài)、顏色等特征跳取單菌落于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并純化編號。
實施例2拮抗菌株的篩選
防治植物真菌病害的拮抗細菌的篩選在滅菌培養(yǎng)皿中均勻加入100 u L濃度為IXlO7cfu/mL黃瓜腐霉病菌菌懸液，倒入冷卻至約50°C的熔化LB培養(yǎng)基20 mL充分混勻。待培養(yǎng)基完全凝固后，用接種環(huán)點接種供試的拮抗菌，每皿點8-10個待測細菌菌株，28°C溫箱中培養(yǎng)48 h后，檢測抑菌圈的有無及大小。經初次測試將有拮抗作用的菌株純化后進行重復測試，基本方法同上，每平板點接3個菌株，各3次重復。根據拮抗帶(抑菌圈邊緣與菌落邊緣的間距)的寬度確定拮抗程度。拮抗帶>lmm的菌株定為有拮抗作用的菌株；拮抗帶Mmm的作為拮抗細菌，進行拮抗性復篩試驗，選擇一個抑制作用最強的菌株，命名為MSB1201，即本申請所涉及的上述枯草芽孢桿菌。實施例3菌株的16S rDNA的序列測定和分析及生理生化試驗鑒定
枯草芽孢桿菌DNA提取采用常規(guī)酚法，用細菌通用引物擴增16S rDNA序列，引物序列為 27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和 1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)。PCR 反應體系(50 iiL)為10 X PCR 緩沖液 5 ii L、dNTP L、引物各 I yL、DNA 模板 2.5 uL, Takar a Taq酶 0. 25ii L、超純水 36 u L0 PCR 擴增程序為 94 °C 3min ；94 °C lmin,52°C I min，72 °C1.5 min，30個循環(huán)；72°C 10 min。擴增產物送上海生工生物科技有限公司進行測序。將測得的16S rDNA序列輸入GenBank，應用BLAST軟件進行同源性搜索。選取不同菌株的16S rDNA序列并與GenBank中已知的16S rDNA進行同源性比較。同源比較結果如下
將該PCR擴增產物在GenBank中進行blast比對結果表明，本發(fā)明的菌株MSB1201與其高度同源的50個菌種均是芽孢桿菌屬，其同源性均在98%以上，圖2為MSB1201的16SrDNA |W] Bacillus subtil is, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa,Acinetobacter baumannii, Acinetobacter sp，Alcaligenes faecalis, Bordetellahinzii，BaciIlus pumiIus，BaciIlus cereus, BaciIlus thuringiensis, LysinibadIlussp，Microbacterium resistens，Staphylococcus aureus 等 15 種細菌的 16S rDNA 聚類分析。本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌與subti I is同源性最高。表I所示為菌株MSB1201的16S rDNA同源性高的10個菌株。由此結合表2所示的菌株生理生化指標可推斷MSB1201菌株屬于枯草芽孢桿菌。表I 16S rDNA同源性比較
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌，其特征在于，保藏編號為CGMCC No. 6788。
2.一種保藏編號為CGMCC No. 6788的枯草芽孢桿菌在防治植物真菌病害的用途。
3.根據權利要求2的用途，其特征在于，所述植物真菌病害的真菌病原體為腐霉病菌(/yih·" )、鍵刀菌a )、核盤菌iSclerotinia)和灰霉病菌QBotrytisl
4.根據權利要求3的用途，其特征在于，所述植物真菌病害的真菌病原體為黃瓜腐霉病菌{Pythium、甜瓜鍵刀菌 ifusarium roseum )、油菜核盤菌{ScIerotinia scIerotiorum) iBotrytis cinerea )
5.一種微生物菌劑，其特征在于，將權利要求I所述的枯草芽孢桿 菌在PDA培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液溫度為27 V，天數為5天，轉速為200 rpm,然后過濾并調節(jié)菌液細胞數為IO9個/mL，即制得微生物菌劑。
6.一種生物肥，其特征在于，將權利要求I所述的枯草芽孢桿菌的孢子液與無機肥料、有機肥料相混合制得，三者的重量比為I :6 13 ;所述無機肥料選自氮肥、磷肥和鉀肥，所述氮肥為尿素或硫酸銨，所述磷肥為磷酸銨或磷酸鈣，所述鉀肥為硫酸鉀或氯化鉀；所述有機肥料為堆肥或沼氣肥。
7.—種生物肥，其特征在于，將權利要求I所述的枯草芽孢桿菌的孢子液與微肥、有機肥料相混合制得，三者的重量比為I :3 6 ;所述微肥選自碳酸錳鋅、硼鎂肥、鑰酸鈉、螯合態(tài)銅或磷酸銨鐵中的一種或多種；所述有機肥料為堆肥或沼氣肥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治植物真菌病害、促進植物生長的高效枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.6788。本發(fā)明涉及的枯草芽孢桿菌具有較高的抑制植物病原真菌生長的能力，且具有較高的遺傳穩(wěn)定性，不污染環(huán)境，生態(tài)安全，能夠廣泛應用到植物病原致病真菌，特別是腐霉病菌(Pythiumaphanidermatum)、鐮刀菌(Fusarium)、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)和灰霉病菌(Botrytiscinerea)的防治。該高效枯草芽孢桿菌單獨使用或與其它植物生長所需要的有機、無機營養(yǎng)成分一起使用,制備成生物復合肥料具有顯著的抗重茬，抗早衰，防治死苗爛根，色正果大，增加提高產量和改良品質量的作用。
文檔編號A01P3/00GK102965320SQ20121051131
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權日2012年12月4日
發(fā)明者趙斌, 董金皋, 趙巍 申請人:趙斌, 董金皋, 趙巍